人巨细胞病毒对细胞周期调控靶点-p53的影响

目的:了解HCMV对细胞周期调控靶点p53的影响。方法:建立体外HCMV感染HEL模型，用倒置显微镜观察不同时间下各组HEL的病变效应和用S—P免组化法检测p53蛋白的表达并以FQ—PCR法检测HEL细胞内HCMVDNA拷贝数。结果:(1)HCMV感染使HEL细胞发生病变，细胞内HCMVDNA拷贝数随时间的延长逐渐增加。(2)S—P免疫组化结果提示HCMV感染使HEL细胞p53蛋白的水平升高。结论:HCMV的感染改变了细胞内p53的水平，可能影响其在细胞周期中的正常功能，营造可能有利于病毒复制的环境。     

卡波济肉瘤相关疱疹病毒体外感染人牙龈成纤维细胞初探

目的:探索卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)体外感染人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblast,HGF)的途径和方法,为研究KSHV导致口腔卡波济肉瘤病变的机制提供依据。方法:用12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate,TPA)刺激人原发性渗出性淋巴瘤(primary effusion lymphoma,PEL)细胞系的BC-3细胞,收集细胞上清(含KSHV病毒颗粒),感染HGF细胞。观察细胞病变效应(cytopatric effect,CPE),采用RT-PCR和Western blot分别检测HGF细胞内KSHV编码基因的转录情况和蛋白表达水平。结果:KSHV感染HGF细胞后可出现CPE;感染后采用RT-PCR可检测到不同时间点ORF26和ORF73基因的转录;感染后12 h可检测到vIL-6蛋白的表达。结论:KSHV可感染HGF细胞并建立潜伏感染,为进一步研究KSHV导致的口腔KS发病机制提供了较好的体外模型。     

HCMV体外感染小鼠胚胎成纤维细胞的研究

目的 观察人巨细胞病毒(HCMV)AD169株体外感染小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的生物学特征,为探讨HCMV AD169株能跨种属感染MEF提供依据.方法 将100 TCID50 HCMV AD169株病毒悬液接种至MEF和人胚胎成纤维细胞(HF)上,逐日观察HCMV特征性细胞病变效应(CPE);分别收集感染后1、3、5 d 的MEF和HF培养物,提取细胞DNA,采用实时荧光定量PCR检测HCMV立即早期基因(IE)拷贝数变化;分别采用HCMV立即早期基因(IE-1)、主要衣壳蛋白(MCP)和包膜糖蛋白(gB)单克隆抗体进行间接免疫荧光实验检测感染后的1、3、5 d MEF和HF中相应病毒蛋白的表达.结果 观察到HCMV AD169株接种MEF出现病毒所致CPE,与HF出现的CPE相似;实时荧光定量PCR检测HCMV IE基因拷贝数发现,MEF在HCMV AD169感染后的1、3、5 d,病毒基因拷贝数呈增长趋势,但均低于相同时间点的HF中病毒拷贝数;间接免疫荧光检测HCMV感染MEF和HF后1、3、5 d HCMV IE-1、MCP和gB蛋白表达情况时发现,在MEF上HCMV IE-1、MCP和gB蛋白表达随时间延长呈增强趋势.结论 HCMV AD169株可以体外感染MEF,并在其中复制增殖.     

体外人巨细胞病毒感染细胞细胞周期素表达改变与细胞病变的关系

目的探讨人巨细胞病毒( human cytomegalovirus, HCMV)感染的人胚肺成纤维上皮细胞( human embryo lung fibroblast, HEL)细胞周期素 E (cyclin E)、 D (cyclin D)、 A (cyclin A)、 B (cyclin B)表达的改变与细胞病变的关系.方法建立体外 HCMV感染细胞膜型,观察感染细胞感染 12、 48h后细胞病变( cytopathologic effects, CPE);并在相同时间点收获细胞,用乙醇固定 HCMV感染的宿主细胞后用 PI染色,经流式细胞术( FACSVantage)根据细胞 DNA倍性分选出 G1、 S、 G2/M期细胞,然后分别取等量细胞裂解, 用 Western blot分析上面各不同时相细胞中 cyclins的表达.结果 ①培养 12h,仅病毒感染组在电镜可观察到细胞肿胀,其余各组未见明显病变;②培养 48h,与 HCMV169感染组相比,药物干预 HCMV169感染 HEL两组细胞中,光镜及电镜 CPE程度较轻,正常组细胞无 CPE;③乙醇固定细胞经流式细胞术分选,感染 12、 48h细胞均以 G1为主,少见 S期细胞、未见 G2期和 M期的细胞,与正常对照组比较有显著差异( P< 0.05);根据细胞 DNA倍性分选出的各期细胞裂解行 Western blot检测,正常细胞未检测到 cyclins,感染细胞中 cyclin E、 cyclin D有明显表达,未见 cyclin A、 cyclin B的表达.④ Western blot对分选后的感染细胞中 cyclin E、 cyclin D表达的检测与流式细胞术分析的结果一致.结论体外 HCMV感染细胞细胞周期进程受阻与细胞病变关系密切,细胞周期进程异常可能是导致细胞病变的病理学基础.     

HCMV活动性感染与尿路上皮癌的相关性研究

目的分离和鉴定尿路上皮癌患者的肿瘤组织和抗凝血标本中人巨细胞病毒(HCMV),结合临床资料分析比较HCMV活动性感染与尿路上皮癌发生发展及其复发的相关性。方法采集33例经病理检测确诊为尿路上皮癌患者的组织和血标本,进行如下处理:分别采用细胞培养病毒分离法进行病毒分离;PCR法检测患者的抗凝血及组织DNA标本中HCMV UL55和UL83基因;IFA法检测抗凝血标本中HCMV pp65抗原;ELISA法检测HCMV IgG及IgM抗体;记录分析结果,确定尿路上皮癌患者HCMV活动性感染率。结果在33份抗凝血标本中,分离到1株临床分离株,该标本经盲传3代出现典型HCMV特征性细胞病变效应(CPE),经鉴定为HCMV。HCMV UL55和UL83基因、HCMV pp65抗原血症及HCMV IgM抗体检测均为阳性的有6份,因此可以判定在33例尿路上皮癌患者中,HCMV活动性感染者有6例,活动性感染率为18.2%(6/33)。结合患者的临床资料进一步分析发现,尿路上皮癌患者复发及病理分级均与HC-MV活动性感染相关,且HCMV活动性感染者其病理分级程度升高。结论结合临床资料分析发现,尿路上皮癌复发及病理分级程度升高均与HCMV活动性感染有关。     

3种方法检测HCMV先天性感染对老年小鼠大脑皮质细胞凋亡的比较

目的分析TdT介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)、流式细胞术和透射电镜3种细胞凋亡检测方法的优缺点。方法在已建立的HCMV先天性感染小鼠中枢神经系统模型基础上,选用鼠龄为24个月模型鼠进行试验。试验分为3组(每组6只)HCMV先天性潜伏感染老年小鼠组(A组)、HCMV先天性潜伏再激活感染老年小鼠组(B组)和正常对照老年小鼠组(C组)。采用TUNEL法和流式细胞仪检测各组小鼠大脑皮质细胞凋亡情况,采用透射电镜观察凋亡细胞的超微结构变化。结果TUNEL法和流式细胞术检测发现C组凋亡细胞最少,A组凋亡细胞比率较C组有所升高,而B组凋亡细胞最多;检测结果经T检验分析发现A组、B组与C组各组间凋亡率差异均有显著性。透射电镜检测发现,同C组比较,A组和B组部分神经元细胞核染色体固缩,核物质碎片化,凋亡小体形成等特征性凋亡改变。结论HCMV先天性感染可致老年小鼠大脑皮质细胞凋亡。TUNEL法和流式细胞术可用于凋亡的定量检测,但TUNEL法易受主观因素的影响,而透射电镜是凋亡定性检测的可靠方法。     

人巨细胞病毒感染老龄小鼠的外周血T细胞亚群检测与分析

目的 在人巨细胞病毒(HCMV) 感染的BALB/c小鼠模型基础上,研究小鼠细胞免疫应答状态.方法 建立先天性潜伏感染的老龄小鼠(平均月龄≥18个月)模型,分别为HCMV先天性潜伏感染组(A)、先天性潜伏感染再激活组(B)及正常对照组(C),每组小鼠数均为6只.分别取各组小鼠外周血白细胞进行病毒分离、PCR和RT-PCR检测HCMV UL83基因DNA和相应mRNA来验证模型小鼠感染状态.采用流式细胞术对小鼠外周血T细胞亚群进行检测.结果 A组和B组小鼠病毒分离出HCMV,C组为阴性.A组小鼠可以用PCR检测出HCMV UL83 DNA,但RT-PCR检测不出相应的mRNA;B组小鼠用PCR、RT-PCR均可检测出相应产物;而C组均为阴性.A、B、C三组小鼠外周血中CD3+细胞构成比值分别为0.3305、0.0658和0.4318,组间差异有显著性(P<0.01);A、B、C三组中CD4+细胞的构成比值依次为0.6608、0.5998、0.6578,B组与A组及C组差异均有显著性(P<0.01),而在A组和C组间差异无显著意义(P>0.05);CD8+细胞比在A、B、C三组中的构成比值依次为0.2327、0.1150、0.1862,组间差异均有显著性(P<0.01);CD4+CD8+细胞在A、B、C三组中的比值依次为0.0990、0.1682、0.1192,组间差异有显著性(P<0.05).结论 HCMV先天性潜伏感染及 HCMV先天性潜伏感染再激活均可使老龄小鼠的细胞免疫功能降低,尤以后者显著.表明HCMV对先天性潜伏感染再激活老龄小鼠的细胞免疫状态有明显的抑制作用.     

SAT法检测人巨细胞病毒pp67 mRNA在人类免疫缺陷病毒合并人巨细胞病毒感染患者临床诊疗中的价值探讨

目的 探讨实时荧光核酸恒温扩增检测技术(simultaneous amplification and testing,SAT)检测人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)基质表层蛋白pp67(phosphoprotein67, pp67) mRNA在人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)合并HCMV感染患者临床诊疗中的价值。方法 利用SAT技术构建检测HCMV pp67 mRNA的方法,评估SAT法检测HCMV pp67 mRNA重复性、特异性以及检测下限;收集HIV阳性HCMV活动性感染患者69例、HIV阳性HCMV非活动性/潜伏感染154例、HIV阴性HCMV非活动性/潜伏感染 79例患者的血清、肺泡灌洗液、脑脊液等样本进行HCMV pp67 mRNA检测,评估特异度、灵敏度、正确率、阴性预测值、阳性预测值以及约登指数,评估HCMV pp67 mRNA在辨别HCMV活动性感染中的临床价值。结果 SAT法检测HCMV pp67 mRNA的精密度(变异系数<10%)可满足临床检测要求,与其他病原体无交叉反应,特异性良好,试剂检测下限为400 copies/mL;特异度87.55%,灵敏度60.87%,正确率81.46%,阴性预测值0.88,阳性预测值0.59以及约登指数0.48;SAT法检测HCMV pp67 mRNA结果阳性率与临床诊断结果差异无统计学意义(P=0.894)。结论 SAT法检测HCMV pp67 mRNA可用于HCMV活动性感染的辅助诊断。     

人巨细胞病毒对人脐血巨核系祖细胞生长的影响及作用机制研究

[目的]探讨人巨细胞病毒(HCMV)对巨核系祖细胞生长的影响及其机制.[方法]采用造血祖细胞体外半固体培养技术,用HCMVAD169株分别感染去除T细胞和未去除T细胞的脐血单个核细胞.观察CFU-MK集落数;用原位聚合酶链反应(IS-PCR)检测集落细胞中的HCMVDNA.[结果]2个感染组的CFU-MK集落数均减少,与灭活病毒组比较,分别为29.5%和48.6%(P<0.05),未去除T细胞组CFU-MK集落数减少比去除T细胞组明显(P<0.05),经IS-PCR检测发现各病毒感染组CFU-MK细胞中有HCMVDNA存在.[结论]HCMV在体外能抑制CFU-MK的分化和增殖,HCMV感染引起的血小板减少可能与该病毒对巨核系祖细胞的直接抑制以及免疫因素有关.     

人巨细胞病毒感染新生乳鼠心肌细胞的实验研究

目的探讨人巨细胞病毒(HCMV)AD169株在体外感染SD大鼠新生乳鼠心肌细胞。方法以人巨细胞病毒感染SD大鼠新生乳鼠的心肌细胞,通过相差显微镜、间接免疫荧光观察感染后细胞病变、搏动情况,检测培养液中心肌酶的改变,及鉴定HCMV在心肌细胞内感染的状况。结果培养的SD大鼠新生乳鼠搏动心肌细胞感染HCMV后,细胞逐步出现病变,细胞停止搏动,HCMVpp65蛋白免疫荧光等检测亦为阳性。结论HCMV AD169株可能具有感染SD大鼠乳鼠心肌细胞的能力。     

H CM V 兔胚肺细胞体外感染模型的建立

为探讨人巨细胞病毒（ＨｕｍａｎＣｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ,ＨＣＭＷ）ＡＤ１６９毒株体外感染兔胚肺细胞（ＲａｂｂｉｔＥｍｂｒｙｏＬｕｎｇｃｅｌ,ＲＥＬ）的敏感性,建立ＨＣＭＶＡＤ１６９毒株感染模型,将ＨＣＭＶＡＤ１６９毒株定量接种于ＲＥＬ,观察细胞病理变化;用单克隆抗体－免疫组化方法检测细胞内ＨＣＭＶ抗原;电镜检测细胞内病毒颗粒,用ＥＬＩＳＡ方法检测经ＲＥＬ增殖病毒培养物ＨＣＭＶ抗原滴度,用人胚肺细胞（ＨｕｍａｎＥｍｂｒｙｏＬｕｎｇｃｅｌ,ＨＥＬ）滴定病毒毒力变化。结果表明,接种病毒后,ＲＥＬ于４８ｈ出现细胞肿胀,胞浆内出现折光性颗粒,逐渐变圆、脱落,其病变特征与该病毒在ＨＥＬ增殖出现的病变一致;用免疫组化法在胞浆及其核内查到ＨＣＭＶ抗原;用透射电镜观察,在细胞核内查到大量病毒颗粒;用ＥＬＩＳＡ方法在ＲＥＬ病毒培养物中查到ＨＣＭＶ抗原,抗原滴度与ＨＥＬ增殖的病毒一致;与ＨＥＬ增殖物比较,经ＲＥＬ增殖的病毒培养物毒力降低１００ＴＣＩＤ５０。表明ＲＥＬ是ＨＣＭＶＡＤ１６９毒株的敏感宿主细胞。     

人巨细胞病毒负荷量对细胞病变的影响

目的探讨感染后人巨细胞病毒负荷量与细胞病变的关系。方法采用不同滴定度的人巨细胞病毒感染传代培养的人胚肺成纤维细胞,建立人巨细胞病毒梯度感染细胞模型,荧光定量PCR法测定感染细胞内及其维持液病毒DNA量,光镜观察致细胞病变作用,电镜检查其超微结构的改变。结果人巨细胞病毒感染后,细胞内与其维持液病毒DNA量成正相关(r=0.83,P<0.01)。当细胞内病毒DNA量>105GE/106HEL时,病毒开始自细胞内释放;当维持液病毒DNA量>103GE/ml时,细胞出现病变。结论人巨细胞病毒感染后,受染细胞排放病毒致细胞外,且细胞内外病毒负荷量成正相关。细胞病变的发生情况与细胞内及其周围环境的病毒负荷量均密切相关。     

人类疱疹病毒6A亚型潜伏感染人神经胶质瘤细胞系U251

目的:采用人神经胶质瘤细胞系U251作为宿主建立HHV-6A亚型潜伏感染神经系统细胞的体外模型?方法:HHV-6A急性感染U251细胞后随细胞传代,通过观察细胞形态变化?病毒复制及检测病毒基因表达情况等确定其进入潜伏感染阶段?结果:HHV-6A在急性感染U251细胞后随传代数的增加,病毒基因拷贝量逐渐减低至稳定的低水平,而代表处于潜伏感染阶段的HHV-6A病毒U94基因的转录逐渐下降随后维持在稳定水平表达?结论:HHV-6A 在体外感染U251后通过传代使病毒从急性感染期逐渐转入潜伏感染期?     

活动性巨细胞病毒感染患儿免疫状态的变化及其意义

目的研究活动性人巨细胞病毒(HCMV)感染患儿的免疫功能状态。方法以68例活动性HCMV感染患儿为观察对象,44例潜伏型HCMV感染者及40例健康儿童为对照组;采用ELISA检测HCMV-IgM、IgG,用PP65抗原血症监测法测HCMV-Ag,用PCR方法检测尿HCMV-DNA,血清免疫球蛋白测定采用琼脂单扩散法,外周血T细胞亚群检测采用单克隆抗体标记的间接ABC免疫法。结果三组体液免疫功能测定差异无显著性(P>0．05);HCMV 感染组CD3、CD4、CD4/CD8比潜伏型CMV感染组及健康对照组明显降低(P均<0．01)。结论 HCMV感染患儿体液免疫功能基本在正常水平,不起主要作用;HCMV感染主要影响细胞免疫功能,细胞免疫功能低下是HCMV感染存在的结果也是前提条件。因而治疗上给予免疫调节剂是必要的。     

人巨细胞病毒AD169株引起小鼠脑部畸形的初步探讨

目的 :探讨人巨细胞病毒 (humancytomegalovirus ,HCMV)感染昆明小鼠的敏感性 ,建立HCMV致畸的动物模型。方法 :昆明系小鼠 4 0只 ,随机分为两组 :对照组 (8只 )和接种病毒组 (32只 ) ,病毒感染途径为脑内注射。在接种病毒 7,1 5 ,30 ,6 0d后不同时期分别以病理学方法观察动物脑部发育特点 ,以免疫组织化学方法检查病毒抗原 ,PCR方法检测动物脑组织中HCMV基因。结果 :接种HCMVAD1 69株的小鼠脑组织在不同时期发生了病理改变和脑部发育畸形 ,用免疫组织化学方法和PCR方法在脑组织细胞内检获HCMV抗原和基因。结论 :HCMVAD1 69株可引起小鼠脑部发育畸形 ,这对研究HCMV感染致畸的机制提供了有价值的参考依据     

蓝舌病毒湖北株对小鼠前列腺癌RM-1细胞的杀伤效应

目的:体外研究蓝舌病毒湖北株3(BTV-HbC3)对小鼠前列腺癌细胞RM-1的感染性并探讨BTV-HbC3靶向性溶瘤的机制。方法:观察RM-1细胞感染BTV-HbC3的细胞病变效应;MTT法研究病毒致细胞病变率的特征;透射电镜观察感染病毒后细胞超微结构的变化;DNA Ladder分析病毒诱导细胞凋亡的情况;流式细胞仪测定病毒对RM-1细胞凋亡的影响。结果:BTV-HbC3感染RM-1细胞后有明显的细胞病变效应;DNA Ladder分析为阶梯状条带;透射电镜发现胞质内有大量病毒颗粒和典型细胞凋亡形态变化;流式细胞仪可见明显的细胞凋亡。结论:BTV-HbC3在体外能有效的感染RM-1细胞,并能诱导RM-1细胞凋亡。     

人巨细胞病毒诱导ECV304血管内皮样细胞凋亡

目的 探讨人巨细胞病毒（HCMV）感染ECV304血管内皮样细胞的致病机制。方法 常规方法传代细胞和接种病毒。以PCR法和间接免疫荧光法检测病毒即刻早期基因（IE gene）及其蛋白表达;相差显微镜及电子显微镜观察病毒感染后细胞和细胞器形态变化;DNA梯度法和流式细胞术检测细胞凋亡。结果 病毒感染后72h开始出现胞体变圆、缩小、脱壁,胞质内颗粒增多,细胞边缘模糊不清的特征,可明显检测出病毒特异IEgene及其蛋白表达;电镜结果显示病毒感染96h后,胞质内明显空泡化,细胞膜微绒毛减少,核染色质浓集、边缘化,线粒体出现溶酶体化、空泡化和自噬现象,呈早期凋亡特征;DNA梯度电泳结果显示感染细胞DNA片段化特征的条带：流式细胞仪检测发现感染4d和6d时,细胞调亡率分别为4．1％和45．7％。结论 巨细胞病毒在体外细胞培养中可诱导ECV304血管内皮样细胞的凋亡。     

人巨细胞病毒在人胚肺成纤维细胞内的形态发生的观察

人巨细胞病毒接种人胚肺成纤维细胞后20分钟,可见病毒吸附和穿透过程。感染后18小时,在核内已出现包涵体,在其网眼内和网架上有核衣壳复制和装配。胞浆包涵体是病毒成熟时在胞浆中引起的一种细胞局灶性变性。溶酶体只吞噬和灭活小部分病毒,大部分病毒和致密体在囊泡内成熟时已获得包膜。它们以胞吐方式和细胞溶解方式释放到细胞外。