腺病毒介导的CD-TK融合基因联合GCV和/或5-Fc对人膀胱癌细胞的杀伤作用

目的：研究腺病毒介导的CD—TK融合基因联合前体药物对人膀胱癌细胞的杀伤作用。方法：利用含有CD—TK融合基因及绿色荧光蛋白（GFP）基因的复制缺陷腺病毒转染人膀胱癌细胞株T-24细胞,GFP表达可作为转染是否成功的间接标志,PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳检测转染后细胞CD及TK基因序列的表达情况。用丙氧鸟苷（GCV）和／或5氟胞嘧啶（5-FC）,作为前体药物,以四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测其对转染后T-24细胞的杀伤作用及旁观者效应。结果：腺病毒在体外能高效转染T-24细胞,72h转染效率可接近100％。GCV和／或5-FC均能有效杀伤转染后膀胱癌细胞,给予相同浓度前体药物时,联合用药组显示出较强的肿瘤杀伤作用。0．5mg／ml GCV、0．1mg／ml 5-Fc和GCV＋5-Fc作用于转染后T-24细胞72h细胞生存率分别为23．30％、20．63％、10．10％。旁观者效应杀伤实验表明5-Fc组较GCV旁观者效应明显,而联合用药组显示出更强的旁观者效应。利用Hoechst-PI双染色法检测经前体药物作用后转染细胞,各组均可见凋亡细胞,但联合用药组凋亡细胞较单一用药组多。结论：CD—TK融合基因联合应用GCV和／或5-Fc能有效杀伤膀胱肿瘤细胞,并存在较强的旁观者效应,其杀伤机制可能与凋亡相关,为适用于人膀胱癌的治疗提供一条新思路。     

辐射敏感性启动子调控CD基因表达联合125I照射对膀肤癌EJ细胞的杀伤作用

以脂质体介导的辐射敏感性基因联合胞嘧啶脱氨酶(cytosine deantinase,CD)基因转染膀胱癌EJ细胞,研究放射性核素125 I照射后5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)对转染膀胧癌EJ细胞的杀伤作用.人工合成辐射敏感性启动子E8,将启动子克隆至质粒pCD2的CD基因上游,构建以E8为...     

AFP启动子驱动的yCD/TK双自杀基因靶向杀伤肝癌细胞的体内外研究

目的： 研究携带甲胎蛋白（AFP）启动子的酵母菌胞嘧啶脱氨酶/胸苷激酶（yCDglyTK）双自杀基因体内外靶向性杀伤肝癌细胞的效果和机制。方法: 构建携带AFP启动子的yCD/TK双自杀基因表达质粒。通过阳离子脂质体将携带AFP启动子的yCD/TK双自杀基因转染HepG2和SMMC7721细胞,用MTT法测定不同浓度氟胞嘧啶（5-FC）、更昔洛韦（GCV）及联合治疗的杀伤作用,用流式细胞仪检测细胞周期。建立裸鼠肝癌皮下种植瘤模型,观察自杀基因体内杀瘤效果以及细胞凋亡的情况。结果: 成功构建的携带AFP启动子的yCD/TK双自杀基因靶向性地在AFP阳性的HepG2细胞上表达,而AFP阴性的SMMC7721细胞无表达,GCV、5-FC及两者联合可有效抑制HepG2细胞生长,随药物浓度的增高而杀伤作用增强,药物间抑瘤效果比较是GCV＋5-FC＞5-FC＞GCV,而SMMC7721细胞的生长未受影响。体内实验可见GCV、5-FC及两药联合对转染后的HepG2细胞种植瘤有明显的抑制效果,并检测到明显的细胞凋亡,而对SMMC7721细胞种植瘤的生长无影响,种植瘤内极少凋亡细胞。结论: 携带AFP启动子的yCD/TK双自杀基因能有效地靶向性地杀伤AFP阳性的肝癌细胞,细胞凋亡可能是其杀伤的重要机制之一。     

辐射敏感性启动子调控CD基因表达联合125I照射对膀肤癌EJ细胞的杀伤作用

以脂质体介导的辐射敏感性基因联合胞嘧啶脱氨酶(cytosine deantinase,CD)基因转染膀胱癌EJ细胞,研究放射性核素125 I照射后5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)对转染膀胧癌EJ细胞的杀伤作用.人工合成辐射敏感性启动子E8,将启动子克隆至质粒pCD2的CD基因上游,构建以E8为启动子、CD基因为目的基因的新质粒,并采用DNA测序法测定E8和CD基因的序列;脂质体Lipofectamine2000介导pE8-CD转染膀胧癌EJ细胞,用[3]I照射(吸收剂量为2舜)后,蛋白质免疫印迹分析(Western blot)测定CD蛋白表达;在转染EJ细胞中分别加人不同剂量125 I勺和5-FC,四哇盐比色法(MTT法)测定各组细胞存活率,并以未经125 I勺照射组、未加5-FC组和5-氟尿啼吮(5-FU)组(阳性对照组)进行对照.DNA测序显示构建的pE8-CD质粒含E8启动子及CD基因序列;Westem blot可检测到CD基因表达;125 I加5-FC组细胞存活率明显低于未经125 I照射组及未加5-FC组,与5-FU组相近.这表明放射性核素与基因治疗联合对肿瘤细胞具有协同杀伤作用.     

B7-2基因联合自杀基因治疗乳腺癌移植瘤模型

目的观察树突状细胞活化抗原B7-2基因联合自杀基因系统EC-CD/5-FC于实验性乳腺癌的体、内外治疗的协同作用。方法用重组腺病毒构建CD和B2-7载体,体外感染人乳腺癌MCF-7细胞,荧光显微镜观察其感染率。然后给与前药5-FC,通过MTT法检测MCF-7细胞的增殖情况;Annexi V-FTTC/PI双染流式细胞术检测MCF-7细胞的细胞周期。BALB/C小鼠腋窝下注射MCF-7细胞制备乳腺癌移植瘤模型,待肿瘤直径达0.5 cm大小,分别在肿瘤局部直接注射Ad CD/B7-2,然后连续10 d腹腔注射5-氟胞嘧啶(5-FC),免疫组化法检测肿瘤组织中CD8+T表达。结果 MTT法检测显示MCF-7细胞对前药有较高的敏感性,Ad CD/5-FC/Ad B7-2和Ad CD/5-FC组MCF-7细胞的增殖均受到明显抑制(P<0.05);而Ad B7-2治疗基因对MCF-7细胞的增殖没有任何影响。在感染复数为100时流式细胞仪检测,Ad CD/5-FC/Ad-B7-2组和Ad CD/5-FC组均出现典型的凋亡峰,细胞周期分析显示治疗后G0~G1期比率增多,G2~M及S期细胞减少。在MCF-7移植瘤模型中,Ad CD/5-FC/Ad-B7-2治疗后移植瘤的生长明显受到抑制;肿瘤瘤体内或瘤体周围CD8+T细胞浸润增加。结论 B7-2联合自杀基因系统对乳腺癌MCF-7细胞及其MCF-7细胞移植瘤均有明显的抑制作用,B7-2联合自杀基因Ad CD/5-FC系统时,共刺激分子B7-2可通过增强和诱导的特异抗肿瘤免疫,有效减少肿瘤负荷,增强Ad-CD/5-FC系统对肿瘤的杀伤作用。     

5-氟胞嘧啶对胞嘧啶脱氨酶基因修饰的胰腺癌细胞凋亡的诱导作用

目的:探讨5-氟胞嘧啶(5-FC)对基因修饰的胰腺癌细胞凋亡的影响及特征。方法: 以腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶(CD)基因转染胰腺癌SW1990细胞,以Western blot检测目标基因蛋白水平表达,通过细胞形态学、脱氧核糖核酸(DNA)凝胶电泳和流式细胞术观察5-FC对表达CD基因的SW1990细胞凋亡的影响作用。结果: 以含CD基因的重组腺病毒转染的SW1990细胞,给予5-FC100 μmol·L^-1, 培养48 h,细胞出现典型的凋亡形态、DNA梯形改变及凋亡峰, 细胞在G₁,S 和G₂/M各期分别为64%、11%和7%,凋亡率达34.6%。结论:5-FC的上述诱导凋亡作用可能是胰腺癌CD基因疗法的重要机制。     

酵母菌胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶自杀基因系统对人原代T细胞的作用

目的:酵母菌胞嘧啶脱氨酶基因(YCD)是新型自杀基因,利用重组逆转录病毒载体(RV),将YCD高效导入人原代T细胞,并在体内外探讨转基因T细胞的功能及"自杀"效应。方法:构建RV载体MSCV-YCD-puroR,瞬时质粒共转染法制备RV,流动感染法或Retronectin 离心法感染人原代T细胞,嘌呤霉素筛选获得T-YCD-puroR,检测转基因T细胞对肿瘤细胞的杀伤及细胞因子分泌功能,在体外和SCID小鼠体内,探讨前体药物5氟胞嘧啶(5-FC)对T-YCD-puroR细胞的杀伤效应等。结果:病毒滴度为(5.0±3.7)×106TU/mL。流动转染法对人原代T细胞的基因导入率46.0%±9.6%,2轮离心 Retronectin法的基因导入率为60.3%±7.6%(n=3)。经嘌呤霉素筛选48h获得T-YCD-puroR细胞,其基因阳性率96.7%±1.5%,并可大量扩增。与野生T细胞比较,T-YCD-puroR细胞杀伤K562肿瘤细胞的能力及细胞因子分泌功能无统计学意义。体外实验显示,与野生T细胞比较,T-YCD-puroR细胞对puromycin的IC50上升了304.9倍(0.071mg/Lvs22.3mg/L),对5-FC的IC50下降了133.3倍(656.0μmoL/Lvs4.9μmoL/L)。T-YCD-puroR细胞静脉接种于SCID小鼠,7d后每只小鼠腹腔注射5μmoL的5-FC,连续7d,首次给药24h后即可观察到SCID小鼠外周血中CD45 细胞显著下降(P<0.01)。结论:YCD自杀基因导入对人原代T细胞功能无显著影响,T-YCD-puroR细胞可以在体内外被5-FC有效杀伤。本研究为进一步研究打下了良好的基础。     

WTP53联合双自杀基因CD和TK抑制结肠癌细胞SW480生长

目的探讨野生型P53(WTP53)基因联合双自杀基因CD、TK对P53突变的SW 480结肠癌细胞的体外生长抑制作用、旁观者效应以及联合基因应用的效果。方法将P53的表达载体pCMV-P53转染SW 480细胞;用含有CD、TK双自杀基因的反转录病毒感染SW 480,得到稳定转染的阳性克隆。RT-PCR鉴定目的基因的表达。绘制细胞生长曲线等方法观察不同混合条件下WTP53、TK、CD系统的联合应用效应和药物相互作用指数。结果SW 480/P53细胞倍增时间明显延长。SW 480/TK-CD细胞对前体药物丙氧鸟苷(GCV)、5-氟胞嘧啶(5-FC)呈剂量依赖性的细胞生长抑制作用。SW 480/P53和SW 480/TK-CD混合细胞的生长抑制作用、旁观者效应和药物相互作用最显著。结论WTP53基因和TK/GCV、CD/5-FC系统对人结肠癌细胞SW 480均具有生长抑制和旁观者效应,联合应用细胞毒性更明显。     

TPX2通过p38 MAPK信号通路诱导直肠癌HR-8348细胞凋亡

目的:研究下调非洲爪蟾驱动蛋白样蛋白2靶蛋白(TPX2)对直肠癌细胞凋亡的影响及机制。方法:用TPX2小干扰RNA(si RNA)转染直肠癌HR-8348细胞,记为TPX2 si RNA组;以不做转染的细胞作为正常对照(control)组;以转染si RNA阴性对照(si RNA-NC)的细胞作为si RNA-NC组;用p38 MAPK抑制剂处理敲减TPX2表达后的直肠癌HR-8348细胞记为TPX2 si RNA+SB203580组。RT-qPCR和Western blot测定TPX2的表达水平,MTT法测定细胞存活率,流式细胞术测定细胞凋亡,Western blot测定细胞中p38 MAPK、p-p38 MAPK、cleaved caspase-3和Bcl-2的蛋白水平。结果:TPX2 si RNA转染后HR-8348细胞中TPX2的m RNA和蛋白表达水平显著下降(P 0. 05),而转染si RNA-NC对HR-8348细胞中TPX2的m RNA和蛋白水平没有影响。敲减TPX2表达后的直肠癌HR-8348细胞存活率降低,凋亡率升高,细胞中的cleaved caspase-3、p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白水平明显升高,Bcl-2水平水平降低,与control组比较,差异有统计学意义(P 0. 05)。与TPX2 si RNA组相比,TPX2 si RNA+SB203580组的HR-8348细胞凋亡率、cleaved caspase-3水平和p-p38 MAPK/p38 MAPK蛋白水平明显降低,存活率明显升高(P 0. 05)。结论:TPX2表达下调可以通过激活p38 MAPK促进直肠癌HR-8348细胞凋亡。     

腺病毒介导的HSV—tk体外抗喉癌作用

目的 观察HSV-tk/GCV系统对喉癌细胞的杀伤作用。方法 将带有报告基因LacZ的5型缺陷性腺病毒载体AdCMVLacZ感染喉癌细胞Hep-2,X-gal染色,测定腺病毒的转染率,利用同源重组技术构建含HSV-tk基因的重组腺病毒载体AdCMVtk.AdCMVtk感染Hep-2细胞后,加入10mg/LGCV。观察瘤细胞存活率及旁观者效应。结果 随着腺病毒感染复数量（ultiplicity of infection,MOI)增加,对Hep-2细胞转染率亦增加,100%转染需的MOI为200。AdCMVtk/GCV对Hep-2细胞的杀伤强度与AdCMVtk量呈正向关系。即有浓度依赖性,此杀伤作用存在旁观者效应,但较弱。结论 腺病毒介导的HSV-tk/GCV具有杀伤喉癌细胞作用。     

三氧化二砷纳米粒子对直肠癌作用的实验研究

目的 探讨三氧化二砷纳米粒子在体外、体内对直肠癌的抗癌作用.方法 Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测三氧化二砷纳米粒子诱导直肠癌细胞HR8348凋亡情况;建立HR8348细胞裸鼠皮下移植瘤模型,监测给药后肿瘤体积的变化,并通过对肿瘤组织标本Ki67染色和TUNEL染色检测肿瘤细胞增殖和凋亡情况.结果 流式细胞术结果显示,4.0 μmol/L三氧化二砷纳米粒子诱导直肠癌细胞凋亡率为7.02%,高于对照组(1.76%),P＜0.05,三氧化二砷纳米粒子体外可诱导直肠癌细胞的凋亡.在体内,三氧化二砷纳米粒子可抑制HR8348裸鼠皮下移植瘤的生长,4.0 μmol/L三氧化二砷纳米粒子组增殖指数(31.61%)低于对照组(66.75%),而凋亡指数(19.21%)高于对照组(6.47%),P＜0.05.可抑制肿瘤细胞的增殖,诱导细胞凋亡.结论 在直肠癌中,三氧化二砷纳米粒子通过抑制增殖,诱导凋亡而发挥抗癌作用,是直肠癌治疗的良好药物.     

不同药物敏感基因对人胰腺癌细胞PC-2的杀伤作用

目的比较单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶（ＨＳＶＴＫ）／丙氧鸟苷（ＧＣＶ）和胞嘧啶脱氨基酶（ＣＤ）／５氟胞嘧啶（５ＦＣ）两系统对人胰腺癌ＰＣ２细胞的杀伤作用。方法构建表达ＨＳＶＴＫ和ＣＤ基因的重组逆转录病毒载体,将其直接导入胰腺癌细胞;噻唑蓝法检测转化细胞对前体药物的敏感度及５０％细胞受抑制时的药物浓度,即ＩＣ５０值,并对旁观者效应进行观察比较。结果ＨＳＶＴＫ基因转化细胞ＩＣ５０值为（１０６±０１２）μｍｏｌ／Ｌ,比未转化细胞下降５５８倍;ＣＤ基因转化细胞ＩＣ５０值为（３３００±０９５）μｍｏｌ／Ｌ,比未转化细胞下降２５８倍;混合细胞中含１０％的转化细胞时,ＨＳＶＴＫ／ＧＣＶ系统的生长抑制率为３９％,ＣＤ／５ＦＣ系统为５０３％。结论两系统对胰腺癌细胞ＰＣ２均有很好的杀伤和抑制细胞生长作用,ＨＳＶＴＫ／ＧＣＶ系统的治疗指数较高,但其旁观者效应弱于ＣＤ／５ＦＣ系统     

双自杀基因慢病毒转移系统的建立及其对T淋巴细胞的体外杀伤作用

目的利用分子生物学方法构建CD和豫双自杀基因慢病毒转移载体。方法将慢病毒基因转移系统中的3种成分质粒（包膜质粒、包装质粒及目的基因转移质粒）用脂质体共转染人病毒包装细胞293T,荧光显微镜下观察;透射电镜下观察病毒颗粒;大量收集病毒上清,浓缩后用之感染T淋巴细胞,荧光显微镜下观察。结果荧光显微镜观察到对照组大量绿色荧光蛋白（GFP）;透射电镜证实有大量病毒颗粒存在。单独使用前体药物5-氟脲嘧啶（5-FC）和／或无环鸟苷（GCV）后,细胞的存活率与未转染T淋巴细胞比较,差异显著（P〈0．01）,与单独使用5-FC或GCV比较,联合使用5-FC和GCV时T细胞的存活率明显降低（P〈0．01）。结论慢病毒基因转移系统可使双自杀基因发挥强大的杀伤作用,为一种有效的基因转移系统。     

Radiosensitization effects of berberine on human breast cancer cells

Berberine, an isoquinoline derivative alkaloid, has recently been shown to have antitumor activity. The present study aimed to investigate the effects of the concomitant administration of berberine and radiation on breast cancer. The effects of berberine on the radiosensitivity of MCF-7 and MDA-MB-468 cells were evaluated by using cell clonogenic assays. Cells pre-treated with berberine or dimethyl sulfoxide (DMSO) for 24?h were irradiated using a Faxitron Cabinet X-ray System to deliver the indicated doses (0, 1, 2, 3 and 4?Gy). Changes in cell cycle distribution were determined by flow cytometry. γ-H2AX foci were detected by immunofluorescence staining. The levels of Ku70, Ku86 and RAD51 proteins were evaluated by western blot analysis. We observed that berberine increased the MCF-7 and MDA-MB-468 cell radiosensitivity with cell clonogenic assays. the radiation-induced G2/M cell cycle delay was reduced in the MCF-7 cells pre-teated with berberine. Berberine pre-treatment prolonged the persistence of DNA double-strand breaks in the MCF-7 cell line. In comparison with the control cells, the protein levels of RAD51 were decreased in the MCF-7 and MDA-MB-468 cells treated with berberine, and in the cells pre-treated with 15?μM berberine for 24?h, the level of RAD51 protein decreased significantly at the indicated time-points (0, 2, 6 and 24?h) following X-ray exposure. In conclusion, berberine sensitizes human breast cancer cells to ionizing radiation by inducing cell cycle arrest and the downregulation of the homologous recombination repair protein, RAD51. Berberine may be a promising radiosensitizer for the treatment of breast cancer.     

FCU/5-氟胞嘧啶自杀基因前体药物系统联合放射治疗鼻咽癌的实验研究

目的体外、原位、体内实验观察FCU／5-氟胞嘧啶(5一FC)联合γ射线对鼻咽癌CNE-2细胞的杀伤效应,以预测其对鼻咽癌的治疗作用。方法电穿孔法将重组质粒pcDNA3．1(-) CMVe．Egr-1．FCU转染CNE-2细胞,600μg/ml G418筛选14 d获得稳定表达FCU基因的CNE-2细胞,免疫印迹法鉴定FCU基因的表达。四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测5-FC联合不同剂量的γ射线对FCU基因表达阳性的CNE-2细胞的杀伤效应。进行原位基因治疗:取5×106对数生长期的CNE-2细胞接种裸鼠右腋下,建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,接种细胞12 d后将裸鼠随机分成7组,观察不同处理对各组移植瘤生长的抑制作用。进行体内基因治疗:取5×106对数生长期表达FCU基因的CNE-2细胞接种裸鼠右腋下致瘤,接种细胞后的第5天,将裸鼠随机分成7组,观察不同处理对各组移植瘤生长的抑制作用。结果从转染细胞总蛋白中检测到相对分子质量42 000的预期蛋白。体外实验中,γ射线组细胞的相对存活率为15．85％～97．88％,而5-Fc(100μg／ml)+γ射线组细胞的相对存活率是6．58％-50．00％,两组差异有统计学意义(P<0．01);5-FC+γ射线(1．0 Gy)组细胞的相对存活率分别是2．37％～35．87％,明显低于5-FC组细胞的相对存活率12．11％～99．51％(P< 0．01)。原位基因治疗和体内基因治疗实验结果表明在5-FC或者γ射线干预下,鼻咽癌移植瘤生长不同程度受到抑制,5-FC或(和)γ射线干预组的肿瘤体积明显小于对照组或PBS干预组(P< 0．05),以5-FC联合γ射线组明显。结论FCU／5-FC联合γ射线对鼻咽癌CNE-2细胞具有杀伤作用,其有协同治疗鼻咽癌的效应。     

棉酚对多克隆激活剂活化人T淋巴细胞的抑制作用

目的:以体外培养的人外周血单个核细胞为材料,研究多酚类抗生育药物棉酚对正常人外周血T淋巴细胞体外活化作用的影响。方法:利用双荧光染色流式细胞术分析棉酚对人T淋巴细胞在丝裂原或佛波醇酯刺激下早期活化抗原CD69表达的影响。结果:100μmol/L的棉酚预先与T细胞温育,能完全抑制10mg/L植物血凝素(PHA)刺激的CD3^＋T细胞活化抗原CD69的表达,又可阻断10^－7mol/L佛波醇酯(PDB)对T细胞的活化作用。这种抑制作用呈剂量依赖性,棉酚对PDB及PHA抑制作用的IC₅₀分别为(35.7±2.9)μmol/L和(32.8±1.5)μmol/L。此外,棉酚对CD3^－的淋巴细胞CD69表达也有类似的抑制作用。然而,它对多克隆激活剂引起的T细胞表面分子CD3的下调无明显影响。结论:在体外活化模型中,棉酚能够同时抑制多克隆激活剂PHA和PDB对T细胞的活化作用,提示其作用部位可能位于PKC或下游,并提示棉酚具有潜在的免疫调节作用。     

地西他滨联合丙戊酸钠促进胃癌MGC-803细胞凋亡和G0/G1期阻滞的机制研究

目的: 探讨地西他滨(DCA)和丙戊酸钠(VPA)联用对胃癌细胞株MGC-803凋亡和细胞周期的影响及机制。方法: DCA 1.5 μmol·L^-1、DCA 3.0 μmol·L^-1、VPA 1.5 mmol·L^-1、DCA 1.5 μmol·L^-1+VPA 1.5 mmol·L^-1和DCA 3.0 μmol·L^-1+VPA 1.5 mmol·L^-1作用MGC-803细胞72 h。Annexin V/PI法检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞周期,实时荧光定量PCR检测nm23-H1 mRNA表达。结果: VPA 1.5 mmol·L^-1+DCA 1.5 μmol·L^-1联合用药组 和VPA 1.5 mmol·L^-1+DCA 3.0 μmol·L^-1联合用药组 凋亡率均高于其相应单药组,差异有统计学意义(P<0.01)。MGC-803细胞G₀/G₁期比例在VPA 1.5 mmol·L^-1+DCA 1.5 μmol·L^-1联合用药组(61.55%±2.38%)和VPA 1.5 mmol·L^-1+DCA 3.0 μmol·L^-1联合用药组(66.75%±2.48%)的表达水平均高于其相应单药组,差异有统计学意义(P<0.01)。nm23-H1 mRNA在VPA 1.5 mmol·L^-1+DCA 1.5 μmol·L^-1联合用药组(1.84±0.46)和VPA 1.5 mmol·L^-1+DCA 3.0 μmol·L^-1联合用药组(2.88±0.42)的表达水平均高于其相应单药组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论: DCA联合VPA能显著促进MGC-803细胞凋亡及G₀/G₁期阻滞,其机制可能与促nm23-H1基因的表达有关。