系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中Brn-3a mRNA表达水平的研究

目的 探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞中Brn-3a mRNA 表达及其与疾病活动性的关系.方法 以β-actin为内参照,建立逆转录实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)方法,在Light Cycler Real time PCR检测仪上检测92例SLE患者(活动期46例,缓解期46例)、其他结缔组织病(CTD)患者30例(疾病对照组)、健康体检者30例(正常对照组)外周血单个核细胞(PBMCs)中Brn-3a mRNA 的表达水平和含量.以ΔCt=Ct(待测基因)-Ct(内参基因)来比较基因表达水平的高低.结果 活动期SLE患者Brn-3a mRNA表达水平明显高于缓解期SLE患者(P<0.01);活动期SLE患者Brn-3a mRNA表达水平明显高于正常对照组与疾病对照组(P<0.01);缓解期SLE患者Brn-3a mRNA表达水平与正常人及疾病对照组差异无统计学显著性意义(P>0.05).结论 活动期SLE患者Brn-3a mRNA表达水平显著高于正常人、疾病对照组和疾病缓解期,提示Brn-3a的表达与SLE的发生发展存在一定关联性,可能参与了SLE的发病过程并与疾病的活动性有关.     

系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中MBD4 mRNA表达水平的研究

目的探讨系统性红斑狼疮（SEE）患者外周血单个核细胞中MBD4 mRNA表达及其与疾病发病机制、疾病活动性的关系。方法以pactin为内参照,建立逆转录实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-RT-PCR）方法,在LightCycler RealtimePCR检测仪上检测70例SLE患者（活动期32例、缓解期38例）、其他结缔组织病（CTD）患者30例（疾病对照组）、健康体检者30例（正常对照组）外周血单个核细胞（PBMCs）中MBD4 mRNA的表达水平和含量。以△Ct=Ct（待测基因）-Ct（内参基因）来比较基因表达水平的高低。结果SLE患者PBMC中MBD4mRNA表达水平高于正常对照组与疾病对照组（P〈0．05）,且疾病不同病期（活动期与缓解期）MBD4 mRNA表达水平差别有统计学意义（P〈0．01）。结论结果显示SLE患者PBMC中MBD4 mRNA表达水平显著高于正常人、疾病对照组,提示MBD4 的表达与SLE的发生发展存在一定关联性,可能参与了SEE的发病过程并与疾病的活动性有关。     

系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中ISG15 mRNA表达水平的研究

目的 探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMCs)中ISG15 mRNA表达及其与疾病活动性的关系.方法 采用逆转录实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)的方法,在Light Cycler Real time PCR检测仪上检测89例SLE患者(活动期50例、缓解期39例)、结缔组织病(CTD)患者34例(疾病对照组)、健康体检者35名(健康对照组)外周血PBMCs中ISG15 mRNA 的表达水平和含量.以ΔCt=Ct(待测基因)-Ct(内参基因)来比较基因表达水平的变化.结果 活动期SLE患者ISG15 mRNA表达水平(ΔCt=2.04±1.07)明显高于缓解期SLE患者(ΔCt=5.48±1.72,t=11.572,P＜0.01);活动期SLE患者ISG15 mRNA表达水平(ΔCt=2.04±1.07)明显高于疾病对照组(ΔCt=5.90±1.72,t=12.69,P＜0.01)和正常对照组(ΔCt=5.66±1.63,t=12.359,P＜0.01);缓解期SLE患者ISG15 mRNA表达水平与正常人及疾病对照组的差异无显著性(P＞0.05).SLE患者PBMCs中 ISG15 mRNA的表达水平与SLE疾病活动评分指数(SLEDAI)评分及抗双链DNA抗体呈显著正相关(均P＜0.01),与补体C3、C4呈显著负相关(均P＜0.01).结论 活动期SLE患者ISG15 mRNA表达水平显著高于正常人、疾病对照组和疾病缓解期,提示ISG15的表达可能参与了SLE的发病过程并与疾病的活动性显著相关.     

圆盘状受体反义寡核苷酸对瘢痕疙瘩成纤维细胞中圆盘状受体表达和胶原合成的抑制作用

目的:观察硫代修饰和脂质体包埋的反义寡核苷酸(ASODN)抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞圆盘状受体基因表达及其对瘢痕疙瘩胶原抑制的影响。方法:实验于2005-03/2006-01进行。收集解放军第二军医大学长海医院整形外科手术切除的4例瘢痕疙瘩(供体知情同意),采用组织块培养法进行细胞培养。并将经脂质体包埋并全硫代修饰后的圆盘状受体ASODN加入培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞中,实验分6组,ASODN 5,10,20 μmol/L组、无寡核苷酸组、单纯脂质体及空白对照组。采用反转录-聚合酶链反应技术及[3H]-脯氨酸掺入法检测瘢痕疙瘩成纤维细胞中圆盘状受体1 mRNA、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA表达相对量及其对瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成分泌的影响。结果:①圆盘状受体1 mRNA表达相对量:ASODN 5,10,20 μmol/L组低于空白对照组(1.91±0.19,1.19±0.37,0.49±0.14,2.61±0.47,P<0.01),ASODN 20 μmol/L组低于ASODN 5,10 μmol/L组(P<0.01)。②Ⅰ型胶原mRNA表达相对量:ASODN 5,10,20 μmol/L组低于空白对照组(1.91±0.59,1.46±0.17,0.19±0.27,3.31±0.53,P<0.01),ASODN 20 μmol/L组低于ASODN 5,10μmol/L组(P<0.01)。③Ⅲ型胶原mRNA表达相对量:ASODN 10,20 μmol/L组低于空白对照组(0.73±0.36,0.61±0.23,1.16±0.43,P<0.01)。④Ⅰ型胶原mRNA/Ⅲ型胶原mRNA:空白对照组为4.50±0.12,ASODN 5,10,20 μmol/L组均低于空白对照组(2.40±0.11,2.00±0.06,1.50±0.07,P<0.05,0.01),ASODN 20 μmol/L组低于ASODN 5,10μmol/L组(P<0.01)。⑤胶原合成分泌量:ASODN 10,20 μmol/L组低于空白对照组(P<0.01)。ASODN 20 μmol/L组低于ASODN 5 μmol/L组(P<0.01)。结论:圆盘状受体-ASODN能明显抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞中圆盘状受体表达,显著抑制Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA表达,调整Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原比例,并抑制胶原合成和分泌。     

实时荧光聚合酶链反应结合融解曲线分析在α-地中海贫血基因诊断中的价值

目的建立自动化、高通量、准确快速检测缺失型α地中海贫血基因型的技术。方法运用SYBRGreen1和ABI7000热循环仪分别进行3个实时荧光定量聚合酶链反应(SYBRQPCR),同时进行融解曲线(D.C)和Tm值分析,根据特定Tm值对应的D.C峰值判定基因型,即以该峰值≥Cutoff值定为PCR结果阳性。将PCR产物重组到T载体,筛选到含正确扩增片段的克隆,以梯度稀释重组质粒DNA为模板,进行SYBRQPCR得出标准曲线。从而定量未知标本。结果优化了3个SYBRQPCR反应的引物及其浓度,热循环条件等。检测SEA等位基因的PCR产物长800bp,Tm=82.5℃±1℃。αα等位基因的PCR产物长206bp,Tm=83.0℃±1℃。非SEA等位基因的PCR产物长436bp,Tm=84.0℃±1℃。重组质粒拷贝数在1至105范围内,其对数值与CT值均呈良好线性关系。该检测技术的灵敏度较常规PCR结合琼脂糖凝胶电泳法高出16倍以上。联合运用3个SYBRQPCR反应可以为SEA缺失携带者、缺失型HbH病、非缺失型HbH病、α地贫2纯合子、Bart′s水肿胎儿综合征做出基因诊断,并可用于产前诊断。结论该技术具有自动化程度高、不需荧光标记探针、成本低、易质控、防污染、高通量等优点,适于临床推广应用。     

PRAME基因在急性白血病中的表达及临床意义分析

本研究检测黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)基因在不同类型急性白血病(acute leukemia,AL)中的表达及其与病情发展的相互关系.用建立的检测PRAME基因的SYBR Green Ⅰ荧光实时定量逆转录聚合酶链反应(RQ-RT-PCR)方法,对55例急性白血病患者(急性髓系白血病43例、急性淋巴细胞性白血病9例、其它类型的白血病3例)的骨髓样本进行PRAME基因表达情况的检测.同时选择7例非恶性血液疾病患者的骨髓样本和8例正常人外周血样本作为阴性对照,并用白血病细胞系K562作为阳性对照.结果表明35例急性白血病患者中检测出不同水平的PRAME基因表达,在其余20例急性白血病患者及15例对照样本中均未检测出PRAME基因,总阳性率64%,两组之间具有非常显著的差异(p＜0.005).在35例PRAME基因阳性表达的患者中,AML 28例,阳性检出率为65%,其中以M3、M4和M2亚型的阳性检出率较高,分别为90%、70%、67%;ALL 5例,阳性检出率为56%.在31例融合基因阳性患者中,PRAME基因阳性患者为23例,而在24例融合基因阴性患者中,PRAME基因阳性患者达到12例.比较各种临床因素与PRAME表达水平的相关性未发现明显相关.短期观察5例PRAME基因阳性表达的患者显示出经化疗达到完全缓解(CR)后,患者PRAME基因表达均转阴,下降水平为63-23921/106×GAPDH拷贝.长期观察1例M3患者显示化疗后PRAME基因水平逐渐下降并转阴,患者至今仍处于CR状态.结论PRAME基因在65%的急性白血病中呈阳性表达,其中以M3、M4和M2亚型最常见,在正常个体和非恶性血液病患者中不表达.不同白血病个体之间PRAME基因表达水平不同,随病情缓解其表达水平降低或转阴.PRAME基因可以成为微小残留病(MRD)检测的一种分子标志.     

慢性粒细胞白血病患者外周血Bmi1 mRNA的表达水平

目的采用实时荧光定量PCR(Rt-PCR)检测Bmi1基因表达的方法,了解慢性粒细胞白血病(CML)患者外周血Bmi1基因的表达水平。方法采用Rt-PCR方法检测CML患者41例和10例健康人外周血中Bmi1基因的表达水平。结果Rt-PCR的结果显示,基因Bmi1在健康人、CML患者慢性期、加速期及急变期中的表达相对值分别为0.544±0.233、1.624±0.632、3.021±0.923及3.561±1.005。CML患者中Bmi1的表达水平明显高于健康人(P0.05),加速期及急变期中Bmi1的表达水平明显高于慢性期,急变期Bmi1的表达水平明显高于加速期,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 Bmi1基因在CML外周血中有高水平的表达,是监测CML患者病情进展及判断预后有价值的分子标记物。     

系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中ISGl5mRNA表达水平的研究

目的探讨系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血单个核细胞（PBMCs）中ISG15mRNA表达及其与疾病活动性的关系。方法采用逆转录实时荧光定量聚合酶链反应（FQ—RT-PCR）的方法，在Light Cycler RealtimePCR检测仪上检测89例SLE患者（活动期50例、缓解期39例）、结缔组织病（CTD）患者34例（疾病对照组）、健康体检者35名（健康对照组）外周血PBMCs中ISG15mRNA的表达水平和含量。以△Ct=Ct（待测基因）-α（内参基因）来比较基因表达水平的变化。结果活动期SLE患者ISG15mRNA表达水平（ACt=2．04&#177;1．07）明显高于缓解期SLE患者（△Ct=5．48&#177;1．72，t=11．572，P〈0．01）；活动期SLE患者ISC15mRNA表达水平（△Ct=2．04&#177;1．07）明显高于疾病对照组（△Ct=5．90&#177;1．72，t=12．69，P〈0．01）和正常对照组（△Ct=5．66&#177;1．63，t=12．359，P〈0．01）；缓解期SLE患者ISG15mRNA表达水平与正常人及疾病对照组的差异无显著性（P〉0．05）。SLE患者FBMCs中ISGl5mRNA的表达水平与SLE疾病活动评分指数（SLEDAI）评分及抗双链DNA抗体呈显著正相关（均P〈0．n1），与补体C3、C4呈显著负相关（均P〈0．01）。结论活动期SLE患者ISG15mRNA表达水平显著高于正常人、疾病对照组和疾病缓解期，提示ISG15的表达可能参与了SLE的发病过程并与疾病的活动性显著相关。     

艾滋病毒感染者外周血T细胞TCR β链CDR3谱系漂移的监测

目的利用"荧光定量PCR溶解曲线分析技术"监测HIV感染者外周血T细胞受体(TCR)β链CDR3谱系漂移(单/寡/多克隆增生)。方法提取6例HIV感染者、4名正常人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcell-PBMC)中的总核糖核酸(RNA),反转录成互补脱氧核糖核酸(cDNA),设计人26个TRBV基因家族上、下游引物,荧光定量PCR(FQ-PCR)扩增26个TRBV基因各家族CDR3谱系,溶解曲线法分析各家族CDR3谱系的单/寡/多克隆增生。结果正常人外周血T细胞TCRβ链26个家族CDR3表达频率不一致,各家族PCR产物的"溶解曲线谱型图"显示多克隆增生的高斯分布,呈现溶点不同的CDR3多态性,6例HIV感染者的外周血TCRβ链CDR3谱系的26个家族CDR3表达频率不一致,患者各家族PCR产物的"溶解曲线谱型图"上,多数家族为多克隆增生的高斯分布,但每个患者均出现数量不等的单克隆和寡克隆增生家族。结论荧光定量PCR溶解曲线法监测人TCRβ链CDR3谱系漂移的方法稳定简便,可以用来监测正常人和HIV感染者外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移。     

构建hnRNP B1相对定量的FQ RT-PCR检测方法

目的 建立一种荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ RT-PCR)检测肺癌患者外周血hnRNP B1 mRNA表达的相对定量方法.方法 以hnRNP B1为待测基因,以β-actm为参照进行检测,建立标准曲线,确定实时RT-PCR的扩增效率;优化反应条件,使扩增效率接近100%,检测待检标本hnRNP B1和β-actin的循环阈值(Ct).结果 该法检测的最低拷贝数为103,线性范围为103～107拷贝,批内和批间变异系数(CV)分别为3.4%和11.3%.结论 该方法具有灵敏、特异、数据处理简便可靠等特点,为其他肿瘤患者外周血中肿瘤细胞的检测提供了方法学启示.     

RacGAP1在胃癌中的表达与幽门螺杆菌L型感染的关系

目的 探讨胃癌组织中RacGAP1的表达情况,及其与幽门螺杆菌L型(Hp-L)感染的关系。方法 选取125例胃癌患者,根据有无Hp-L感染分为Hp-L感染阳性组(感染组)和Hp-L感染阴性组(未感染组),另选取胃镜检查为正常胃黏膜,且Hp-L感染阴性的体检者30例作为对照组,应用免疫组织化学法检测标本中RacGAP1蛋白的表达情况,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组中RacGAP1 mRNA的表达情况,并对胃癌患者进行为期5年的随访。结果 RacGAP1主要表达在胃癌组织细胞核中,感染组和未感染组RacGAP1阳性率显著高于对照组(P＜0.01),感染组RacGAP 1阳性率显著高于未感染组(P＜0.05)。RacGAP1 mRNA的表达组间存在显著差异:感染组＞未感染组＞对照组;RacGAP1蛋白在胃癌组织中的表达与瘤体大小、浸润深度、淋巴转移、TNM分期和Hp感染有关;感染组生存率63.6%(49/77),未感染组生存率83.3%(30/36)。未感染组的生存率显著高于感染组(P＜0.05)。结论 胃癌组织中RacGAP1表达显著升高,Hp感染可能导致RacGAP1表达的提高,且RacGAP1高表达的患者预后较差。     

结直肠癌患者外周血基因表达分析中参照基因的选择

目的筛选结直肠癌患者全血样本的合适内参照基因。方法以ACTB、GAPDH、GUSB、UBC、B2M、PBGD和18S rRNA为候选基因,用实时相对定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）稀释法检测其在8例结直肠癌患者和8名健康人全血中的表达水平,再用geNorm和NormFinder程序及两样本均数t检验评价候选参照基因的稳定性,探寻应用于结直肠癌患者全血基因表达检测的合适参照基因。结果 geNorm评估发现,最适合的参照基因是ACTB、GAPDH和GUSB;NormFinder计算结果认为GAPDH稳定性最好,B2M、ACTB和GUSB次之,推荐的参照基因组合是GAPDH和B2M;候选基因表达水平的组间比较（结直肠癌组和健康组）发现,除ACTB、GUSB和UBC之外,其他候选参照基因在组间表达差异有统计学意义。结论 PBGD和18S rRNA不是结直肠癌全血样本的合适参照基因,而ACTB和GUSB是相对可以接受的参照基因。     

结直肠癌患者外周血CEA-mRNA表达的研究

目的 检测结直肠癌患者外周血中的循环肿瘤细胞癌胚抗原（CEA）mRNA的表达,并分析其临床价值。方法 40例有明确临床肿瘤病灶存在的结肠癌患者,20例结肠息肉患者和40例健康志愿者,分别以逆转录PCR（RT-PCR）检测其外周血中CEA mRNA的表达。结果 40例结肠癌患者外周血中CEA mRNA表达的阳性率为45.0%（18/40）,而健康对照组均为阴性,两者比较有显著性差异（P〈0.001）;20例结肠息肉患者中CEA mRNA表达阳性率为10%（2/20）;CEA mRNA阳性表达率与肿瘤分期相关,而与肿瘤细胞分化程度并不相关。结论 结直肠癌患者外周血中CEA mRNA的表达的检测对肿瘤的分期、决定治疗手段、判断疗效和预后有着重要的临床价值。     

CK20 mRNA和hTERT mRNA在大肠癌围手术期血行微转移中的转录特征

目的 探讨细胞角蛋白20(CK20)mRNA和人端粒酶催化亚单位(hTERT)mRNA作为大肠癌围手术期血行微转移标志物的价值.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测40例大肠癌患者术前、术中及术后外周血CK20 mRNA和hTERTmRNA的表达,并对不同分化程度、不同Dukes分期的大肠癌患者CK20 mRNA和hTERT mRNA的表达进行比较.结果 40例大肠癌患者外周血CK20 mRNA和hTERT mRNA的表达率,术前分别为47.5%(19/40)和45.0%(18/40),术中为70.0%(28/40)和70.0%(28/40),术后为10.0%(4/40)和32.5%(13/40).除术后hTERT mRNA阳性率与术前无显著差异(P＞0.05)外,术中外周血CK20 mRNA、hTERT mRNA阳性率和表达强度(与内参照β-actin比值)均显著高于术前(P＜0.01,P＜0.05),术后明显低于术前和术中(P＜0.01).hTERT mRNA在低分化肿瘤的表达明显高于高、中分化组(P＜0.05),而CK20mRNA在低分化肿瘤的表达强度低于高、中分化组(P＜0.01).大肠癌围手术期Dukes B期和C D期之间CK20 mRNA和hTERT mRNA均无显著性差异(P＞0.05).结论 大肠癌患者围手术期血行微转移的发生几率较高,病理分化程度低者更易发生,但与Dukes分期无明显相关,CK20 mRNA和hTERT mRNA联合检测对大肠癌血液微转移具有较高的敏感性和特异性,是判断围手术期血行微转移的良好标志物.     

荧光定量RT-PCR检测Rac1 mRNA基因及其与胃癌转移的关系

Objective To investigate the relationship between tumor metastasis-related Rac1 mRNA expression levels and gastric carcinomas metastasis, and to investigate the significance of Rac1 as a tumor marker for the evaluation of gastric carcinomas metastasis and distinguish between benign and malignant lesions. Methods This experiment used fluorescence quantitative RT-PCR TaqMan probe technology, chose Rac1 target gene fragment, which was cloned into the pET-20b (+) vector, constructed recombinant plasmid, and established the Rac1 mRNA fluorescence quantitative RT-PCR standard curve. And then the Rac1 mRNA levels were detected in 52 cases of gastric carcinoma tissues,52 cases of para-carcinoma tissues and 12 cases of benign gastric disease tissues. Its association with the metastasis of gastric carcinomas was analyzed. Results The positive rates and levels (median, P25-P75) of Rac1 mRNA were 100. 0% ,7.41 ×105 (3. 50 × 105-4. 36 × 106) copies/μl in gastric carcinomas, 46. 2% ,0(0-1.73 × 104) copies/μl in parscarcinoma tissues, 33. 3%, 0(0-3.55 × 103) copies/μl in benign tissues. The positive rates and leves(x2 =43.16,x2Xk-w = 64. 19, P ＜0. 01)among the three groups were significantly different. When the critical value of Rac1 mRNA level was 1.73 × 104 copies/μl determined by ROC, the sensitivity and specificity were 88. 5% and 100% respectively. When the critical value of Rac1 level was 7.49 × 105 copies/μl, the sensitivity and specificity were 57.9% and 78. 6% respectively. ConclusionThe Rac1 mRNA level detected with fluorescence quantitative RT-PCR has reference value to distinguish between benign and malignant lesions and evaluate gastric carcinoma metastasis.     

荧光定量RT-PCR检测Rac1 mRNA基因及其与胃癌转移的关系

Objective To investigate the relationship between tumor metastasis-related Rac1 mRNA expression levels and gastric carcinomas metastasis, and to investigate the significance of Rac1 as a tumor marker for the evaluation of gastric carcinomas metastasis and distinguish between benign and malignant lesions. Methods This experiment used fluorescence quantitative RT-PCR TaqMan probe technology, chose Rac1 target gene fragment, which was cloned into the pET-20b (+) vector, constructed recombinant plasmid, and established the Rac1 mRNA fluorescence quantitative RT-PCR standard curve. And then the Rac1 mRNA levels were detected in 52 cases of gastric carcinoma tissues,52 cases of para-carcinoma tissues and 12 cases of benign gastric disease tissues. Its association with the metastasis of gastric carcinomas was analyzed. Results The positive rates and levels (median, P25-P75) of Rac1 mRNA were 100. 0% ,7.41 ×105 (3. 50 × 105-4. 36 × 106) copies/μl in gastric carcinomas, 46. 2% ,0(0-1.73 × 104) copies/μl in parscarcinoma tissues, 33. 3%, 0(0-3.55 × 103) copies/μl in benign tissues. The positive rates and leves(x2 =43.16,x2Xk-w = 64. 19, P ＜0. 01)among the three groups were significantly different. When the critical value of Rac1 mRNA level was 1.73 × 104 copies/μl determined by ROC, the sensitivity and specificity were 88. 5% and 100% respectively. When the critical value of Rac1 level was 7.49 × 105 copies/μl, the sensitivity and specificity were 57.9% and 78. 6% respectively. ConclusionThe Rac1 mRNA level detected with fluorescence quantitative RT-PCR has reference value to distinguish between benign and malignant lesions and evaluate gastric carcinoma metastasis.