大鼠Akt1基因真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

目的构建Akt1基因真核表达载体pDC316-Akt1，观察其在293细胞（人胚肾母细胞）中的表达。方法采用RT-PCR方法自大鼠肝组织总RNA中克隆Akt1 DNA片段，测序鉴定正确后，插入真核表达载体pDC316的EcoRⅠ、HindⅢ的酶切位点，构建Akt1真核表达载体Akt—pDC316，脂质体介导法转染293细胞，36h后Western blot检测转染293细胞中Akt1的含量。结果经测序鉴定，构建的Akt1氨基酸序列与野生型Akt1序列完全相符。将Akt-pDC316转入293细胞，可见55000位置有Akt1的表达。经Western blot检测，具有良好的表达浓度。结论构建Akt1基因真核表达载体在293细胞中可以充分表达。     

iNOS基因和iNOS-VP1融合基因真核表达载体的构建及初步表达

目的 构建pcDNA3．1介导的诱导性一氧化氮合成酶（iNOS）的基因表达载体和pcDNA3．1介导的iNOS与柯萨奇病毒B组3型（CVB3）结构蛋白VP1融和基因的表达载体。方法 应用PCR扩增和DNA重组技术构建pcDNA3．1-iNOS和pcDNA3．1-iNOS—VP1表达载体；应用真核细胞转染技术及间接免疫荧光技术进行所构建的真核表达载体的初步表达和鉴定。结果 经PCR扩增技术用特异引物从质粒pKSiNOS分离编码iNOS开放阅读框架的cDNA，TA克隆于pMD19-T载体，根据设计引物时加入的酶切位点将插入片断亚克隆于表达载体pcDNA3．1；经PCR扩增技术用特异引物从质粒pCR2．1-VP1分离编码CVB3VP1结构蛋白的cDNA，TA克隆于pMD19-T载体，根据设计引物时加入的酶切位点将VP1亚克隆于iNOS的表达载体pcDNA3．1-iNOS，从而构建含有iNOS和VP1融合基因的真核表达载体。限制性内切酶分析、PCR鉴定和测序证实重组体peDNA3．1-iNOS和peDNA3．1-iN—OS—VP1插入片断的大小和方向正确且开放阅读框架的读码框不变；重组质粒peDNA3．1-iNOS和peDNA3．1-iNOS．VP1在HeLa细胞中均有表达，但表达效率较低。结论 获得含iNOS基因和iNOS—VP1融合基因的真核表达载体，并将重组质粒进行了初步表达，为体外iNOS抗CVB3作用的研究奠定了物质基础。     

带c-Myc标签的Mdfic基因真核表达载体构建及其在成肌细胞中的表达

目的构建新型转录因子Mdfic和c-Myc标签融合表达的真核表达载体pcDNA3.1-Mdfic-Myc,实现其在成肌细胞C2C12中的表达。方法 PCR方法扩增Mdfic的开放阅读框,酶切后的PCR扩增产物和退火后的人工合成的c-Myc标签共同克隆至pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,构建pcDNA3.1-Mdfic-Myc融合表达质粒。重组质粒经过PCR、双酶切和测序鉴定后,脂质体法转染C2C12细胞。RT-PCR和Western blotting方法检测转染后细胞中Mdfic-Myc的表达。结果成功构建了pcDNA-Mdfic-Myc真核表达质粒;RT-PCR和Western blotting结果表明,Mdfic-Myc融合蛋白在成肌细胞C2C12中获得高效表达。结论 pcDNA3.1-Mdfic-Myc融合表达质粒的成功构建及其在成肌细胞中的表达为进一步体外研究Mdfic蛋白单独的功能及其与其他分子间功能性相互作用奠定了基础。     

FBXO6基因真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的 构建F盒蛋白6(FBXO6)基因真核表达载体.方法 采用PCR方法合成含有EcoR Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切位点的FBXO6 cDNA全长.分别构建载体pEGFP-C1-FBXO6和pEGFP-C1-anti-FBXO6,采用菌落PCR、双酶切鉴定以及测序证实cDNA片段大小和序列正确.将载体pEGFP-C1-FBXO6和pEGFP-C1-anti-FBXO6分别转染HEK293T细胞,Western blot法检测FBXO6蛋白的表达.结果 pEGFP-C1-FBXO6和pEGFP-C1-anti-FBXO6包含大小、序列正确的FBXO6片段;FBXO6蛋白在转染pEGFP-C1-FBXO6的293T细胞中高表达;在转染pEGFP-C1-anti-FBXO6的HEK293T细胞中表达降低.结论 成功构建FBXO6基因正义真核表达载体pEGFP-C1-FBXO6和反义真核表达载体pEGFP-C1-anti-FBXO6.     

胰岛-脑1基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的 构建并鉴定表达胰岛-脑1(Islet-Brain 1,IB1)基因的真核细胞表达质粒.方法 从人胰岛细胞瘤提取总RNA,根据IB1 cDNA文库的序列利用RT-PCR扩增IB1基因.将此基因插人带有绿荧光的真核表达载体pEGFP-N1的EcoR1/KpnI酶切位点区域,携带IB1基因的真核表达质粒转染到胰岛细胞系(RINm5F),最后通过G418筛选获得稳定的携带IB1基因的胰岛细胞系.利用倒置相差荧光显微镜、流式细胞仪、Western blot鉴定的质粒及转染的细胞系.结果 RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析为840 bp的分子(IB1 AA1-280),测序分析证明与Genbank IB1 cDNA具有相同的序列.用EcoR I和Kpn I消化可见两条条带,Western blot分析证明IB1基因在RINm5F细胞表达.结论 成功构建了pEGFP-N1-IB1真核表达载体,转染到胰岛细胞系并稳定表达.     

大鼠CD36基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建大鼠CD36真核表达载体,并在293T细胞中表达.方法:应用RT-PCR技术,从大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞提取的总RNA中,获得CD36基因编码序列片段,克隆至真核表达载体pEGFP-N1中,对重组质粒进行酶切和测序鉴定后,以脂质体介导法转染至293T细胞,通过荧光显微镜和Western blot检测其在293T细胞中的表达.结果:酶切和测序证明重组真核表达载体pEGFP-N1-CD36构建成功,荧光显微镜及Western blot确认目的基因序列在293T细胞中过表达.结论:成功构建大鼠CD36基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-CD36,并在293T细胞中过表达.     

小鼠子宫珠蛋白结合蛋白真核表达载体构建及其在COS-1细胞的表达

目的:构建小鼠子宫珠蛋白结合蛋白(mouse uteroglobin binding protein,mUGBP)真核表达载体,观察其在COS-1细胞中的表达和定位.方法:用RT-PCR方法扩增mUGBP的cDNA序列,将其插入pEGFP-N1载体的多克隆位点构建pEGFP-UGBP重组质粒.采用脂质体转染法将重组质粒转染到无内源性mUGBP表达的非洲绿猴肾成纤维细胞株COS-1中,观察其在细胞内的表达,并用Western免疫印迹方法进行验证.结果:pEGFP-UGBP重组质粒经酶切鉴定以及测序证实,插入的目的基因序列完全正确.激光共聚焦显微镜观察发现,转染了pEGFP-UGBP重组质粒的细胞株可见绿色萤光蛋白的表达;Western免疫印迹检测发现细胞膜组分中可检获上述转染了重组质粒的细胞所表达的融合蛋白.结论:成功构建了pEGFP-UGBP重组质粒并进行了真核表达.     

血管内皮细胞黏附分子胞外区基因真核表达载体构建及表达

目的构建并表达血管内皮细胞黏附分子(VCAM-1)胞外区基因真核表达载体。方法从小鼠NIH/3T3细胞提取总RNA,以其为模板通过RT-PCR扩增VCAM-1胞外区(D1-D4结构域)cDNA。利用PCR获得VCAM-1胞外区基因,连接pMD19-T载体,进行基因序列测序。将VCAM-1 D1-D4目的片段插入到真核表达载体pIRES2-AcGFP1-Nuc中,构建重组真核表达质粒pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1。经双酶切鉴定VCAM-1胞外区基因真核表达载体构建的成功与否。利用脂质体把pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1导入至人B淋巴性白血病细胞株(Raji)内。结果基因测序结果表明成功扩增出VCAM-1胞外区基因,双酶切鉴定表明重组的真核表达质粒pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1构建成功。Western blot结果显示导入pIRES2-AcGFP1-Nuc-VCAM-1质粒的Raji细胞中VCAM-1高表达。细胞结合实验表明,表达的VCAM-1与前B细胞(70Z/3)表面的VLA-4特异性结合。结论 VCAM-1真核表达载体构建及表达成功,为前B细胞克隆形成机理以及为B细胞分化发育研究提供实验依据。     

人TRAM基因真核表达载体的构建

目的 构建TRAM基因真核表达载体,为研究TRAM的功能提供研究工具。方法 首先采用PCR方法扩增人TRAM蛋白相应的编码序列,将扩增的特定片段克隆至pCMV-N-Flag真核表达载体。然后,对重组载体进行DNA测序,确认序列正确后将重组载体转染至HEK-293T细胞,并用Western blot方法检测TRAM蛋白的表达以评价载体是否构建成功。结果 菌落PCR电泳可检测到800 bp附近出现目的条带,质粒DNA测序显示载体插入705 bp的核苷酸序列,其序列与TRAM完全一致。Western blot检测到HEK-293T细胞高表达带Flag标签的TRAM蛋白。结论 基于PCR扩增、双酶切、酶连接扩增片段和载体成功构建带Flag标签的TRAM真核表达载体。构建的质粒可为进一步研究干扰素的调控和抗病毒免疫治疗提供一种研究工具。     

重组免疫毒素IL3-PE38KDEL真核表达载体的构建

目的:构建大肠杆菌·毕赤酵母表达载体Ppic9k-IL3-Linker-PE38KDEL.方法:用PCR的方法扩增所需要的目的片段IL3及PE38KDEL,再通过酶切和连接的方法定向克隆到载体Ppic9k-Linker中,得到融合基因Ppic9k-IL3-Linker-PE38KDEL.重组载体经酶切,菌落PCR鉴定,DNA序列分析插入片段完全正确.结果:经限制性内切酶酶切鉴定,菌落PCR及DNA序列分析表明重组表达载体Ppic9k-IL3-Lin-ker-PE38KDEL构建成功.结论:成功地构建融合基因IL3-PE38KDEL的毕赤酵母表达载体,为后续的蛋白质的表达、纯化及功能研究奠定基础.     

hGR小基因真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的：构建用于体内剪接分析的人糖皮质激素受体（hGR）小基因真核表达载体。方法:以人基因组DNA为模板,设计特定的引物进行PCR扩增获得3.892 kb长的hGR小基因片段,并将其连入pMD18-TSimple载体中,限制性内切酶酶切鉴定后,再亚克隆到PcDNA3载体中,获得hGR小基因真核表达质粒PcDNA3-hGR并测序验证。Lipofectamine法转染PcDNA3-hGR至HeLa细胞,RT-PCR检测hGR小基因剪接异构体hGRα and hGRβ mRNA的表达。结果:限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实克隆片段序列与GenBank目标序列一致；PcDNA3-hGR在HeLa细胞内成功表达剪接异构体hGRα和hGRβ。结论:hGR小基因真核表达载体构建成功，为进一步研究糖皮质激素受体基因外显子9的选择性剪接提供了细胞分子模型。     

SDF-1-pIRES2-EGFP真核表达载体的构建

目的 从ATCC提供的、携带有基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1,SDF-1)cDNA的质粒pCMV-SPORT6中获取SDF-1的cDNA全长,并构建SDF-1-pIRES2-EGFP真核表达载体.方法 采用双酶切、回收SDF-1cDNA片段,克隆至pIRES2-EGFP真核表达载体,得到SDF-1-pIRES2-EGFP真核表达载体.结果 酶切及测序结果表明SDF-1-pIRES2-EGFP真核表达载体构建成功.结论 获得SDF-1基因,构建SDF-1-pIRES2-EGFP真核表达载体,为探索SDF-1修饰人骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs) 促进人CD34 细胞归巢及增殖方面的作用奠定基础.     

大鼠GLUT1真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

目的：构建大鼠葡萄糖转运体1（GLUT1）的真核表达载体。 方法： 以RT-PCR方法从大鼠脑组织中获取GLUT1全长cDNA片段，将其克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+)中，构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Glut1，随后用lipofectamineTM 2000介导转染HEK293细胞，以RT-PCR法检测重组质粒在mRNA水平的表达，以免疫组化的方法检测重组质粒在蛋白水平的表达。 结果： 以构建的重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Glut1转染293细胞后，在基因及蛋白表达水平均检测到了葡萄糖转运体1的表达。 结论： 成功构建了携带大鼠葡萄糖转运体1的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Glut1，且证实其可在293细胞中成功表达目的基因，为进一步研究外源性GLUT1表达对缺血缺氧脑细胞的保护作用奠定了基础。     

小鼠α烯醇化酶基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建小鼠α烯醇化酶（En01）基因的真核表达载体。方法以健康小鼠肾脏组织细胞的eDNA为模板,采用聚合酶链式反应（PCR）扩增Enol基因编码区的全部序列,克隆至真核细胞表达载体pCDNA3．1^＋中,测序鉴定目的基因用阳离子脂质体转染的方法转染中国仓鼠卵巢CHO细胞。结果PCR扩增的特异性片段长度为1304bp,以此构建重组质粒pCDNA3．1^＋-Enol,测序结果与Gen．bank中的鼠源Enol基因eDNA序列一致。转染中国仓鼠卵巢细胞后可检测到Enol蛋白的表达。结论构建的真核表达载体pCDNA3．1^＋-Enol可在真核细胞内正确表达,这为进一步的疫苗研究奠定了基础。     

人FL基因高效真核表达载体的构建及其在COS—7细胞中的表达

目的：构建人FL真核表达载体－pIRS1neo/hFL,观察其在COS－7细胞 中的表达。方法：采用RT－PCR方法自人白血病细胞系TF－1中克隆可溶型FL（Flt3-ligand)cDNA片段,测序鉴定正确后,插入真核表达载体-pIRES1 neo中的EcoR Ⅰ和BamHI位点,构建hFL真核表达载体－pIRES1neo/hFL。脂质体介质法将其转染COS－7细胞,72h以RT－PCR检测转染细胞中外源hFL基因的转录、ELISA法及脐血CD34^ 细胞增殖实验测定转染细胞上清上hFL的含量和活性。结果：酶切鉴定表明成功构建了重组真核表达载体－pIRES1neo/hFL;外源hFL基因能在转染细胞中有效转录;ELISA法测得72h后培养上清中的hFL含量为每24小时251ng/10^6 cells,并且分泌的hFL具有良好的生物学活性。结论：构建hFL真核表达载体在COS－7细胞中具有良好的表达活性。     

微小隐孢子虫CP15基因高效真核表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达

目的 :构建隐孢子虫CP15真核表达载体pCR3 1 15 ,观察其在Hela细胞中的表达。方法 :用BglⅡ从pMD18 T 15中酶切得到CP15基因 ,将其插入真核表达载体pCR3 1(+)的BamHⅠ位点 ,构建CP15真核表达载体pCR3 1 15 ,脂质体介导法将其转染Hela细胞 ,并用G4 18加压筛选 ,用RT PCR方法检测外源CP15基因的转录 ,用ELISA法和间接免疫荧光法检测其活性。结果 :酶切鉴定表明已成功构建了重组真核表达载体pCR3 1 15 ;外源CP15基因能在转染细胞中有效转录 ;ELISA法和间接免疫荧光法实验结果表明表达产物具有良好的生物活性。结论 :构建的pCR3 1 15真核表达载体在Hela细胞中具有良好的表达活性。     

人MAdCAM-1真核表达载体的构建及其表达细胞株的建立

目的:建立表达人MAdCAM-1的细胞模型。方法:从pUC21/hMAdCAM-1质粒酶切下hMAdCAM-1全长cDNA片段,将其克隆于巨细胞病毒载体pCIneo中,构建出由CMV启动子控制的重组真核表达载体pCIneo-hMAd,经脂质体介导转染至CHO细胞,以G418筛选抗性克隆。结果:筛选出的阳性克隆细胞以免疫荧光和免疫酶标染色法检测,表明有人MAdCAM-1分子表达;其细胞裂解物经免疫印迹分析,证实约63 kD的新增蛋白带与抗 hMAdCAM-1抗体有特异性结合反应;淋巴细胞粘附实验结果提示表达产物具有一定的功能活性。结论:成功地获得了表达人MAdCAM-1分子的细胞株,为进一步研究其生物学功能及其作用机制奠定了基础。     

GILZ真核表达载体的构建及其表达定位

目的:克隆、构建HA标签的糖皮质激素诱导亮氨酸拉链蛋白GILZ表达载体,观察其在细胞中表达与定位,为研究GILZ在脂肪细胞分化中的作用提供工具。 方法：采用逆转录PCR（RT-PCR）法从C3H10T1/2细胞中扩增带有HA标签的GILZ cDNA编码区,并将其重组于真核表达载体pcDNA3中。经酶切、序列鉴定分析后,将该重组质粒通过Lipofectamine 2000脂质体和CaCl2方法,分别转染C3H10T1/2和293T细胞,用HA抗体免疫荧光和免疫印迹法检测GILZ在细胞内的表达、分布及分子量大小。 结果：HA-GILZ表达载体经酶切鉴定和测序分析确认构建成功,并在C3H10T1/2和293T细胞中获得了高效表达。在荧光显微镜下,GILZ主要表达于细胞质内,分子量约20 kD。 结论：成功构建HA-GILZ基因表达载体并表达于C3H10T1/2细胞质中,为GILZ的功能研究奠定了基础。     

负载大鼠VEGF120基因的真核细胞表达载体pCDNA 3.1的构建及鉴定

目的构建负载大鼠VEGF120基因的真核细胞表达载体pCDNA 3.1,使外源性VEGF120基因可以在真核细胞中表达。方法利用缺氧后大鼠脑组织,提取总RNA,采用RT-PCR技术,利用已知引物合成cDNA,将VEGF120基因扩增后插入真核细胞表达载体pCDNA 3.1。重组质粒热转化至感受态E.ColiJM109细胞中,获得重组菌株。提取质粒,进行酶切鉴定及插入基因进行测序。结果限制性内切酶酶鉴定及测序证实已将VEGF120cDNA成功插入真核细胞表达载体。结论成功构建负载大鼠VEGF120基因的真核细胞表达载体pCDNA3.1,本实验研究为外源性VEGF基因导入真核细胞提供一种途径。