白念珠菌MRR2基因错义突变C1409A与氟康唑耐药的相关性

目的 研究锌簇转录因子——多药耐药调节因子2(Mrr2)编码基因MRR2错义突变C1409A与白念珠菌氟康唑耐药的相关性。方法 利用白念珠菌工程菌株SN152构建MRR2基因敲除菌株,通过一步法克隆及定点突变技术构建MRR2基因C1409A突变型表达质粒,再用高效醋酸锂转染法将质粒片段转染入MRR2基因敲除菌株,异位表达于ADE2位点以构建MRR2基因定点突变菌株。通过体外药物敏感性试验及实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析错义突变C1409A与氟康唑耐药的关系。结果 氟康唑对MRR2基因C1409A定点突变的白念珠菌的最低抑菌浓度(MIC)较对工程菌株SN152的MIC增加4倍,CDR1表达上调约3倍。结论 MRR2基因错义突变C1409A可上调白念珠菌CDR1表达并介导白念珠菌对氟康唑的耐药。     

白念珠菌锌簇转录因子编码基因mrr2敲除与鉴定

目的:构建白念珠菌mrr2基因敲除菌株。方法 :通过长引物PCR方法及融合PCR方法,以SN152菌株基因组DNA、带有筛选标记的质粒DNA为模板构建基因敲除组件;再用高效醋酸锂转染法将敲除组件转染入SN152菌株,并在相应营养缺陷的筛选板上培养生长,再通过2次同源重组的策略敲除mrr2的2条等位基因。结果:成功构建白念珠菌mrr2基因敲除菌株。结论:融合PCR策略可高效、快速构建白念珠菌基因敲除菌株。以SN152菌株为亲本菌的mrr2基因敲除株的构建,为进一步研究白念珠菌耐药机制奠定基础。     

重叠PCR法构建PTEN基因3位点的融合重组载体

目的构建包含与子宫内膜癌相关的PTEN基因3位点的重组p MD19-exon 5-exon 8载体。方法以健康人全基因组DNA为模板,设计2对有重叠区的特异性引物分别扩增PTEN基因的exon 5和exon 8片段,利用重叠PCR技术,将exon 5和exon 8片段进行连接,再将连接产物exon 5-exon 8片段插入p MD19-T质粒,构建成重组p MD19-exon 5-exon 8载体,转化入大肠埃希菌感受态细胞DH5α进行表达,利用菌液PCR和基因组测序进行鉴定。结果 exon 5-exon 8片段经凝胶电泳检测,可在1 253 bp处见一清晰的目的条带,PTEN基因融合重组质粒经菌液PCR及测序结果鉴定,均与预期结果一致。结论应用重叠PCR法将exon 5和exon 8片段进行融合,并成功构建了PTEN基因融合重组表达载体。     

同源重组敲除临床肺炎克雷伯菌质粒bla_(KPC-2)基因

目的建立敲除临床肺炎克雷伯菌耐药菌株质粒上的耐药基因的方法。方法聚合酶链反应(PCR)分别扩增试验菌株待敲除目的基因blaKPC-2的上下游片段及质粒pMQ300的潮霉素耐药基因片段,采用重叠延伸基因扩增(SOE-PCR)技术构建融合片段,以耐阿普霉素的λred质粒pKOBEG-Apr为介导,同源重组敲除临床肺炎克雷伯菌耐药菌株的blaKPC-2基因。用含潮霉素和阿普霉素的LB培养基筛选重组子,用PCR和逆转录PCR扩增检测blaKPC-2基因、潮霉素耐药基因及药物敏感性验证重组子。结果不同多位点序列分析(MLST)型别的2株临床肺炎克雷伯菌耐药菌株的blaKPC-2基因得以敲除。结论λred同源重组法可以可靠敲除临床肺炎克雷伯菌耐药菌株质粒上的基因。     

重叠PCR法构建宫颈癌相关的EGFR基因G719S和T790M融合重组载体

目的构建包含与宫颈癌相关的EGFR基因G719S和T790M位点重组p MD19-exon18-exon20载体,为制备突变型EGFR基因重组载体提供模板。方法以健康人全血基因组DNA作为模板,设计2对有重叠互补区的特异性引物,对EGFR基因的exon18和exon20两片段分别进行扩增,用重叠PCR技术将exon18和exon20片段进行连接,再将连接产物exon18-exon20片段插入p MD19-T质粒,构建成野生型p MD19-exon18-exon20载体,转入至大肠埃希菌感受态细胞DH5α中进行表达,利用菌液PCR和基因组测序进行鉴定。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示,exon18和exon20两位点扩增片段在778 bp和596 bp处有清晰的目的条带,两片段的融合产物exon18-exon20片段可在1 374 bp处见一清晰目的条带;经菌液PCR和基因组测序结果鉴定,EGFR基因融合重组质粒均与预期结果一致。结论利用重叠PCR法将exon18和exon20片段进行融合,且成功构建了EGFR基因重组表达载体。     

白念珠菌H3K4甲基转移酶N末端肽段Set1-208p的原核细胞表达及鉴定

摘要：目的：原核细胞表达白念珠菌H3K4甲基转移酶N末端肽段Set1-208p,鉴定重组蛋白质的抗原性。 方法：用比对软件对白念珠菌H3K4甲基转移酶与其他物种甲基转移酶进行比对。选择与人类无同源性的抗原特异性片段,以白念珠菌C1标准株基因组DNA为模板,PCR扩增Set1-208p的编码基因,以pET28a (+) 为载体,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白质表达。用抗His标签的单克隆抗体鉴定融合蛋白,并用确诊侵袭性白念珠菌感染（IC）患者血清进行抗原性鉴定。 结果：成功克隆了白念珠菌抗原特异性H3K4甲基转移酶片段Set1-208p基因并诱导表达,获得了纯化的重组肽段,所得蛋白质分子量（Mr）约为29 000,带有His标签,经western blot鉴定,诱导的重组蛋白可与IC患者血清特异性反应。 结论：成功诱导表达了具有良好抗原反应性的Set1-208p重组蛋白质,为建立相应的抗原、抗体ELISA检测方法提供基础。     

白念珠菌烯醇化酶重组蛋白质的制备及鉴定

目的 制备具有高免疫原性的白念珠菌重组烯醇化酶蛋白质。 方法 以白念珠菌C1标准株基因组DNA作为模板,用PCR法扩增烯醇化酶的全长DNA序列,以pET28a(+)为载体,构建重组表达质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导重组融合蛋白质表达。用抗his标签的单克隆抗体和白念珠菌抗体阳性的病人血清进行western blot鉴定,亲和层析柱纯化重组蛋白质。 结果 获得了含白念珠菌烯醇化酶全长基因的重组表达载体和相应工程菌株,经IPTG诱导后能高效表达重组融合蛋白质。经已含抗体的病人血清进行western blot鉴定,表明诱导的重组蛋白质有良好的免疫原性。 结论 成功克隆了白念珠菌烯醇化酶全长基因并在大肠埃希菌中获得高效表达;重组蛋白质具有良好的免疫原性。     

携带人血管内皮生长因子165基因的复制缺陷型腺病毒载体的构建和鉴定

目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)165基因的重组腺病毒载体。方法:应用EcoRⅠ和XbaⅠ酶切质粒PDC-VEGF和PDC315,连接DNA目的片段后转化大肠杆菌DH5α构建重组质粒PDC315-VEGF,对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体将质粒PDC315-VEGF与质粒pBHGE3共转染293细胞获取重组腺病毒,以重组腺病毒DNA为模板,PCR鉴定构建的重组腺病毒。扩增、浓缩纯化重组腺病毒,微量滴定法测定腺病毒滴度。结果:通过连接反应构建重组质粒PDC315-VEGF,酶切分析和测序证明构建正确。经细胞内同源重组构建携带人VEGF165基因的重组腺病毒,PCR扩增421bpVEGF165片段,证实VEGF165基因成功克隆到复制缺陷型腺病毒载体,腺病毒滴度为5.0×109pfu/mL。结论:通过双质粒细胞同源重组,生产携带人VEGF165基因的重组腺病毒,为动物试验奠定基础。     

人miR-152基因的慢病毒载体的构建及稳定株筛选

目的构建人miR-152基因重组慢病毒载体并筛选稳定表达株。方法 PCR扩增包括miR-152前体所在区域的基因组DNA,克隆到慢病毒载体表达质粒pGIPZ中,得到重组的pGIPZ-miR-152表达载体,通过与包装质粒共转染HEK-293T细胞,获得携带miR-152 minigene的重组慢病毒。用病毒感染HepG2细胞,72 h后用嘌呤霉素筛选。用real-time PCR法检测miR-152基因的表达。结果构建的重组质粒经双酶切验证和测序比对鉴定正确;该质粒转染293T细胞获取的慢病毒滴度达7.5×107TU/mL;用病毒感染HepG2细胞,感染效率达70%以上。药物筛选10 d后,获得的过表达株miR-152表达量比正常细胞高近10倍。结论成功构建人miR-152基因慢病毒载体质粒pGIPZ-miR-152,并筛选出miR-152过表达细胞株,为后续实验奠定基础。     

抑癌基因TCF21重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的：利用大肠杆菌BJ5183细菌内同源重组法构建重组腺病毒pAd-TCF21载体。方法设计TCF21cDNA 扩增引物,从真核表达载体pCMV-SPORT6.1-TCF21中扩增TCF21的DNA序列,与腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV进行连接,构成穿梭质粒pAdTrack-TCF21;然后再用经PmeI酶线性化的pAdTrack-TCF21转化含pAdeasy-1的超感受态AdBJ5183,采用细菌内同源重组法构建腺病毒质粒pAd-TCF21;筛选同源重组质粒阳性克隆,提取pAd-TCF21质粒经PacI酶切鉴定和PCR鉴定。结果线性化的pAdTrack-TCF21转化含pAdeasy-1的超感受态AdBJ5183,12~20h后获得了40%阳性重组质粒克隆,经酶切获得＞23kb的大片段和3.0 kb的特征性片段,PCR反应扩增出了540bp的片段,证明重组腺病毒质粒中已成功插入目的基因TCF21。结论细菌内同源重组法成功构建了含TCF21基因的重组腺病毒质粒,为下一步腺病毒介导的TCF21转染A549细胞的研究打下基础。     

人HSP75基因重组腺病毒载体构建及在C17.2神经干细胞的表达

目的构建HSP75基因重组腺病毒载体,观察HSP75蛋白在C17.2神经干细胞中的表达。方法采用PCR方法从含人HSP75基因质粒中扩增HSP75基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点区域,构建重组穿梭质粒p HBAd-MCM-HSP75-GFP,在LipofiterTM转染试剂的介导下与腺病毒辅助骨架质粒p HBAd-BHGloxΔE1,3 Cre共转染HEK293细胞,整合包装成重组腺病毒,TCID50法测定病毒滴度。使用荧光显微镜、流式细胞仪和Western blotting观察重组腺病毒在C17.2细胞中的感染情况及HSP75蛋白的表达水平。结果通过酶切鉴定、测序、PCR鉴定,HSP75基因已正确插入穿梭质粒中,并与病毒骨架质粒整合包装成重组腺病毒;重组腺病毒滴度为1.0×1010PFU/ml;Western blotting检测,转染后的神经干细胞表达HSP75蛋白。结论 HSP75重组腺病毒载体成功构建,对C17.2神经干细胞具有较高的表达效力。     

重组质粒pEGFP-Brn-4的构建与鉴定

目的构建神经同源盒基因Brn-4真核表达重组质粒。方法从新生SD大鼠脑组织提取总RNA,利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）的方法扩增编码鼠Brn-4的基因片段,应用基因重组技术将鼠Brn-4基因片段克隆到真核表达载体pEGFP-C2中,经BamHI、EcoRⅠ双酶切和单酶切证实所构建的载体。结果 RT-PCR方法获得鼠Brn-4的基因片段,限制性内切酶酶切分析和PCR法鉴定表明为正确重组子。结论新构建的真核表达重组质粒pEGFP-Brn-4通过鉴定,结构正确,为后续研究在神经干细胞中表达及其体内研究奠定了基础。     

急性单核细胞白血病新抗原基因MLAA-34启动子的克隆及其核心区鉴定

目的:克隆急性单核细胞白血病新抗原基因MLAA-34上游启动子序列并检测其活性、鉴定核心区域。方法:PCR扩增MLAA-34基因启动子区全长片段,将其连接至p GL3-Basic载体,克隆重组质粒;构建一系列MLAA-34基因启动子5'侧翼区截短质粒;将含MLAA-34启动子序列的重组质粒及其截短型质粒转染至U937、HEK293细胞,应用双荧光素酶报告基因检测各片段的启动子活性,确定启动子最小活性区域,并通过生物信息学方法分析转录因子结合位点。结果:构建了含有MLAA-34启动子序列的重组质粒及其截短型质粒;与空载体相比,其启动子活性明显增加(P 0. 001)。MLAA-34最小活性区域位于转录起始位点-402 bp至-200 bp之间,其中包含E2F1,MZF-1,SP1,USF2和STAT3等多个转录因子结合位点。结论:成功构建急性单核细胞白血病新抗原基因MLAA-34不同缺失片段的启动子荧光素酶报告基因重组质粒,鉴定出核心启动子区,其中含有多个潜在的转录因子结合序列。     

SARS病毒S蛋白编码基因表达载体的构建及在Vero细胞中的表达

目的构建含SARS病毒S蛋白编码基因片段的表达载体,并将其置于Vero细胞中表达。方法设计1对PCR引物,在其下游引入Flag序列,通过PCR方法从质粒pGEX-6P-1-SARS-S中扩增出S蛋白编码基因,PCR产物经酶切后,插入表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组表达质粒pcDNA3.1(+)-SARS-S。重组质粒经酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析后转染Vero细胞,用抗Flag单克隆抗体通过Western blot检测S蛋白片段在Vero细胞中的表达。结果酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析示重组质粒构建完全正确;Western blot证实重组S蛋白片段能够在Vero细胞表达。结论融合Flag序列的SARS病毒S蛋白片段在Vero细胞中获得了正确表达。     

EGFR基因G719S和T790M突变载体的构建及临床应用研究

目的构建与宫颈癌组织表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因G719S和T790M位点突变型重组载体,利用其建立分子开关平台检测宫颈癌EGFR基因突变。方法以野生型重组质粒为模板,利用重叠PCR技术,得到突变型融合目的 DNA片段,再将此目的片段连接入p MD19-T质粒中,构建成突变型重组载体,将其转化入大肠埃希菌E.coli DH5α感受态细胞进行表达,用菌液PCR和基因组测序进行鉴定。设计特异性检测引物,建立分子开关检测平台用于临床宫颈癌样本的检测。结果通过基因组测序证实G719S和T790M突变位点成功引入,定点突变载体构建成功。成功建立了分子开关检测平台用于宫颈癌组织DNA的检测。结论利用重叠PCR技术简便、高效地构建了EGFR基因突变重组载体,并建立了分子开关检测平台,为基因定点突变及临床上检测EGFR基因突变提供了新的技术手段。     

慢性髓性白血病bcr／abl融合基因的克隆与表达

目的：克隆bcr／abl融合基因融合位点基因片段。方法：以慢性粒细胞白血病（CML）K562细胞株总RNA作为模板,采用RT—PCR方法扩增包含Bcr／abl（b3a2）融合位点基因片段。将RT—PCR物按正确的阅读框架,定向克隆到pEGFP—N3的下游,将重组质粒转化大肠杆JM109大肠杆菌,用PCR初筛,将PCR扩增阳性的重组子用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切鉴定,并进行序列的测定。结果：扩增出470bp的Bcr／abl融合位点基因片段,构建重组质粒pEGFP—bcr／abl,酶切产物的大小分别与预期相符。结论：成功地扩增bcr／abl融合位点基因片段及构建真核表达重组质粒pEGFP—bcr／abl,为在体外表达重组bcr／abl蛋白奠定基础。     

携带HIV-1vpr基因的重组腺病毒的构建与鉴定

目的　构建携带HIV 1vpr基因的重组腺病毒 ,为进一步基因治疗的实验研究奠定基础。方法　利用AdEasy 1系统 ,通过含有目的基因片段vpr的穿梭载体pShuttle CMV/vpr和骨架质粒pAdEasy 1在细菌内同源重组的方法构建重组腺病毒质粒pAdCMV/vpr。将重组质粒转染 2 93细胞包装出重组腺病毒rvAdCMV/vpr。利用PCR等方法对重组腺病毒进行鉴定。结果　获得表达vpr蛋白的重组腺病毒。结论　成功构建出携带HIV 1vpr基因的重组腺病毒 ,为更深入的基因治疗研究奠定了基础。     

三元复合因子Net嵌合型重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:克隆人三元复合因子Net全长基因,构建其重组腺病毒载体。方法 :抽提正常人胰腺组织中总RNA,经RT-PCR扩增出全长Net基因,利用同源重组的方法将腺病毒骨架质粒pBHG35和穿梭质粒pDC316-Net共转染293细胞,获得腺病毒重组质粒Ad5/F35-Net,在293细胞中包装和扩增后,获得高滴度的腺病毒重组质粒Ad5/F35-Net。采用PCR和蛋白印迹法检测Net基因的表达。结果 :用RT-PCR方法 ,从人胰腺癌组织中扩增出1224 bp的cDNA片段,经测序证实为人Net基因。最终构建及包装出高滴度的重组腺病毒载体Ad5/F35-Net。结论:成功克隆了人Net全长基因,并构建其重组腺病毒表达载体,为进一步研究人Net基因在相关肿瘤疾病中的生物学作用奠定了基础。     

含人p27基因的重组腺病毒的构建及鉴定

目的:构建并鉴定含有人p27基因和EGFP基因的重组腺病毒载体,并观察其表达.方法 利用腺病毒载体系统Adeno-X,通过质粒抽提、电泳、酶切、连接、转化等多种基因工程技术,构建重组腺病毒质粒pAdeno-p27-EGFP;酶切、PCR鉴定重组腺病毒质粒;利用293细胞包装重组腺病毒载体PAd-p27-EGFP,通过荧光倒置显微镜观察EGFP的表达.结果:经酶切和PCR鉴定,成功构建重组腺病毒质粒pAdeno-p27-EGFP,利用脂质体转染人293细胞后,转染腺病毒质粒pAdeno-p27-EGFP可见EGFP表达和细胞致病效应(CPE).结论:利用腺病毒载体系统Adeno-X成功构建含CMV启动子的Flag-p27和EGFP基因的腺病毒载体,为进一步研究细胞周期调控与慢性移植物失功之间的关系,并为寻找慢性移植物失功的基因治疗的途径奠定基础.     

SARS病毒M蛋白真核表达载体的构建与表达

目的 构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并检测其在Vero细胞中的表达.方法 在PCR引物下游引入Flag序列,以PCR从质粒pGEX-6P-1-SARS-M中扩增M蛋白编码基因片段,将酶切后的PCR产物克隆至pcDNA3.1(+)中,构建并鉴定重组质粒pcDNA3.1(+)-SARS-M.重组质粒经Superfect转染Vero细胞,Western blot检测基因表达情况.结果 重组质粒经酶切鉴定和基因测序显示构建正确;Western blot检测表明重组M蛋白片段在Vero细胞中获得正确表达.结论 成功构建SARS病毒M蛋白片段真核表达载体,并在Vero细胞中获得正确表达,为进一步研究M蛋白的功能奠定了基础.