STAT3短发夹RNA表达载体的构建及对SiHa细胞增殖和凋亡的作用

目的:探讨信号转导子与转录激活子3短发夹RNA(shRNA)真核表达载体对宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的作用.方法:根据siRNA设计原则, 结合pSilencer2.1-U6-neo质粒特点, 针对STAT3基因设计并合成两条寡聚DNA片段, 退火后克隆入pSilencer2.1-U6-neo质粒, 脂质体法将重组质粒转染人宫颈癌SiHa细胞.RT-PCR和Western blot检测SiHa细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达水平;MTT法和流式细胞术(FCM)检测细胞的增殖和凋亡.结果:成功构建了STAT3基因shRNA真核表达载体, 转染人宫颈癌SiHa细胞.细胞STAT3蛋白及mRNA表达下降;同时SiHa细胞增殖能力下降, 细胞凋亡增加.结论:构建的STAT3基因shRNA真核表达载体能够通过下调STAT3基因表达, 抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖能力, 诱导细胞凋亡.     

RNA干扰MAGEA3对人肝癌细胞凋亡的影响

目的:探讨小发夹RNA(shRNA)载体介导抑制人肝癌细胞中黑色素瘤相关抗原A3(MAGEA3) 的表达和对肝癌细胞凋亡的影响。 方法:构建pSilencer－MAGEA3短发夹状siRNA真核基因表达载体，采用脂质体介导的方法将其转染到人肝癌细胞(mel-ed1)中，用Western印迹法、RT-PCR检测MAGEA3基因在肝癌细胞中的表达；通过原位末端标记TUNEL法、DNA片段化及Annexin V /PI双标记法检测，观察其对肝癌细胞凋亡的影响。 结果:成功构建pSilencer－MAGEA3短发夹状siRNA真核基因表达载体，转染特异性小发夹RNA质粒表达载体的MEL-ED1细胞中MAGEA3基因表达显著抑制(90%)。与对照组比较, pSilencer-MAGEA3转染组肝癌细胞培养 48 h 后,DNA片段化检测出“DNA ladder”、TUNEL法显示细胞典型凋亡特征, Annexin V /PI双标检测转染组细胞凋亡率为21.41%±1.98%,明显高于pSilencer-neo 空载体转染组和未转染组(P<0.01)。 结论:MAGEA3小发夹RNA质粒载体可显著抑制MEL-ED1细胞中的MAGEA3基因的表达,促进肝癌细胞的凋亡, MAGEA3基因具有抑制凋亡的作用。该研究为应用RNAi进行肿瘤的基因治疗提供了实验依据。     

人类端粒酶逆转录酶基因转染对足叶乙甙诱导Raji细胞凋亡的影响

探讨人类端粒酶逆转录酶 (hTERT)基因转入Raji细胞后足叶乙甙 (VP 16 )对细胞凋亡的影响。采用脂质体介导的转染方法将重组的hTERT基因转入Raji细胞 ,G4 18筛选 ;采用间接免疫荧光标记法及端粒酶聚合酶链反应 酶联免疫测定法检测hTERT蛋白表达水平和端粒酶活性的变化 ;姬姆萨染色及流式细胞仪观测细胞凋亡。结果发现 :转染hTERT入Raji细胞后 ,其表达hTERT的蛋白及端粒酶活性显著增加 (P <0.0 5 )。 10 μmol/LVP 16作用转染hTERT的Raji细胞 4 8h、72h对细胞生长抑制作用不如转染空载体组及未转染组明显 (P <0 .0 5 )。 10 μmol/LVP 16作用转染hTERT的Raji细胞 72h ,光镜下仅可见到很少量的细胞出现凋亡 ,流式细胞仪测定的细胞凋亡率 (4.34±1.0 3) %显著降低 ,分别与转染空载体组 (33.2 1± 3.12 ) %及未转染组 (31.6 3± 3.0 6 ) %比较 ,P <0.0 5。表明端粒酶活性过表达可使Raji细胞对VP 16产生抗凋亡作用     

应用RNAi技术沉默STAT3基因对乳腺癌MCF-7细胞的影响

目的 探讨应用RNAi技术沉默信号转导子与转录活化子3（STAT3）基因对乳腺癌MCF-7细胞的影响。方法 应用RNAi技术，以psilencer1．0-U6-STAT3-siRNA重组质粒体外转染MCF-7细胞，采用MIT实验、流式细胞仪检测MCF-7转染前后细胞增殖、细胞周期和早期凋亡的变化，通过Western blotting及半定量RT-PCR检测STAT3基因不同水平的表达。结果 MTT实验、流式细胞仪的结果显示，重组质粒转染组的MCF-7细胞的增殖明显受到抑制，且出现凋亡现象；Western blotting及半定量RT-PCR结果显示，重组质粒转染组细胞的STAT3基因表达在蛋白及RNA水平上都显著低于对照组（P〈0．01），而空白对照组及空质粒组无明显差异（P〉0．05）。结论 应用RNAi技术沉默STAT3基因可以降低乳腺癌MCF-7细胞STAT3的表达，进而抑制细胞的生长、增殖及诱导细胞的凋亡。     

CCAAT增强子结合蛋白α对急性粒细胞白血病HL60细胞分化和凋亡的影响

目的 探讨CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)在体内和体外对急性粒细胞白血病HL60细胞分化和凋亡的影响及其可能机制.方法 将C/EBPα表达质粒pEGFP-C/EBPα经阳离子脂质体介导转染HL60细胞,用G418筛选出C/EBPα稳定表达细胞株为转染组;以转染pEGFP空载质粒HL60细胞为空载体组;未处理的HL60细胞为对照组.瑞氏染色观察细胞形态学变化;噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖抑制率;流式细胞术分析凋亡;RT-PCR及免疫印迹法(Western blot)检测c-myc基因的表达.20只BALB/c裸鼠按完全随机法分为3组:转染组7只、空载体组7只、对照组6只.将3组细胞分别皮下注射相应各组小鼠形成皮下瘤,20 d后处死小鼠,测量肿瘤质量及大小,TUNEL法检测皮下瘤组织细胞凋亡率.结果 筛选到C/EBPα基因稳定表达的细胞株pEGFP-C/EBPα-HL60,细胞出现明显分化.对照组、空载体组和转染组细胞的凋亡率分别为(5.4±1.4)%、(5.0±1.3)%、(21.9±4.5)%,转染组细胞的凋亡率显著高于对照组和空载体组(均P＜0.05).RT-PCR及免疫印迹显示C/EBPα明显抑制c-myc mRNA和蛋白的表达(均P＜0.05).对照组、空载体组和转染组细胞接种小鼠形成皮下瘤,其质量分别为(5.35±1.12)g、(5.12±1.31)g和(3.26±0.72)g,瘤体大小分别为(25±4)mm、(18±3)mm和(11±2)mm,转染组瘤体质量及瘤体大小明显低于对照组和空载体组(均P＜0.05).与对照组和空载体组比较,转染组皮下瘤组织细胞凋亡率明显增加(均P＜0.05).结论 C/EBPα在HL60细胞中具有促进细胞凋亡和抑制细胞增殖的能力,显示C/EBPα在急性粒细胞白血病中是一种肿瘤抑制因子.     

EB病毒潜伏膜蛋白1对鼻咽癌细胞P53蛋白表达的影响

目的:研究EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)对鼻咽癌细胞P53蛋白表达的影响。方法:将LMP1基因真核表达质粒转染至鼻咽癌CNE1细胞,脂质体介导端粒酶反义核酸处理转染细胞,MTT法检测细胞增殖能力,免疫组化法检测LMP1和P53蛋白表达,原位杂交技术检测端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达。 结果:对照组,转染并表达LMP1基因的细胞的增殖能力、P53蛋白和hTERT mRNA表达水平均显著高于未转染细胞和转染空载质粒的细胞。端粒酶反义核酸作用组,LMP1基因转染细胞的LMP1蛋白表达水平显著低于对照组(P＜0.01);LMP1基因转染细胞与未转染细胞和转染空载质粒的细胞的增殖能力、P53蛋白和hTERT mRNA表达水平均显著低于对照组(P＜0.01),但LMP1基因转染细胞的增殖能力和P53蛋白表达水平仍显著高于未转染细胞和转染空载质粒的细胞(P＜0.01)。 结论:EB病毒LMP1可促进鼻咽癌细胞P53蛋白的表达。     

人类端粒酶逆转录酶基因反义核酸促进顺铂诱导HL-60细胞凋亡

目的:利用人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的反义寡核苷酸(ASODN)抑制HL-60细胞的端粒酶活性后,探讨顺铂对HL-60细胞凋亡的影响。方法:采用聚合酶链反应-酶联免疫测定(PCR-ELISA)方法检测人工合成的反义核酸处理HL-60细胞前后端粒酶活性的改变;免疫荧光标记通过流式细胞仪检测hTERT蛋白表达水平;用DNA电泳及流式细胞仪计数检测细胞凋亡。结果:hTERT基因的ASODN作用于HL-60细胞后,细胞的hTERT蛋白表达及端粒酶活性表现不断降低;抑制HL-60细胞端粒酶活性后,顺铂可诱导HL-60细胞产生明显的DNA断片;ASODN与顺铂联合作用于HL-60细胞后的凋亡细胞百分率(38.62±3.45)%分别同正义寡核苷酸(SODN)与顺铂联合作用组(11.02±2.07)%、单用顺铂作用组(9.23±1.70)%进行比较有显著差异(P＜0.01)。结论:hTERT基因的ASODN能促进顺铂诱导HL-60细胞凋亡。     

RNA干扰人端粒酶逆转录酶基因抑制Hep-2细胞生长增殖的实验研究

目的探讨RNA干扰人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因对Hep-2细胞生长增殖的抑制作用及诱导凋亡作用。方法根据hTERTcDNA序列构建表达hTERTmRNA特异的、含荧光素基因的shRNA真核表达质粒pshRNA1、pshRNA2。随机选取一段与人类基因无同源性的碱基序列构建表达shRNA的含荧光素基因的质粒pshRNA3。构建不表达shRNA的含荧光素基因的对照质粒pshRNA4。实验分为5组:A(pshRNA1)、B(pshRNA2)、C(pshRNA3)、D(pshRNA4)、E(空白培养液)。酶切后电泳分析鉴定质粒pshRNA1~3。采用共聚焦显微镜检测质粒转染后细胞荧光表达情况;以蛋白印迹法研究hTERT表达变化;以TRAP-PCR ELISA法研究端粒酶活性变化;以四甲基偶氮唑盐(MTT)法、倒置相差显微镜及原位细胞凋亡法观察各质粒抑制细胞增殖及诱导凋亡作用。结果(1)质粒pshRNA1~3SalⅠ酶切后电泳见400bp小带,与预期插入的目的基因大小一致。共聚焦显微镜下见大量的细胞表达绿色荧光。(2)pshRNA1、2转染细胞后hTERT表达显著降低;细胞端粒酶活性明显受到抑制,A组细胞活性为:0·159±0·039、B组细胞活性为0·163±0·028、E组细胞活性为1·512±0·076。A、B组与E组比较,差异均有统计学意义(P<0·01)。(3)与E组细胞吸光度(A)值比较,A、B组细胞各时间点均减小,P值均小于0·01。同等培养条件下,A、B组脱落瓶壁的死亡细胞显著增多,凋亡率明显升高。结论(1)靶向hTERTmRNA的shRNA真核表达质粒能有效转染Hep-2细胞;(2)RNA干扰hTERT能显著地抑制Hep-2细胞的生长增殖并诱导细胞凋亡。     

RNAi沉默Survivin与ER-α36基因对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖与凋亡的影响

目的：靶向沉默人乳腺癌细胞Survivin与雌激素受体-α(ER-α) 36双基因的表达,探讨其对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖与凋亡的影响。方法：采用生物信息学技术设计并构建RNAi片段（siRNA-ER-α36）,转染乳腺癌MDA-MB-231细胞株。采用噻唑蓝染色法检测细胞增殖情况。采用RT-PCR、Western blot方法检测细胞中Survivin、ER-α36与凋亡蛋白Caspase-3的mRNA及蛋白表达情况;流式细胞术检测转染细胞凋亡率。结果：RNAi片段成功转染MDA-MB-231细胞,24 h转染率的平均值为68%,48 h转染效率可达76%(P<0.01)。与空白对照组比较,RNAi片段转染后MDA-MB-231细胞Survivin和ER-α36基因的mRNA和蛋白含量明显下降（P<0.05）,而上调Caspase-3凋亡蛋白的表达;MDA-MB-231细胞增殖能力降低（P<0.05）,凋亡率升高（P<0.05）。结论：RNAi靶向沉默并下调Survivin与ER-α36基因的表达,上调Caspase-3凋亡蛋白的表达,从而抑制乳腺癌...     

WT1异构体比例转变对人白血病细胞株HL-60增殖和凋亡的影响

 目的： 探讨WT1异构体比例改变对人白血病细胞株HL-60增殖和凋亡的影响。方法： 逆转录获得人WT1(17AA－/KTS－)异构体全长cDNA序列,连接到PCDH1-MCS1-EF1-copGFP慢病毒质粒载体上, 酶切和测序证实正确构建重组质粒,建立WT1异构体表达比例改变的单克隆细胞株。MTT法检测细胞增殖活性,形态学观察及Annexin V 检测细胞凋亡。结果： 成功构建了真核表达载体PCDH1-MCS1-EF1-copGFP-WT1(17AA－/KTS－),转染HL-60细胞后,实时荧光定量RT-PCR和Western blotting 显示重组质粒转染细胞中WT1(17AA－/KTS－) mRNA和蛋白水平明显高于空质粒转染组和正常对照组。重组质粒转染细胞的生长抑制率高于空质粒转染组和正常对照组, 差异显著(P<0.05)。加2 μmol/L 三氧化二砷（As2O3）培养48 h后, 形态学观察发现3组细胞都出现了凋亡形态, 但重组质粒转染细胞更为明显。流式细胞术结果显示,As2O3作用24 h后,重组质粒转染细胞凋亡率较空质粒转染组和正常对照组细胞升高,差异显著(P<0.05)。结论： 增加外源性WT1(17AA－/KTS－)异构体的表达能抑制HL-60细胞增殖,促进As2O3 诱导的细胞凋亡。     

MMP-9-siRNA对乳腺癌细胞中MMP-9表达的影响

目的:探讨MMP-9小分子干扰RNA(MMP-9-siRNA)对乳腺癌MDA-MB-231细胞中MMP-9表达的影响.方法:化学合成针对MMP-9的小分子干扰RNA(MMP-9-siRNA),并将其转染到乳腺癌MDA-MB-231细胞.本实验分为空白组(不转染任何siRNA)、对照组(转染Control-siRNA 50 nmol/L)和实验组(又分为3个亚组,分别转染10、50、100 nmol/L MMP-9-siRNA)3组.应用RT-PCR法及Western blot法分别在mRNA水平及蛋白水平检测并比较空白组、对照组和实验组中MMP-9表达及其差异.结果:RT-PCR结果显示,对照组MMP-9 mRNA表达率为99.2%±4.9%,与空白组比较差异无统计学意义(P＞0.05);实验组10、50、100 nmol/L MMP-9-siRNA 3个亚组MDA-MB-231细胞MMP-9 mRNA表达率分别为80.3%±5.0%、65.2%±4.5%、55.9%±5.1%,与空白组比较差异有统计学意义(P＜0.05).Western blot结果显示,对照组蛋白表达率为101.7%±3.1%,与空白组比较差异无统计学意义(P＞0.05);实验组 10、50、100 nmol/L MMP-9-siRNA 3个亚组MDA-MB-231细胞MMP-9蛋白质表达率分别为77.6%±3.9%、62.7%±4.1%、55.0%±4.8%,与空白组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:构建的MMP-9-siRNA能够抑制MDA-MB-231细胞中MMP-9的表达,为基因水平治疗乳腺癌提供实验依据.     

阳离子脂质体介导TIMP-3基因对兔血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响

目的：通过阳离子脂质体介导含有TIMP-3基因的质粒转染体外兔平滑肌细胞，观察瞬时表达的TIMP-3对细胞增殖及凋亡的影响。方法：构建兔TIMP-3基因质粒表达载体。按照正常对照组、空质粒组、重组质粒载体组将72孔兔血管平滑肌细胞分为3组，每组又分为24、48、72h 3个亚组。阳离子脂质体介导质粒分别转染相应组细胞，正常对照组无质粒加入。转染后进行细胞计数，描绘生长曲线；将24孔细胞分为3组进行基因转染，转染后48h检测细胞凋亡率。结果：正常对照组细胞数、细胞凋亡率与空质粒组相比均无明显差别；重组质粒组细胞数与前二者相比明显减少（P〈0．05），重组质粒组细胞凋亡率均明显高于前二者（P〈0．05）。结论：TIMP-3对体外血管平滑肌细胞具有明显抑制增值及促进细胞凋亡的作用；阳离子脂质体作为新型、高效转染介质对细胞生长无明显不良反应，使用安全，应用于TIMP-3基因治疗支架后再狭窄前景广阔。     

小干扰RNA下调白血病细胞X连锁凋亡抑制蛋白的表达及其对化疗药物敏感性的影响

目的 探讨小干扰RNA(siRNA)下调白血病MOLT-4、HL-60、K562细胞的白血病细胞X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)的表达对化疗药物敏感性的影响.方法 采用实时荧光定量PCR和Western免疫印迹检测MOLT-4、HL-60、K562细胞及健康人外周血单个核细胞(PBMC)XIAP mRNA和XIAP蛋白表达水平.用NucleofectorTM核酸转染仪对高表达XIAP的K562细胞转染XIAP siRNA(实验组),同时以转染无同源性siRNA作阴性对照组,未转染任何siRNA的K562细胞作空白对照组,并检测3组细胞XIAP mRNA和XIAP蛋白表达水平.同时将实验组、阴性及空白对照组细胞暴露于不同浓度的依托泊苷(vp-16,0.01、0.1、1、10、100mg/L)及阿糖胞苷(Ara-c,0.1、1、10、100、1000、10 000mg/L),用CCK-8法检测细胞抑制率变化.结果 与健康人PBMC比较,MOLT-4、HL-60、K562细胞XIAPmRNA及蛋白表达均增高(均P＜0.05),其中K562细胞XIAPmRNA及蛋白表达水平最高,与MOLT-4、HL-60细胞比较差异有统计学意义(均P＜0.05).K562细胞转染XIAP siRNA48 h后,与阴性对照组、空白对照组比较,实验组细胞XIAP mRNA及蛋白表达水平均明显下降(mRNA:0.37±0.10比1.41±0.13比1.00±0.12,蛋白:0.37±0.03比0.99±0.08比0.98±0.07,均P＜0.05).在给予1 mg/L vp-16、10及100 mg/L的Ara-c后,实验组细胞抑制率与阴性对照组、空白对照组比较,差异有统计学意义(均P＜0.05);在给予其他浓度vp-16和Ara-c后,3组细胞抑制率差异均无统计学意义(均P＞0.05).结论 XIAP siRNA能特异性下调K562细胞XIAPmRNA和蛋白质水平的表达,增强K562细胞对化疗药物依托泊苷、阿糖胞苷的敏感性.     

siRNA特异性沉默hTERT基因对人结肠癌LoVo细胞生物学行为的影响

目的:探讨靶向端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的siRNA抑制人结肠癌LoVo细胞生物学行为的影响和机制。方法:构建针对hTERT基因的siRNA(pU6-hTERT-siRNA),LipofectamineTM2000转染LoVo细胞,以同源性的pU6作阴性对照,以未转染的细胞作空白对照。MTT法检测细胞生长率。建立裸鼠结肠癌皮下移植瘤模型,瘤内注射法将pU6-hTERT-siRNAs、pU6转导,观察各组移植瘤生长情况。RT-PCR和荧光定量PCR检测细胞株和移植瘤细胞hTERTmRNA水平的变化。Western blotting检测hTERT蛋白水平的变化。结果:LoVo细胞转染pU6-hTERT-siRNA72 h后,细胞增殖抑制率达42.1%,显著高于阴性对照组(3.2%),P0.01。裸鼠皮下移植瘤转染pU6-hTERT-siRNA14 d后,种植瘤体积为(85.9±18.7)mm3,显著小于阴性对照组[(157.4±55.6)mm3]和空白对照组[(155.2±54.2)mm3],P0.01。荧光定量PCR和Western blotting结果显示转染pU6-hTERT-siRNA后,细胞株和移植瘤内的hTERT mRNA以及细胞株蛋白水平表达显著减少(P0.01),阴性对照和空白对照间无显著差异。结论:pU6-hTERT-siRNA在体内外能有效抑制结肠癌LoVo细胞中hTERT基因表达,对裸鼠皮下结肠癌细胞移植瘤有明显的抑制生长作用。     

C-erbB2基因shRNA表达质粒对结肠癌细胞生物学行为的影响

目的:观察C-erbB2基因shRNA表达质粒对结肠癌HT-29细胞生长抑制、细胞周期和凋亡的影响。方法:用MTT法及流式细胞仪分别检测pGenesil-erbB2实验组(PEG)、转染试剂对照组(TRCG)、阴性质粒对照组(NPCG)细胞对结肠癌细胞生长曲线、细胞周期及细胞凋亡率的影响。结果:pGenesil-erbB2实验组、转染试剂对照组、阴性质粒对照组的生长抑制率分别为39.65%、7.23%、8.05%,实验组明显高于其他两组(P<0.01);pGenesil-erbB2实验组、转染试剂对照组、阴性质粒对照组的G0/G1期细胞分别占74.93%、67.19%、68.05%,实验组明显高于其他两组(P<0.05);S期细胞分别占7.81%、14.02%、13.70%,实验组明显低于其他两组(P<0.05);pGenesil-erbB2实验组、转染试剂对照组、阴性质粒对照组的凋亡率分别为19.21%、3.13%、4.08%,实验组明显高于其他两组(P<0.01)。结论:C-erbB2基因siRNA重组质粒可以明显抑制结肠癌细胞的生长;可以将细胞周期阻滞于G0/G1期;可以明显增加结肠癌细胞的发生凋亡;说明C-erbB2基因在结肠癌的发生和发展中也起到非常重要的作用。     

hp450RAI质粒转染对视黄酸诱导的HL—60细胞凋亡的影响

目的探讨细胞内细胞色素氧化酶 p45 0 (CYP)表达、视黄酸 (RA)代谢与细胞凋亡的相互关系。方法采用脂质体介导的质粒转染和逆转录 - PCR等实验技术方法做有关分析检测。结果野生型 HL- 6 0细胞 hp45 0 RAI表达微弱 ,脂质体介导的 hp45 0 RAI质粒转染可使 HL- 6 0细胞稳定表达 hp45 0 RAI;hp45 0 RAI转染对 ATRA诱导的 HL- 6 0细胞增殖能力无明显影响 ;野生型 HL- 6 0细胞有较强 Bcl- 2表达 ,ATRA处理抑制未转染细胞 Bcl- 2表达 ,但单纯 hp45 0 RAI转染、hp45 0 RAI转染 CYP抑制剂或加用 IFN- α均能增强 Bcl- 2表达 ,其中以加用 ketoconazole作用更为显著。结论 RA敏感 HL- 6 0细胞中影响 RA代谢的主要 CYP并非 hp45 0 RAI,hp45 0 RAI转染能增强 Bcl- 2表达 ,但对 HL - 6 0细胞增殖能力无明显影响 ,CYP抑制剂、IFN-α可能通过抑制细胞内 RA代谢 ,而增加 HL - 6 0细胞Βcl- 2表达。     

RNA干扰同源盒A10表达对K562细胞增殖及凋亡的影响

目的 通过构建靶向同源盒A10(HOXA10)的真核表达载体,探讨利用RNA干扰沉默HOXA10基因对人慢性髓系白血病细胞株K562增殖和凋亡的影响.方法 根据筛选的针对HOXA10的特异性有效小干扰RNA(siRNA)序列设计合成短发夹RNA(shRNA)寡核苷酸链,构建pGPHI-GFP-Neo-HOXA10真核表达载体并测序,应用阳离子脂质体转染K562细胞.实验分为细胞对照组(仅加等量细胞及培养基),阴性对照组(脂质体转染阴性对照质粒)、实验组(脂质体转染pGPHI-GFP-Neo-HOXA10).转染载体24 h后利用RT-PCR检测各组HOXA10 mRNA表达;转染载体24、48、72 h后应用MTT法检测各组细胞增殖并计算细胞抑制率;转染载体48 h后应用流式细胞术检测各组细胞凋亡.结果 成功构建pGPHI-GFP-Neo-HOXA10载体并转染K562细胞.与细胞对照组和阴性对照组比较,实验组转染载体能有效降低HOXA10 mRNA的表达水平[(38.86±4.49)％比(88.52±9.24)％、(86.75±7.38)％,P＜0.05],而阴性对照组与细胞对照组比较差异则无统计学意义(P＞0.05).与阴性对照组比较,实验组载体作用于K562细胞24、48、72 h后,细胞增殖能力均明显下降,细胞抑制率明显升高[(39.92±0.74)％比(7.98±5.52)％;(55.62±1.18)％比(8.27±3.45)％;(66.30±1.26)％比(8.63±3.58)％;均P＜0.05].实验组细胞凋亡率较细胞对照组、阴性对照组也显著升高[(22.29±1.67)％比(9.82±0.69)％、(10.14±0.96)％,P＜0.05],而阴性对照组与细胞对照组比较差异则没有统计学意义(P＞0.05).结论 构建的真核表达载体pGPHI-GFP-Neo-HOXA10可有效沉默K562细胞中HOXA10基因的表达,能明显抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡.     

转酮酶样蛋白1在人类鼻咽癌细胞生长增殖中的作用

目的:探讨转酮酶样蛋白1(TKTL1)在体外培养的人类鼻咽癌细胞生长增殖中的作用.方法:构建针对TKTL1 mRNA 的干扰RNA质粒,转染人类鼻咽癌细胞(CNE细胞系);检测转染前后CNE细胞中转酮酶活性的变化;实时定量RT-PCR检测转染前后CNE细胞转酮酶基因家族(TKT、TKTL1、TKTL2)mRNA表达水平的变化;通过流式细胞术和MTT实验检测转染前后CNE细胞增殖和细胞周期的改变.结果:实验组CNE细胞中转酮酶活性(携带有pEGFP-C1-U6/TKTL1)明显低于质粒对照组(携带有pEGFP-C1-U6/UC)和空白对照组(未转染细胞);实时定量RT-PCR结果显示转染前后CNE细胞中TKT和TKTL2 mRNA的表达水平均无显著差异.然而,实验组细胞中TKTL1的表达水平明显低于对照组,且实验组CNE细胞增殖明显被抑制,癌细胞被阻滞在G0/G1期.结论:转酮酶蛋白TKTL1在人类鼻咽癌细胞的生长增殖中起重要作用,TKTL1可能成为肿瘤治疗研究的新靶点.     

针对AKT2的小分子干扰RNA抑制胶质瘤细胞的增殖

目的比较靶向性丝/苏氨酸激酶2(AKT2)不同的小分子干扰RNA构建体对脑胶质瘤细胞增殖的抑制作用.方法选择大鼠AKT2的3个siRNA靶序列构建靶向AKT2的siRNA表达质粒,进行对C6细胞的AKT2表达及增殖抑制的研究,蛋白印迹检测AKT2的表达水平,TUNEL法分析细胞凋亡,流式细胞术分析细胞周期变化,3H-TdR掺入法分析细胞增殖.结果转染siRNA表达质粒组AKT2表达下调72%、88%和91%.各转染组的凋亡率明显增加(x2=34.218,P＜0.001),转染后S期指数较对照细胞明显减少,转染组细胞自第2天起存活率均明显下降(P＜0.01),且各个转染组之间存活率也有极显著性差异(P＜0.01),以尾部调节结构域转染组最显著.结论靶向AKT2的siRNA表达质粒可以特异性地抑制AKT2的表达,显著抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡.     

沉默激酶功能区受体抑制前列腺癌PC-3细胞的裸鼠体内成瘤能力

目的 研究激酶功能区受体(KDR)基因表达沉默后对前列腺癌PC-3细胞裸鼠体内成瘤能力的影响.方法 将15只5周龄BALB/c雄性裸鼠随机分为干扰组、阴性质粒组和未转染组,每组5只.分别接种构建的pSilencer 3.1-KDR siRNA表达质粒转染PC-3细胞、阴性对照质粒pSilencer3.1-NC转染PC-3细胞以及未转染的PC-3细胞于裸鼠皮下;观察各组PC-3细胞在裸鼠体内成瘤率、瘤体生长速度以及平均瘤质量等方面的变化,RT-PCR和Western blot技术检测瘤体KDR基因和蛋白表达.结果 pSilencer3.1KDR质粒转染组的裸鼠瘤体生长速度明显慢于未转染组和pSilencer3.1-NC质粒转染组;与未转染组和PSilencer3.1-NC组相比,pSilencer3.1-KDR组肿瘤的生长受到明显抑制,平均体积较小(0.28 cm3 vs 0.721 cm3,0.715 cm3,P＜0.01),平均瘤质量较轻(0.14g vs 0.648g,0.635g,P＜0.01);裸鼠肿瘤组织中KDR mRNA和蛋白的表达明显降低.结论 RNAi介导的KDR基因沉默可显著影响PC-3细胞裸鼠体内的瘤体生长速度,KDR有可能成为肿瘤治疗的新靶点.