粪肠球菌介导的细粒棘球绦虫重组Efs-Eg95-EgA31疫苗的构建、鉴定及表达北大核心CSCD

目的构建粪肠球菌(Efs)为载体的细粒棘球绦虫重组Efs-Eg95-EgA31疫苗,并研究其表达效率。方法采用电穿孔技术将重组质粒pGEX-Eg95-EgA31转化粪肠球菌ATCC47077株,构建rEfs-Eg95-EgA31疫苗,抽提质粒进行PCR扩增鉴定;经IPTG诱导后进行10%SDS-PAGE和Western blot等分析和鉴定表达产物。结果以从rEfs抽提的质粒为模板进行PCR可扩增出约1016 bp的Eg95-EgA31融合基因片段,SDS-PAGE显示表达产物为62.5 ku的重组蛋白,表达蛋白约占菌体总蛋白的11%;Western blot表明重组蛋白能被细粒棘球蚴感染的鼠血清识别。结论成功构建了细粒棘球绦虫rEfs-Eg95-EgA31疫苗,表达的融合蛋白具有特异的抗原性。     

细粒棘球绦虫Eg18基因的克隆 表达和重组抗原免疫检测的初步评价

目的克隆、表达细粒棘球绦虫Eg18基因,评价重组蛋白的免疫反应性。方法根据已知Eg18基因序列,利用RT-PCR方法从青海绵羊肝棘球蚴原头节提取的总RNA中扩增目的基因,克隆到原核表达质粒pET-28a（＋）中,转化大肠埃希菌BL21（DE）,IPTG诱导表达。表达产物经亲和层析纯化,用免疫印迹试验（Western blot）和酶联免疫吸附试验（ELISA）初步评价其与棘球绦虫及其他蠕虫感染血清的反应性。结果 RT-PCR扩增产物编码的蛋白质序列与GenBank中的Eg18和Em18完全相同。重组蛋白与多种蠕虫病人血清中的IgG和IgG4均有交叉反应,但检测IgG4时,与其他蠕虫的交叉反应显著降低。结论 Eg18/Em18是细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的共同抗原,其特异性IgG4是泡型棘球蚴病较特异的诊断标志物。     

新疆株细粒棘球绦虫不同发育阶段95抗原基因克隆及序列分析

目的研究细粒棘球绦虫95抗原(Eg95)基因在新疆株细粒棘球绦虫不同发育阶段的表达及其基因序列差异。方法根据Eg95基因序列设计引物,用PCR方法分别从新疆株细粒棘球绦虫3个不同发育阶段(原头蚴、六钩蚴和成虫)所构建的cDNA文库中克隆获得Eg95目的基因,将其克隆至pUCm-T载体、测序并进行序列分析。结果从3个不同发育阶段的新疆株细粒棘球绦虫cDNA文库中均克隆出Eg95基因,其基因片段长度为402bp,同源性比对分析(BLAST)结果表明,所克隆的新疆株Eg95基因与GenBank中的Eg95基因序列一致。结论Eg95基因在新疆株细粒棘球绦虫不同发育阶段均有表达,其基因序列无差异。     

细粒棘球蚴Eg95重组蛋白表达及其血清学反应的研究

目的 诱导表达和纯化细粒棘球蚴Eg95抗原重组蛋白,对其与CE病人血清学反应情况进行研究.方法 IPTG诱导pET28a-Eg95原核表达质粒,表达和纯化Eg95重组蛋白,SDS-PAGE 电泳对其进行初步鉴定,Western blot法检测其与中间宿主CE病人血清学反应情况.结果 pET28a-Eg95重组蛋白得到成功表达,SDS-PAGE 电泳显示相对分子量约为15kDa.Western blot 结果 表明,pET28a-Eg95重组蛋白能被CE病人血清识别,11例CE病人血清中8例呈阳性反应.结论 细粒棘球蚴Eg95抗原存在于中间宿主CE病人体内,Eg95蛋白作为保护性抗原可能成为CE病人术后辅助性治疗的手段之一.     

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31融合基因疫苗构建及鉴定

目的构建和鉴定细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95-EgA31融合基因疫苗。方法自行设计引物,从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后提取总RNA为模板,通过RT-PCR分别扩增Eg95和EgA31抗原编码基因,然后采用基因拼接法(gene SOEing)剪接Eg95和EgA31,得到Eg95-EgA31融合基因,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切,定向克隆到大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,构建重组质粒pGEX-Eg95-EgA31,抽提质粒进行双酶切鉴定,电穿孔法转化两歧双歧杆菌(Bifidobacteria bifidum,Bb),构建细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31融合基因疫苗,抽提质粒进行PCR扩增鉴定。结果RT-PCR扩增出约1 016bp的Eg95-EgA31融合基因;重组质粒用双酶切鉴定可切出预期大小片段,以具有氨苄青霉素抗性的rBb中抽提的质粒为模板进行PCR扩增可得到约1016bp的Eg95-EgA31融合基因片段。结论成功构建了细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31融合基因疫苗,为该疫苗的开发利用奠定了实验基础。     

细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95-EgA31质粒构建及鉴定

目的构建并鉴定细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95-EgA31质粒。方法从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后抽提总RNA为模板,采用RT-PCR方法分别扩增Eg95和EgA31编码基因,然后采用基因拼接法(gene SOEing)扩增Eg95-EgA31融合基因;将该融合基因定向克隆到植物表达载体pBI121中构建pBI-Eg95-EgA31重组质粒;电穿孔转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,At)LBA4404株,抽提质粒进行酶切及PCR鉴定。结果电泳及测序证实1 016bpEg95-EgA31融合基因克隆成功。经酶切及PCR证实重组质粒pBI-Eg95-EgA31成功转入根癌农杆菌。结论成功构建了细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95-EgA31质粒,为进一步构建细粒棘球绦虫转基因植物疫苗奠定了基础。     

细粒棘球绦虫烯醇酶基因克隆 表达及免疫诊断研究

目的克隆表达细粒棘球绦虫烯醇酶(EgEno)基因,并对其免疫诊断价值进行初步评价。方法从细粒棘球绦虫cDNA中扩增目的基因,克隆入表达载体pET28a,转化E.coliBL21(DE3),经异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,进行SDS PAGE和免疫印迹法鉴定;采用细粒棘球蚴病及其他几种寄生虫病患者的血清和健康人血清,通过ELISA法评价重组EgEno抗原的免疫诊断效果。结果重组质粒pET28a EgEno构建成功。SDS PAGE和免疫印迹法结果显示,重组蛋白在E.coliBL21(DE3)中获得高效表达,重组蛋白EgEno相对分子量约为50 kDa,可被细粒棘球蚴病患者血清识别。EgEno对细粒棘球蚴病患者血清的免疫诊断敏感性为81.25%。结论克隆出细粒棘球绦虫EgEno基因并在E.coliBL21(DE3)中表达,重组EgEno对细粒棘球蚴病有较好的免疫诊断价值。     

细粒棘球绦虫Eg95抗原编码基因在BCG中的表达效率研究

目的 探讨细粒棘球绦虫Eg95抗原在BCG中的表达，为囊型包虫病疫苗的开发利用提供依据。方法 用热诱导方法诱导rBCG-Eg95疫苗，用SDS-PAGE和Western blot鉴定所表达的蛋白。结果 表达重组蛋白为可溶性蛋白，分子质量单位为16．5ku。Western blot示重组蛋白具有抗原性，用薄层扫描Bio-Rad Quantity one分析系统分析，表达效率为占BCG菌体总蛋白的12％。结论 细粒棘球绦虫Eg95抗原在BCG中成功表达，为BCG发展为多价疫苗载体奠定了基础。     

细粒棘球蚴(中国大陆株)抗原zw-5基因的表达、纯化及免疫学特性初步分析

目的对细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus,Eg)抗原zw-5重组质粒进行原核表达、纯化,并初步分析重组蛋白的免疫学特性。方法从重组质粒Eg.zw-5/pGEM-T中获取抗原zw-5基因,亚克隆于表达载体pET-28a构建基因工程菌株,并表达、纯化重组蛋白;用Eg.zw-5免疫ICR小鼠,通过Western-blot、ELISA对Eg.zw-5的免疫学特性进行初步研究。结果构建原核重组表达基因工程菌株Eg.zw-5/pET-28a/BL21(DE3)plysS,并纯化出分子量为28kD的重组蛋白。West-ern-blot显示,Eg.zw-5免疫的小鼠血清能识别重组蛋白和天然抗原原头蚴中约28KD处的条带。ELISA检测显示,用Eg.zw-5免疫小鼠,可诱导产生特异性抗体IgG。结论成功表达细粒棘球蚴重组抗原Eg.zw-5,该重组蛋白有较好的免疫原性及抗原性。     

细粒棘球蚴特异性抗原基因P-29的原核表达及免疫学鉴定

目的对细粒棘球蚴P-29基因进行克隆、表达和免疫反应性分析。方法以细粒棘球蚴总RNA为模板,反转录PCR扩增P-29基因,将其克隆至原核表达载体pET44a(+)中,构建重组原核表达载体pET-P-29,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察重组蛋白的表达情况,用蛋白纯化试剂盒纯化蛋白,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白与细粒棘球蚴病患者血清的免疫反应性。结果PCR、双酶切和DNA测序结果表明,重组质粒pET-P-29构建成功。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白Nus-P-29的相对分子质量(Mr)约为93000,纯化后的蛋白浓度为0.78mg/ml。重组蛋白Nus-P-29能被细粒棘球蚴病患者血清识别。结论细粒棘球蚴P-29基因表达成功,纯化后的重组蛋白Nus-P-29具有较强的免疫反应性。     

细粒棘球蚴Eg10基因的克隆、表达及免疫特性研究

目的克隆、表达细粒棘球蚴分离株Eg10基因,并研究其重组蛋白的免疫特性。方法将细粒棘球蚴Eg10基因亚克隆于表达载体pET28a,转化重组质粒至大肠埃希菌BL21进行融合表达,His-bind树脂纯化系统纯化重组融合蛋白,以之作为抗原免疫小鼠。48只ICR小鼠随机均分为4组,A、B组为对照组,分别注射不含抗原的磷酸盐缓冲液(PBS)和福氏佐剂+PBS,每鼠皮下注射100μl。C、D组为免疫组,注射用福氏佐剂乳化的重组抗原Eg10,抗原量分别为0.1mg/μl和0.5mg/μl,每鼠皮下注射100μl。各组小鼠每隔2周免疫1次,共免疫3次。于免疫前和免疫后2、4、6、8和10周采血以获得抗血清。通过蛋白质印迹(Westernblotting)分析和ELISA检测重组抗原的免疫学特性。结果成功构建含目的片段Eg10的基因工程菌株。Westernblotting分析结果表明,免疫血清能识别重组抗原Eg10。ELISA检测结果显示,用重组蛋白免疫小鼠可诱导产生特异性抗体。统计学分析表明,免疫后C、D组抗体水平逐渐升高,至第8周抗体滴度达最高值,分别为(1.143±0.253)和(1.254±0.070);A、B组抗体一直维持在较低水平。第2、4、6、8和10周,A、B与C、D组间抗体水平差异有统计学意义(均P0.05),C、D组间差异无统计学意义(P0.05)。结论成功表达细粒棘球蚴重组蛋白Eg10,该蛋白有一定的免疫原性。     

细粒棘球绦虫原头蚴和成虫发育调控基因Ras GTPase的克隆及序列分析

应用RT-PCR方法分别从新疆株细粒棘球绦虫原头蚴和成虫中克隆出Eg Ras GTPase基因,分别命名为Eg Ras-pro（GenBank登录号为EU560397）和Eg Ras-adult（GenBank登录号为EU560398）。 生物信息学分析表明两者cDNA长度均为552 bp,编码184个氨基酸,等电点（pI）为6.54,彼此间仅有2个碱基和1个氨基酸的差别。同源性比对分析结果显示,Eg Ras-pro和Eg Ras-adult与多房棘球绦虫Ras（EmRas）基因的同源性分别高达98.4%和98.9%;与其他种类的寄生虫、酵母、果蝇及人类的Ras GTPase基因的同源性为53.9%～78.8%。进化树分析发现Eg Ras-pro和Eg Ras-adult与EmRas和血吸虫Ras（SmRas）相聚集。本研究首次从新疆株细粒棘球绦虫两个发育阶段（原头蚴和成虫）中克隆出Eg Ras GTPase基因,其序列具有较高的保守性。     

细粒棘球蚴亲肌肉抗原在小鼠中的免疫保护力研究

目的 对细粒棘球蚴亲肌肉抗原(myophilin antigen)进行原核表达、纯化并用小鼠实验评价其免疫学特性. 方法 提取总RNA,构建克隆质粒Eg myophilin/pGEM-T,然后将亲肌肉抗原基因亚克隆于表达载体pET28a,进行诱导表达;纯化重组蛋白并免疫小鼠.利用Western blot、ELISA鉴定其免疫学特性,并通过包囊计数,评价其免疫保护力. 结果 成功构建原核重组表达载体Eg myophilin/pET28a,并表达、纯化出浓度较高的亲肌肉抗原.ELISA检测显示,用纯化的亲肌肉抗原免疫小鼠,诱导产生了特异性抗体;Western blot鉴定该抗体能识别重组抗原及原头蚴.攻击感染实验表明亲肌肉抗原免疫小鼠的包囊数为0.93±2.1,对照组为7.13±10.21,两者差异有统计学意义,获得的保护力约为94.4%. 结论 成功表达细粒棘球蚴亲肌肉抗原,纯化后的重组蛋白具有抗原性和免疫原性,有望作为棘球蚴病疫苗候选分子.     

细粒棘球蚴95(Eg95)抗原基因的克隆及真核表达质粒的构建

目的　克隆Eg95抗原基因 ,构建携带目的基因的真核表达载体 ,为细粒棘球蚴DNA疫苗的研究提供材料。方法　应用PCR方法从细粒棘球蚴cDNA文库中克隆获得Eg95抗原基因 ,将其克隆至 pUCm -T载体 ,测序确定其正确性。利用定向克隆技术将Eg95抗原基因片段克隆至真核表达质粒pcDNA3上 ,根据选择标记的氨苄抗性基因筛选到阳性克隆 ,通过酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆 ,测序确定序列。结果　测序表明所选 pcDNA3-Eg95阳性克隆均为正确连接Eg95抗原基因的重组质粒 ,可以作为DNA疫苗作进一步的研究。结论　成功构建真核细胞表达载体 pcDNA3-Eg95。     

棘球蚴AgB抗原家族基因的克隆及抗原表位的预测分析

目的对棘球蚴AgB抗原家族的不同亚单位基因进行克隆,并对序列进行生物信息学分析和抗原表位预测分析。方法根据GenBank中的参考序列设计特异性引物,以我国新疆、甘肃和四川来源的细粒棘球蚴(Eg)和多房棘球蚴(Em)虫体DNA为模板扩增目的基因,将PCR产物克隆到TA载体中测序。用Bioedit分析软件和Blastn、NPS@和IEDB等在线分析系统对序列进行分析。结果分别从细粒棘球蚴和多房棘球蚴中克隆获得AgB抗原的全部5个亚单位基因,经测序确定为正确的目的序列;序列比对分析表明,EmAgB的5个亚单位基因序列高度保守,而EgAgB的亚单位基因变异性较大。细粒棘球蚴和多房棘球蚴种间差异分析显示,相同亚单位基因的序列一致性为87.69%～100%。AgB各亚单位抗原主要的二级结构包括α-螺旋、β-折叠和无规卷曲等3个类型。其中,AgB1、AgB2和AgB4等3个亚单位抗原中无规卷曲所占比例较高。AgB各亚单位抗原预测表位区共10个,分别是AgB1:1～7和21～27,AgB2:1～7和29～36,AgB3:1～11和18～28,AgB4:1～13、27～37和39～60,AgB5:1～11。结论 EgAgB和EmAgB亚单位抗原表位区的大部分序列一致或相似,预测的10个表位区主要位于序列N端。在5个亚单位抗原中,AgB1、AgB2和AgB4的抗原性较高。     

细粒棘球绦虫Eg95重组非分泌型和分泌型分枝杆菌疫苗的构建

目的分别构建细粒棘球绦虫Eg95重组非分泌型和分泌型卡介苗及耻垢分枝杆菌疫苗。方法分别以卡介苗(BCG)基因组DNA和PGEX-4T-Eg95为模板,PCR扩增获120bp的BCG抗原85B信号肽序列和423bp的Eg95基因序列。先将Eg95基因序列定向克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒pMV261,构建非分泌型重组质粒pMEg95。再将BCG-Ag85B信号肽序列定向克隆至pMEg95,构建分泌型重组质粒pSMEg95。电穿孔法将两型重组质粒分别导入BCG菌及耻垢分枝杆菌。结果双酶切、PCR扩增及测序鉴定证实,克隆基因Eg95序列和Ag85B信号肽序列正确插入载体PMV261,细粒棘球绦虫Eg95重组非分泌型和分泌型分枝杆菌疫苗构建成功。结论构建了含有Eg95基因序列和BCG-Ag85B信号肽序列的细粒棘球绦虫Eg95重组非分泌型和分泌型分枝杆菌疫苗。     

细粒棘球绦虫抗原B重组蛋白的免疫反应性

目的 利用基因工程方法表达细粒棘球绦虫抗原B重组蛋白（rAgB）,并分析其免疫反应性。 方法 将rAgB基因片段插入原核表达载体pET41a（+）中,转化大肠埃希菌BL21（DE3）菌株,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,获得重组蛋白rAgB-GST。用谷胱甘肽琼脂糖树脂亲和层析柱（GST-sepharose 4B）纯化,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析重组蛋白的表达情况。用蛋白质印迹（Western blotting）分析其免疫反应性,并用免疫胶体金包虫诊断试剂盒作为对照。 结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均显示重组质粒pET41a-rAgB构建成功。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白rAgB-GST的相对分子质量（Mr）为40 800,纯化蛋白含量为78.4%。Western blotting分析结果显示,重组蛋白rAgB-GST检测细粒棘球蚴病和多房棘球蚴病患者血清的阳性率分别为79.2%（95/120）和51.1%（23/45）,但与卫氏并殖吸虫病患者、华支睾吸虫病患者血清以及健康人血清反应均为阴性。rAgB-GST的敏感性和特异性分别为79.2％（95/120）和81.0%（98/121）,均略高于免疫胶体金棘球蚴病诊断试剂盒的敏感性(72.8%,75/103）和特异性（76.9%,30/39）。 结论 重组rAgB-GST蛋白可被细粒棘球蚴病和多房棘球蚴病患者血清识别,有较好的免疫反应性。     

牛带绦虫亚洲亚种乳酸脱氢酶基因的克隆表达及免疫原性分析

目的 对牛带绦虫亚洲亚种成虫乳酸脱氢酶基因（LDH）进行克隆、表达和免疫原性分析。 方法 将牛带绦虫亚洲亚种成虫TaLDH克隆到原核表达质粒pET-30a（+）中,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,表达产物通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白pET-30a（+）-TaLDH用蛋白质印迹（Western blotting）分析其免疫原性。 结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均显示重组质粒pET-30a（+）-TaLDH构建成功。SDS-PAGE结果表明,目的基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得高效表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白,浓度为0.9 mg/ml。Western blotting分析结果显示,重组蛋白pET-30a（+）-TaLDH能识别感染牛带绦虫亚洲亚种的猪血清和患者血清,在相对分子质量(Mr)35 000处有一清晰条带,表明其具有免疫反应性。 结论 牛带绦虫亚洲亚种成虫乳酸脱氢酶基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的高效表达。     

肝片吸虫组织蛋白酶L基因的克隆、表达和免疫原性分析

目的 克隆和表达肝片吸虫组织蛋白酶 L 基因（FhCL）,分析其免疫原性。 方法 根据GenBank公布的FhCL基因序列设计引物,以肝片吸虫总RNA为模板,通过RT-PCR扩增FhCL基因编码序列,PCR产物经TA克隆,通过EcoRⅠ、HindⅢ双酶切和测序鉴定获得重组质粒pMD18-T/FhCL,并将其亚克隆入原核表达载体pET30a（+）,经PCR,以及BamHⅠ、HindⅢ双酶切和测序鉴定,构建原核表达质粒pET30a（+）-FhCL,转化大肠埃希菌(E. coli)BL21（DE3）pLysS,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达并获得纯化的重组蛋白FhCL,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定,以及蛋白质印迹（Western blotting）分析该重组蛋白对感染肝片吸虫的山羊血清及免疫的SD大鼠血清的免疫反应性。结果 PCR和BamHⅠ、HindⅢ双酶切均可见约1 000 bp的条带,测序结果显示重组质粒pET30a（+）-FhCL构建成功。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白相对分子质量约为 Mr 42 000（含6个组氨酸标签）,与目的蛋白相符,以包涵体形式表达。Western blotting分析结果显示,纯化的重组蛋白FhCL可被感染肝片吸虫的山羊血清和免疫的SD大鼠血清识别,在目的条带Mr 42 000处见单一特异性条带,而阴性对照血清则无反应带。 结论 克隆及表达了肝片吸虫组织蛋白酶 L 编码基因,重组蛋白具有良好的免疫原性。     

美洲大蠊精氨酸激酶基因的克隆、表达及变应原活性测定

目的 克隆美洲大蠊（Periplaneta americana）精氨酸激酶(arginine kinase，AK)基因并表达、纯化具有变应原活性的重组AK。 方法 提取美洲大蠊总RNA，设计特异引物，通过RT-PCR克隆美洲大蠊AK基因目的片段，测序后将该片段克隆入原核表达载体pET-28a，转化至大肠埃希菌（E. coli） BL21（DE3），经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，获重组AK。用镍离子（Ni²⁺）亲和层析柱纯化，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析重组AK表达情况。用蛋白质印迹分析（Western blotting）（变性条件）和ELISA（非变性条件）检测重组AK变应原与过敏患者血清IgE结合活性，并以健康人血清为对照。 结果 测序结果表明，AK基因含有1 068 bp的开放阅读框，编码356个氨基酸（登录号为EU429466）。与GenBank公布的序列（登录号为AY563004）比较同源性达99.9%。SDS-PAGE分析表明, 该变应原基因在E. coli中主要以可溶形式高水平表达，相对分子质量约为Mr 45 000。重组变应原AK在变性与非变性条件下，与过敏患者血清IgE均具有良好的结合活性，与健康人对照组之间的差异具有统计学意义（P＜0.05）。 结论 获得了具有变应原活性的重组美洲大蠊精氨酸激酶。