实时荧光定量PCR检测特殊人群中HCV-RNA的研究

[目的]探讨HCV在特殊人群中的流行和干扰素治疗效果对HCV-RNA含量的影响。[方法]收集223份抗-HCV阳性血清并跟踪观察和用荧光定量实时荧光定量PCR法检测HCV-RNA的含量。[结果]在141份抗-HCV阳性血清中,58份实时荧光定量PCR阳性,阳性符合率为41.13%,在86份有输血史患者中39份实时荧光定量PCR阳性,阳性率为45.35%,17份有家族遗传史患者中11份实时荧光定量PCR阳性符合率为64.70%。在38例不明原因感染者中有8份实时荧光定量PCR阳性,阳性率为21.05%（χ^2=16.21Р=0.000）。58例实时荧光定量PCR阳性的病人经治疗两年后,39份有输血史患者,转阴24例,转阴率61.53%。11份有家族遗传史患者中6例转阴,转阴率54.54%。在8例不明原因感染者中有5例转阴,转阴率62.24%。[结论]不同的传染途径在RNA的含量和治疗的预后有差异。     

实时荧光定量PCR技术在结核分枝杆菌研究中的应用

<正>核酸扩增技术特别是聚合酶链式反应(polymerase chainreaction,PCR)可对不同来源的核酸进行定性检测,但需在PCR反应终止后对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,这不仅无法准确定量,而且还容易发生交叉污染,产生假阳性。     

荧光定量PCR技术检测结核杆菌临床应用分析

目的 探讨荧光定量PCR技术在检测结核杆菌的临床应用价值. 方法 将本院临床诊断确诊为肺结核的68例患者为研究对象,采用荧光PCR技术测定两组痰液及外周血中的结核杆菌,以临床诊断结果为金标准,采用x2检验对结果进行分析比较. 结果 68例结核病患者中痰涂片、痰定量PCR、外周血定量PCR检测的阳性率为14.7％、41.2％、44.1％,定量PCR检测的阳性率显著高于痰涂片(P＜0.05).痰涂片阴性的58例患者中痰及外周血定量PCR检测阳性率为31.0％、41.3％.痰及外周血定量PCR配对检测两种标本同时检测的符合率为44.1％. 结论 荧光PCR技术检测结核杆菌的效果要显著优于传统涂片,其可证实、鉴定涂片阳性结果,同时对痰和外周血进行定量PCR检测,可.增强互补作用,提高检测的准确率.     

荧光定量PCR检测TB-DNA与抗酸染色阳性率的比较

目的　探讨荧光定量检测TB -DNA在结核病中的应用价值。　方法　采集 82例高度怀疑结核病患者的临床标本 ,应用FQ -PCR检测TB -DNA ,同时用浓集法涂片查找抗酸杆菌 ,比较两种检测方法在结核病患者标本中的阳性检出率。　结果　TB -DNA阳性检出率为 60 .98% ,显著高于抗酸杆菌阳性检出率 3 2 .93 % (P <0 .0 5 ) ;且治疗后TB -DNA的拷贝数和阳性检出率也显著下降 (P <0 .0 5 )。　结论　TB -DNA定量能提高结核杆菌的检出率 ,可作为药物选择和判断疗效的指标。     

脆弱类杆菌荧光定量PCR法检测

目的探讨荧光定量PCR技术检测脆弱类杆菌。方法用特异性引物和荧光染料实时PCR扩增并检测产物。结果脆弱类杆菌标准株(ATCC 25285)和4株分离株均有特异扩增曲线,灵敏度达10²个菌;而大肠埃希菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌无特异扩增曲线。结论荧光染料实时PCR技术可特异并定量检测脆弱类杆菌     

呼吸道病原体多重实时荧光定量PCR的检测

目的 建立多重实时荧光定量PCR检测方法,为实现对呼吸道病原体的快速、灵敏特异性检测.方法 采用经报道的引物和探针对合胞病毒、腺病毒等8种呼吸道病原体进行多重实时荧光定量PCR检测.结果 多重荧光定量PCR阳性检测率高达57.8%,无假阳性及假阴性,特异性强.结论 多重实时荧光定量PCR具有经济、快速、特异性强等优点,在呼吸道病原体检测方面有巨大应用价值.     

实时荧光定量PCR快速鉴定短乳杆菌

目的:建立鉴定短乳杆菌的实时荧光定量PCR法。方法:根据GanBank登录的乳酸杆菌序列,以gyrB基因为靶目标设计引物和探针,对啤酒中分离到的6株乳酸杆菌进行实验,并对其中一个短乳杆菌样本作定量检测。结果:实时荧光定量PCR对短乳杆菌可产生特异扩增信号,对其他乳酸杆菌无响应。标准曲线的相关系数为0.97739,测得短乳杆菌样本浓度为15635拷贝/m l。结论:实时荧光定量PCR是一种快速、特异、灵敏检测短乳杆菌的方法。     

实时荧光定量PCR检测0139群霍乱弧菌研究

目的:利用荧光定量PCR技术,建立一种快速、准确、特异检测0139群霍乱弧菌的定量方法.方法:选取0139群霍乱弧菌糖基转移酶基因(LPSgt)作为检测的靶基因,设计引物和TaqMan探针,探针的两端均进行荧光标记.对PcR扩增体系进行优化,进一步评价实时荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度、重复性后,对收集的临床样本进行鉴定.结果:本文所建立的实时荧光定量PCR方法可准确、特异的检测和鉴定0139群霍乱弧菌,其他菌株均无阳性结果产生;该方法的灵敏度可达到10 cfu/ml;定量检测的批间和批内的变异系数均小于5%;对85例临床样本进行评价,结果获得9例0139群霍乱弧菌阳性,与常规培养法结果完全一致.结论:本文建立的检测0139群霍乱弧菌实时荧光定量PCR方法快速、准确,结果可靠,实用性强,可对结果进行定量分析,为0139群霍乱弧菌的实验室诊断和现场流行病学调查提供了较好的分析手段.     

实时荧光定量PCR检测O139群霍乱弧菌研究

目的：利用荧光定量PCR技术,建立一种快速、准确、特异检测O139群霍乱弧菌的定量方法。方法：选取O139群霍乱弧菌糖基转移酶基因（LPSgt）作为检测的靶基因,设计引物和TaqMan探针,探针的两端均进行荧光标记。对PCR扩增体系进行优化,进一步评价实时荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度、重复性后,对收集的临床样本进行鉴定。结果：本文所建立的实时荧光定量PCR方法可准确、特异的检测和鉴定O139群霍乱弧菌,其他菌株均无阳性结果产生;该方法的灵敏度可达到10 cfu/ml;定量检测的批间和批内的变异系数均小于5%;对85例临床样本进行评价,结果获得9例O139群霍乱弧菌阳性,与常规培养法结果完全一致。结论：本文建立的检测O139群霍乱弧菌实时荧光定量PCR方法快速、准确,结果可靠,实用性强,可对结果进行定量分析,为O139群霍乱弧菌的实验室诊断和现场流行病学调查提供了较好的分析手段。     

饮用水大肠菌群Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法研究

[目的]建立快速、灵敏、特异的饮用水大肠菌群荧光定量PCR定量检测方法.[方法]以大肠菌群的lacZ基因为检测靶基因,设计荧光定量PER引物和Taqman-MGB探针,建立荧光定量PER定量反应体系,并评价荧光定量PER方法的灵敏度、特异性、重复性.[结果]建立大肠菌群的荧光定量PER检测方法.25μl荧光定量PER反应体系主要成分浓度分别为Mg2+5.0 mmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,引物0.2μmol/L,探针0.5μmol/L,4xROX参比荧光染料0.5μl,Taq DNA聚合酶2.0 U,模板5μl.方法可检出每微升单个拷贝大肠菌群模板,方法的特异性、重复性良好.[结论]荧光定量PER方法可快速、灵敏、特异地检出水质中大肠菌群,可为饮用水大肠菌群快速检测标准方法的建立提供参考.     

荧光定量PCR在孕妇HCMV感染检测中的应用研究

目的使用荧光定量PCR检测孕妇尿液中HCMV-DNA,提高该人群中病毒检出率。方法对广西南宁和桂林两地共600名孕妇进行尿液HCMV-DNA检测,同时进行血清HCMV-IgG和HCMV-IgM检测,对比以上两种方法在产前诊断中的应用价值。结果尿液HCMV-DNA阳性率为8.50%(51/600),血清HCMV-IgG阳性率为98.8%(593/600),HCMV-IgM阳性率为1.83%(11/600)。结论相对于传统的酶联免疫检测法,荧光定量PCR可明显提高孕妇病毒检出率,并且提供定量数据,同时使用荧光定量PCR和ELISA将为临床提供更加准确的实验室诊断结果。     

荧光定量PCR在结核分枝杆菌检测中的应用价值

目的比较荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)与抗酸染色、改良罗氏培养法检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异性,探讨FQ-PCR检测痰标本中结核分枝杆菌的应用价值。方法对311例临床确诊的肺结核病患者和40例非结核呼吸系统疾病患者的痰标本应用FQ-PCR法、痰涂片抗酸染色法、改良罗氏培养法检测结核分枝杆菌。结果FQ-PCR、抗酸染色法、改良罗氏培养法检测结核分枝杆菌的阳性率分别为47.0%(146/311)、28.3%(88/311)、35.4%(110/311),特异性分别为100.0%、100.0%、95.2%,以FQ-PCR检测的阳性率最高。结论FQ-PCR是一种快速、敏感性高、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法,在临床上有重要应用价值。     

荧光定量PCR检测血浆游离DNA方法的建立

[目的] 建立TaqMan探针定量PCR 术检测血浆游离DNA的方法.[方法] 构建重组质粒pMD-18-TGAPDH、pMD-18-T-sRY作为标准品,并通过软件设计出TaqMan探针,优化定量PCR体j募≯并对其特异性进行分析.[结果] 建立了1个检测GAPDH和4个检测SRY荧光定量PCR方法,得到上述5个荧光PCR的扩增动力曲线和定量标准曲线,模板起始浓度与阈值循环数(CT值)之间有很好的相关关系(r分别为0.97.0.99.0.98、0.97、0.99).[结论] 成功建立了定量检测血浆游离DNA的方法,其灵敏度高、特异性强,有望成为一种检测孕母血浆游离DNA含.量的快速简便方法.     

多重荧光定量PCR甄别霍乱弧菌方法的建立

目的 利用多重荧光定量PCR技术,建立一种快速、准确、特异甄别霍乱弧菌的定量方法.方法 分别根据霍乱弧菌霍乱毒素A亚单位基因(ctxA)和糖基转移酶基因(LPSgt)作为检测的靶基因,设计引物和TaqMan-MGB探针,探针的5'端分别用FAM和VIC进行荧光标记,3'端标记MGB.优化PCR扩增体系,对多重实时荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度、重复性评价,同时进行一定数量临床样本考核鉴定,与常规方法进行比较.结果 该方法可准确、特异地鉴定霍乱弧菌,同时能够甄别O139群霍乱弧菌.全部的霍乱弧菌用ctxA基因对应引物和探针检测均为阳性,其中只有O139群霍乱弧菌出现LPSgt基因阳性,其他菌株均无阳性结果.检测的灵敏度为2×102 cfu/ml.同时对收集的45例临床样本进行鉴定,结果显示10例为霍乱弧菌,其中O139群有4例,其余均为阴性结果,与常规鉴定方法一致.结论 研究建立的多重荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速,可有效鉴定产毒霍乱弧菌及甄别O139群霍乱弧菌,可用于霍乱监测和防制工作中的实验室诊断.     

实时荧光定量PCR快速检测对虾IHHNV载量方法的建立和应用

目的:建立一种快速、定量、特异、灵敏的PCR方法用于对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的早期诊断和疫情监测。方法:根据GenBank登录的IHHNV毒株序列,使用生物学软件进行序列比对,在IHHNV保守区序列设计特异性引物与Taqm an探针。对实时荧光定量PCR反应条件进行优化以缩短检测时间,提高特异性、灵敏度、重复性,并与普通PCR进行盲样测试的比对。结果:本法线性范围5×102~5×107拷贝/ml,检出限5×101拷贝/ml,灵敏度超过普通PCR100倍,特异性高于普通PCR,重复性极好(S=0.035~0.39,CV=0.13%~1.05%),检测时间为普通PCR的1/5,现场盲样IHHNV检出阳性率高于普通PCR 26.00%。结论:本研究建立Taqm an实时荧光定量PCR用于对虾IH-HNV检测具有特异、灵敏、快速、定量、重复性好等优点。     

荧光定量PCR技术在痰结核菌检测中的应用

目的 比较荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术与痰涂片抗酸染色、改良罗氏培养法在检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异性,探讨FQ-PCR检测痰标本中结核分枝杆菌的应用价值.方法 对240例临床确诊的肺结核病患者和107例非结核呼吸系统疾病患者的痰标本分别应用FQ-PCR法、痰涂片抗酸染色法、改良罗氏培养法检测结核分枝杆菌;另用FQ-PCR法检测14例非结核分枝杆菌DNA以评价该方法对非结核分枝杆菌检测的特异性.结果 FQ-PCR检测结核分枝杆菌的敏感性分别为52.1％ (125/240),明显高于抗酸染色法的24.2％ (58/240)和改良罗氏培养法的35.4％ (85/240),x2=39.36,P＜0.01;FQ-PCR法对14例非结核分枝杆菌检测结果全部为阴性,特异性为100％.结论 FQ-PCR是一种快速、敏感性高、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法,并且可以有效地鉴别非结核分枝杆菌感染,在肺结核的临床实验室诊断上有重要的应用价值.     

实时荧光定量PCR检测胃癌组织Twist基因的结果分析

目的分析实时荧光定量PCR检测胃癌组织Twist基因的临床意义。方法用实时荧光定量PCR的方法检测正常胃黏膜、胃癌原发灶、胃癌转移灶组织中TwistmRNA的表达含量。并以Twist基因和18stRNA含量的比值作为评价Twist表达水平的指标,组间进行配对t检验。结果Twist／18stRNA（10g比值）正常组为0．139±0．003;原发组为0．304±0．046;转移组为0．654±0．015。原发性胃癌组织及转移组织中Twist基因表达水平与正常胃黏膜组织比较,差异有统计学意义（P〈0．05）;转移组与原发组比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论Twist基因在正常胃黏膜组织中表达量较低,在胃癌及其转移组织中表达水平较高,而且Twist基因的表达水平与胃癌转移程度存在一定相关性。可以辅助诊断和观察胃癌术后疗效。     

实时荧光定量PCR在手足口病原体检测中的应用探讨

目的：：对手足口病患儿施行病原体检测时运用荧光定量PCR实时测定法（FQ-PCR法）的效果及有关情况探析。方法：以2016年5月-7月因疑似感染手足口病进入本院施行病原体测定的患儿127例为评估对象,依据年龄段情况将其划分成A组（年龄不超3岁者）77例、B组（年龄间于3-6岁间者）50例,运用FQ-PCR法对疑似患儿的疱疹液、咽拭子实施相应指标值的测定;并以ELISA法对患儿血清展开检测,经比对两法的检出率数据情况,系统评估FQ-PCR医疗检测效果。结果：127例患儿咽拭子样本、疱疹液样本在FQ-PCR法测定下,EV检测有101例显阳性,占79.53%;当中A组有67例,占87.01%,B组有34例,占68.00%。A组患儿阳性检出率超出B组,差异明显（P＜0.05）。咽拭子样本检出阳性率是69.60%,疱疹液样本检出阳性率是81.97%。FQ-PCR法检出EV71阳性病例超出ELISA法,差异显著（P＜0.05）,检出COXA16阳性病例和ELISA法较接近,没有较大差异（P＞0.05）。结论：FQ-PCR 法践行于HFMD病原体测定及评估中,能强化病原学指标监控力度,以辅助当地HFMD疫情预测、防范工作的有效进行。     

LightCycler^TM全自动实时荧光定量PCR诊断系统原理分析

聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，MR）技术自1989年应用于临床检验以来，以其快速、简便、灵敏等优点很快地成为临床实验诊断学的一个技术热点。2000年6月瑞士罗氏公司生产的LightCycler^TM全自动荧光定量MR系统通过国家药品监督管理局医疗器械产品准入审查，医疗器械注册证号：SDA（I）20000755。目前，已广泛用于涉及到核酸的科学研究以及临床疾病的诊断和治疗监测。