铁皮石斛的PCR-RFLP鉴别方法

目的:建立铁皮石斛专有的分子鉴别方法。方法:通过对铁皮石斛及其近缘种石斛的叶绿体matk基因序列进行对比分析,根据鉴别位点设计特异的铁皮石斛鉴别引物,通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)技术进行鉴别。结果:本试验中鉴别引物可成功扩增铁皮石斛及其近缘种石斛,PCR产物为331 bp,铁皮石斛的PCR产物可被Tru9 Ⅰ限制性内切酶切开,而近缘种石斛不能被切开,可通过琼脂糖凝胶电泳成功鉴别。结论:本试验建立的PCR-RFLP鉴别方法可以鉴别铁皮石斛及其近缘种石斛。     

PCR-RFLP法鉴别罗布麻与混淆品白麻 及其psbA-trnH序列分析

目的:基于叶绿体psbA-trnH基因间隔区序列,建立一种PCR-RFLP(聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性)方法鉴别罗布麻(Apocynum venetum L.)及其混淆品白麻(Apocynum pictum),并验证psbA-trnH序列酶切位点种间特异性和种内保守性.方法:将罗布麻和白麻提取总DNA,扩增psbA-trnH序列,扩增产物双向测序.序列分析发现,罗布麻含有特异性酶切位点SspⅠ.结果:扩增产物psbA-trnH为300～400 bp.罗布麻psbA-trnH产物均可以被SspⅠ酶切成两条条带,白麻却不能被SspⅠ酶切.生物信息分析结果表明,在罗布麻属中,罗布麻psbA-trnH序列的SspⅠ酶切位点具有种间特异性和种内保守性,在夹竹桃族进化树中,罗布麻与白麻距离最近.结论:本实验建立的PCR-RFLP方法可以有效鉴别罗布麻和白麻.     

麦冬药材及饮片中掺混山麦冬的PCR-RFLP鉴别方法研究

目的:通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP法)建立一种能快速鉴别麦冬药材及饮片中掺混山麦冬的方法。方法:对麦冬和山麦冬的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)序列酶切位点进行比对，选择山麦冬的特异性酶切位点PmlI,设计PCR-RFLP反应引物。以退火温度58℃、循环数为30,LR-F和LR-R鉴别引物(10μmol·L^-1)各0.5μL,PmlI限制性内切酶在37℃酶切2 h的反应条件为PCR-RFLP法的参数，并进行方法学考察和统计分析。结果:在退火温度58℃、循环数为30时，山麦冬或掺有山麦冬的麦冬样品经过特异性引物扩增后，能被PmlI限制性内切酶酶切，在100～250 bp之间检出2条单一DNA条带，麦冬样品则无此条带。该方法稳定性好，专属性强，能对麦冬与山麦冬饮片及掺混样品进行鉴别，并对麦冬中掺入山麦冬的检出限为5%。结论:建立的PCR-RFLP鉴别方法稳定性好，灵敏度高，实现了麦冬与山麦冬饮片及麦冬中掺混山麦冬的快速检测，可用于麦冬与山麦冬药材真伪鉴别的补充检验方法。     

利用限制性片段长度多态性技术鉴别梅花鹿骨种属来源的研究

摘 要 目的：建立一种基于限制性片段长度多态性技术鉴别梅花鹿骨粉的种属来源的方法。方法: 对脱钙后的动物骨粉样品进行核糖核酸提取,通过聚合酶链式反应对梅花鹿特征片段进行扩增,并通过限制性片段长度多态性分析进一步对其种属来源进行确证。结果: 通过对特征片段进行聚合酶链式反应扩增,可将梅花鹿及马鹿来源的骨粉样品与牛、猪、狗等动物骨粉样品进行区分。通过对限制性内切酶XbaI进行酶切后的片段长度进行分析,可进一步区分梅花鹿与马鹿来源的骨粉样品。结论:建立了一种基于限制性片段长度多态性技术的梅花鹿骨粉种属来源的鉴别方法。     

进口药材“大、小广天仙子”的鉴别研究

目的 多种方法联合鉴别进口药材“大、小广天仙子”。方法 参照《儿茶等43种进口药材质量标准》中性状和显微鉴别方法,并根据2020年版中国药典中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则分析相关ITS1、ITS2、pshA-trnH、matK、rbcL基因序列信息,利用关键差异位点探索建立聚合酶链式反应法-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)鉴别方法。结果 进口“大、小广天仙子”在显微特征和5个DNA条形码基因上均具有明显差异。“大广天仙子”符合进口药材标准规定;“小广天仙子”来源于另一个物种,为混伪品。利用ITS2上能被限制性内切酶NdeⅠ识别的关键差异位点可建立新的PCR-RFLP鉴别法。结论 采用显微鉴别和PCR-RFLP法可有效鉴别广天仙子真伪。     

聚合酶链式反应 -限制性片段长度多态性分析复方川贝散中川贝母成分

目的 采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析复方川贝散中川贝母成分.方法 研究起止时间为2019年2月至2019年5月.新型快速植物基因组DNA提取试剂盒分别提取复方川贝母和蛇胆川贝液中DNA,PCR扩增后采用SmaⅠ限制性内切酶酶切,并进行琼脂糖凝胶电泳分析.同时,对川贝母含量为0％～40％的样本进行PCR-RFLP检测.结果 复方川贝散和蛇胆川贝液PCR扩增后均出现特异性条带,但经SmaⅠ酶切后复方川贝散在100～250 bp出现两条特异性酶切条带,而蛇胆川贝液无特异性条带.川贝母含量为4％时,经PCR-RFLP分析在100～250 bp得到两条特异性DNA条带.结论 PCR-RFLP可有效分析复方川贝散中川贝母成分,且对含量超过4％的样本可有效检出.     

PCR-RFLP分析16s-23srDNA间区序列鉴定分枝杆菌菌种

目的探讨16S～23srDNA间区序列DNAPCR扩增和限制性酶切分析在分枝杆菌分类鉴定中的价值。方法对19种分枝杆菌标准株的16S～23SrDNA间区序列DNA进行PCR扩增并对扩增产物进行限制性内切酶HaeⅢ、MSP1消化反应，分析不同菌种扩增片段及其限制性片段长度多态性的差异。结果，PCR扩增结果显示：分枝杆菌一般扩增出1～2条带，缓慢生长分枝杆菌扩增片段在340～480bP，快速生长分枝杆菌扩增片段集中在470～575bP，单从扩增产物的琼脂糖凝胶电泳只能鉴定33．3％的受试菌种，酶切结果显示：分枝杆菌的酶切图谱彼此不同。结论16S～23SrDNA间区序列DNAPCR扩增和RFLP分析是分枝杆菌分类鉴定的一种快速、有效的方法。     

POR-RFLP分析16s～23s rDNA间区序列鉴定分枝杆菌菌种

目的 探讨16s～23s rDNA间区序列DNA PCR扩增和限制性酶切分析在分枝杆菌分类鉴定中的价值.方法 对19种分枝杆菌标准株的16s～23s rDNA间区序列DNA进行PCR扩增并对扩增产物进行限制性内切酶Hae Ⅲ、MSP1消化反应,分析不同菌种扩增片段及其限制性片段长度多态性的差异.结果 PCR扩增结果显示:分枝杆菌一般扩增出1～2条带,缓慢生长分枝杆菌扩增片段在340～480bP,快速生长分枝杆菌扩增片段集中在470～575 bP,单从扩增产物的琼脂糖凝胶电泳只能鉴定33.3%的受试菌种,酶切结果显示:分枝杆菌的酶切图谱彼此不同.结论 16s～23s rDNA间区序列DNA PCR扩增和RFLP分析是分枝杆菌分类鉴定的一种快速、有效的方法.     

药用植物束花石斛、流苏石斛及其形态相似种的PCR-RFLP鉴别研究药用植物束花石斛、流苏石斛及其形态相似种的PCR-RFLP鉴别研究

目的建立简易的采用rDNA ITS区作为分子标记对中药石斛的基源植物进行分子鉴定的技术。方法 用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法获得ITS片段的限制性图谱。束花石斛及其形态相似种的PCR扩增产物用Cla I和Apa LI酶切,流苏石斛及其形态相似种的PCR扩增产物用Sph I酶切。结果根据预测的PCR-RFLP图谱,可以鉴别药用植物束花石斛、流苏石斛及它们的形态相似种。用这种方法鉴定了市场上收集的25件商品束花石斛、流苏石斛新鲜药材的原植物。结论rDNA ITS的PCR-RFLP可用于鉴定石斛药材的原植物,具有简便、费用低的优点。     

覆盆子及其混淆品山莓的鉴别

目的 鉴别覆盆子的一种混淆品山莓.方法 根据二者的性状特征、主要显微特征及薄层色谱进行了鉴别比较.结果 山莓同正品覆盆子相比,两者性状、显微及薄层色谱具有一定的差别.结论 此方法简便、易操作,可作为覆盆子与混淆品山莓的鉴别方法,用以覆盆子药材的鉴别参考.     

市售覆盆子药材DNA条形码鉴定研究

目的基于ITS2条形码序列检测市场销售覆盆子药材,为保证覆盆子药材使用的正确性和安全性提供一种新的鉴定手段。方法获取掌叶覆盆子及其5种常见同属易混种ITS2序列,以及GenBank上下载的共计48条序列。使用Gene Tool软件分析ITS2序列长度,GC含量和变异位点等情况,利用Clustal X和MEGA 7.0软件计算遗传距离和构建邻接系统发育聚类树。同时随机检测24份市售覆盆子药材,利用中药材DNA条形码鉴定系统和构建邻接系统发育聚类树确定物种,鉴别真伪。结果掌叶覆盆子基原植物可与其同属易混种进行明显区分;市售药材中正品22份,伪品1份,混合物1份。结论基于ITS2序列的DNA条形码技术能够成功鉴定市场销售的掌叶覆盆子及其混伪品。     

浙龟甲的PCR鉴别研究

目的 建立聚合酶链式反应（PCR）技术鉴别浙龟甲[来源为龟黄喉水龟Clemmys mutica（Cantor）的背甲及腹甲]真伪的方法。方法 提取浙龟甲及其混淆品的基因组DNA,从NCBI网站上检索黄喉水龟及其混淆品的线粒体基因,进行分析比对,根据黄喉水龟细胞色素b（cytochrome b gene,Cytb）基因上的特异位点应用Oligo软件设计引物,对浙龟甲及其混淆品样本进行PCR扩增。结果 所设计的引物能特异性扩增黄喉水龟,扩增片段长度为357 bp,能有效区分浙龟甲及其混淆品种。结论 建立的PCR技术鉴别浙龟甲方法,具有特异性高、方法简便快捷、实用性较强的特点,在快速准确鉴别浙龟甲方面具有良好的应用前景。     

安罗替尼联合AP方案治疗晚期非小细胞肺癌的临床研究

目的 基于线粒体cytochrome coxidase I（CO I）和16 S rRNA基因开发DNA双重条形码鉴定方法,由此验证并补充形态鉴定,以期建立一种准确、有效地鉴定地龙及混淆品原动物的方法。方法 对收集到的66份样品依据形态特征进行初步鉴定,使用优化后的引物同时扩增CO I和16 S rRNA序列。优化一步法双重PCR实验条件。用MEGA 5.1计算地龙及其混淆品的种内、种间遗传距离,基于K2P模型构建NJ树。结果 CO I和16 S rRNA双重DNA条形码鉴定与形态鉴定结合,可准确鉴别地龙及混淆品原动物。结论 形态鉴定是分子鉴定的基础,分子鉴定是形态鉴定的有力补充。二者结合可最大程度地实现地龙及其混淆品原动物的准确鉴定。DNA双重条形码鉴定方法也可为地龙药材鉴定以及其他动物药材的分子鉴定提供参考。     

基于matK和ITS2及二级结构对药材香薷及其混伪品的鉴别研究

目的 快速、准确鉴别药材香薷及其混伪品，保障香薷的药材质量和用药安全。方法 收集石香薷、江香薷和香薷植物材料分别进行matK和ITS2序列的扩增与测序，测序结果经Codon Code Aligner软件校对，同时从GenBank下载石香薷、江香斋及其易混品种海州香薷、香薷、密花香薷、牛至等物种的matK和ITS序列。其中，ITS序列经隐马尔可夫模型去除两端的5.8S和28S序列，共得到16个物种的ITS2序列50条；经Clustal软件校对共获得9个物种的matK序列28条。通过Mega7.0软件分析matK和ITS2序列，计算所有物种种内和种间遗传距离，构建邻接法(neighbor joining，NJ)聚类树，通过ITS2 Database预测ITS2二级结构，采用4Sale软件比对二级结构，通过ProfDistS软件构建基于联合ITS2一级序列及其二级结构的剖面邻接(profile neighbor-joining，PNJ)系统发育树。结果 基于matK和ITS2序列的遗传距离均表明香薷正品与其各种混伪品之间存在明显barcoding gap。NJ和PNJ进化树的拓扑关系一致，可以区分药材香薷及其混伪品。香薷的ITS2二级结构与其各混伪品具有显著差异。结论 建议matK和ITS2序列均可以作为鉴别香薷与其混伪品的DNA条形码，ITS2二级结构信息的加入可丰富鉴定结果，为香薷药材的准确鉴别、香薷属与石荠苎属植物的科学分类提供参考。     

畲药地稔及其易混淆品的鉴别

目的 为防止因误用混淆品而降低临床疗效,建立畲药地稔及其易混淆品的鉴别方法。方法 采用显微鉴别法进行地稔及其易混淆品秀丽野海棠、中华野海棠、方枝野海棠药材组织结构的鉴别;基于HPLC指纹图谱,建立地稔及其上述混淆品的液相色谱鉴别方法。结果 地稔根横切面皮层石细胞、栓内层簇晶均较多,为其与易混淆品的主要显微区别;基于HPLC指纹图谱,地稔及其易混淆品的区别主要有2点：一是相对于没食子酸峰相对保留时间约为1.1的色谱峰为不同的2种化学物质;二是上述化学物质的色谱峰与没食子酸峰的峰面积比值相差较大,地稔中该比值均>0.90,平均值为1.35,而其易混淆品中该比值均<0.30。结论 建立的显微和液相鉴别方法能快速地将地稔及其易混淆品进行区别,并且操作简单,易于推广应用,具有广阔的应用前景。     

基于DNA条形码技术鉴定蒙药材刺柏叶及其混淆品

目的：基于DNA条形码技术鉴别蒙药材刺柏叶及其混淆品。方法：采用国际通用的条形码序列 ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL,对刺柏叶及其混淆品圆柏叶共计11份样品进行DNA提取、扩增,采用CodonCode Aligner进行序列拼接,并用MEGA软件对拼接序列进行变异位点分析、邻接(NJ)聚类分析,并计算其平均种内、种间遗传距离。结果：4对引物的PCR扩增产物测序成功率分别为ITS2 100%、 psbA-trnH 100%、rbcL 100%、matK 0%;ITS2序列和psbA-trnH序列均可通过变异位点比较区分刺柏叶及其混淆品;NJ聚类分析的结果显示,psbA-trnH序列的NJ聚类树中刺柏叶与圆柏叶均能分别聚为一支,且psbA-trnH序列的平均种间遗传距离明显大于平均种内遗传距离。结论：psbA-trnH序列能有效区分圆柏叶与刺柏叶,可作为鉴别刺柏叶及其混淆品圆柏叶的条形码序列,为蒙药材刺柏叶及其混淆品的鉴别提供支持。     

基于UPLC指纹图谱和化学计量学对华山参及其混伪品的鉴别研究

目的 建立华山参的UPLC指纹图谱,鉴别其正品和混伪品。方法 建立华山参的UPLC指纹图谱,对相似度进行分析,采用聚类分析、主成分分析、偏最小二乘-判别分析法对共有峰进行分析。结果 建立的指纹图谱共标定出15个共有峰。华山参正品的相似度均在0.867以上,混伪品的相似度均低于0.555。30批华山参样品聚为3类,正品与伪品、主产地与非主产地华山参药材被显著区分,并筛选出4个差异性成分。结论 建立的UPLC指纹图谱能有效鉴别华山参及其混伪品,为华山参药材的质量评价和真伪鉴别提供参考。     

Photoshop软件在清风藤类药材鉴定中的应用研究

目的 应用Photoshop CS3软件处理清风藤属药用植物及其混伪品茎横切面的图像信息，结合统计学分析的方法鉴别该类药材，以此探究应用此方法鉴定茎木类药材的可行性及其鉴定学意义。方法 观察分析6种清风藤属药用植物及其混伪品茎横切面特征，应用数码摄影，Photoshop CS3软件和SPSS 22.0软件对茎横切面特征进行拍摄、测量和统计分析。结果 所观察的6种植物茎横切面中髓/木部比值、髓射线数目等数值存在一定差异。结论 采用Photoshop软件处理图像与统计学相结合的方法，可作为清风藤属植物分类及其药材性状鉴别新的参考依据。     

金线莲及其混伪品中总黄酮含量的比较研究

目的 比较金线莲及其混伪品中总黄酮的含量。方法 以芦丁为对照品,采用紫外分光光度法测定金线莲及其混伪品中总黄酮的含量。结果 12批金线莲总黄酮含量在3.89~15.17 mg/g之间,其中广东清远的野生金线莲总黄酮含量最高,为15.17 mg/g;13种混伪品的总黄酮含量在3.66~21.96 mg/g之间,其中野生斑叶兰总黄酮含量最高,为21.96 mg/g。结论 金线莲及其混伪品中总黄酮含量存在明显差异。