厄贝沙坦对高糖诱导胰岛NIT-1细胞Caspase-3 mRNA表达及凋亡的影响

目的：观察厄贝沙坦对高糖诱导胰岛 NIT-1细胞Caspase-3 mRNA 表达及凋亡的影响。方法将对数生长期胰岛NIT-1细胞分为空白对照组（A组）,高糖组（25 mmol／L）（B组）,高糖加厄贝沙坦（0．1 mmol／L）组（C组）,厄贝沙坦（0．1 mmol／L）培养24 h后加高糖培养组（D组）,各组细胞分别培养48 h。通过Hochest 33342荧光染色观察各组细胞形态,反转录聚合酶链反应（ RT-PCR）技术检测各组细胞Caspase-3 mRNA的表达。结果 Hochset 33342荧光染色结果：A组细胞呈均匀弥漫性蓝光着色,B组细胞呈不均匀强蓝光着色,可见细胞核浓缩和细胞碎片,C组和D组大部分细胞着色与A组细胞一致,少数呈不均匀强荧光蓝色减少。 RT-PCR结果：B组Caspase-3 mRNA表达量高于A、C、D组（P＜0．05）,A、C 、D组间比较,差异无统计学意义（P＞0．05）。结论高糖可诱导胰岛 NIT-1细胞凋亡;厄贝沙坦可降低Caspase-3 mRNA表达量,减少细胞凋亡,在体外,对高糖诱导胰岛NIT-1细胞可能具有一定的保护作用。     

环孢霉素A对NIT-1胰岛β细胞基因表达谱的影响

目的采用基因芯片技术,观察免疫抑制剂环孢霉素A(CsA)对NIT-1胰岛β细胞基因表达谱的影响。方法体外培养NIT-1胰岛β细胞,以10μmol/LCsA处理24h。应用基因芯片分别检测CsA处理24h及空白对照组NIT-1胰岛β细胞的基因表达谱。结果CsA作用于NIT-1胰岛β细胞24h后,在4096条基因中,有38条基因表达上调,其中已知功能基因13条,主要是与应激反应、蛋白质合成及细胞生长相关的基因。有46条基因表达下调,其中已知功能基因25条,主要是与细胞生长发育、氧化磷酸化过程及蛋白合成有关的基因。RT-PCR技术验证了Zfr、Tpi和Pax63个基因表达的变化。结论CsA作用于NIT-1胰岛β细胞24h后,可影响NIT-1细胞中多种基因的表达,其中对细胞生长发育、氧化磷酸化等有关基因表达的抑制作用,可能与CsA抑制NIT-1细胞胰岛素释放的作用机制相关。本研究为进一步深入研究CsA对胰岛β细胞的作用机制提供了线索和依据。     

环孢菌素A对体外NIT-1胰岛β细胞增殖及其增殖相关基因表达的影响

目的 观察环孢霉素A(CsA)对体外培养的NIT-1胰岛β细胞增殖和pol αl mRNA表达的影响。方法 用MTT法检测不同浓度的CsA(0．05～10μmol／L)作用48和72h后NIT-1胰岛β细胞增殖的情况。利用半定量RT-PCR法检测10μmol／L CsA处理NIT-1胰岛β细胞48h后pol αl在mRNA水平上的表达。结果 CsA可抑制NIT-1胰岛β细胞的增殖，且与时间、剂量正相关。另外，CsA还下调了pol αl mRNA的表达。结论 CsA可抑制NIT-1胰岛β细胞增殖．其机制可能与下调pol αl mRNA表达有关。     

过氧化氢酶对高糖诱导NIT-1胰岛β细胞Pax6基因表达下降的影响

 【目的】探讨过氧化氢酶（eatalase）对高糖诱导的NIT-1胰岛B细胞成对同源异形盒转录因子6（Pax6）基因表达下降的影响。【方法】体外培养NIT-1胰岛B细胞24h，分4个处理组：低糖组（NG），低糖＋过氧化氢酶组（NG＋C），高糖组（FIG），高糖＋过氧化氢酶组（HG＋C），用2，7二氯氢化荧光素二酯（H2DCF-DA）染色检测活性氧簇（ROS）的水平，RT-PCR半定量检测Pax6 mRNA表达。【结果】HG组ROS水平（1．10±0．24）明显高于NG组（0．95±0．26），P〈0．05；FIG＋C组ROS水平（0．94±0．26）低于HG组，P〈0．05；HG组Pax6 mRNA表达（0．64±0．09）低于NG组（0．93±0．12），P〈0．05；HG±C组Pax6 mRNA表达（0．74±0．11）高于HG组，但差异无统计学意义，P〉0．05。【结论】高糖可使NIT-1胰岛β细胞内ROS产生增加，胰岛β细胞特异性转录因子Pax6基因表达下降，给予ROS的抗氧化剂过氧化氢酶后，Pax6基因表达有所恢复，但差异无统计学意义。     

胰岛素作用对胰岛β细胞磷脂酶Cγ1表达的影响

目的：观察胰岛素对大鼠胰岛β细胞内磷脂酶Cγ1（PLCγ1）表达的影响.方法：大鼠胰岛分离纯化.通过HE染色观察纯化胰岛的形态特征,采用免疫组织化学方法并结合激光扫描共聚焦显微镜和图像分析技术对胰岛β细胞表达不同时间（0,30,60,120,240min）内的PLCγ1进行半定量分析.结果：PLCγ1在胰腺的内外分泌部均有表达.与0min比较,胰岛素作用30,60min时胰岛β细胞表达的PLCγ1荧光强度有明显降低（P〈0.05）;而在240min时PLCγ1荧光强度与0min比较无明显差别.结论：胰岛素作用60min内可使PLCγ1表达下调;胰岛素-PLCγ1途径参与了胰岛素的信息传递.     

过表达FOXO1脂肪干细胞调控自噬对高糖诱导足细胞损伤修复的机制研究

目的 本研究旨在探究过表达FOXO1的脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)在高糖诱导足细胞损伤修复中的作用机制。方法 利用胶原酶消化法分离ADSCs。通过慢病毒感染ADSCs来构建过表达FOXO1的ADSCs。实验分为对照组、高糖组、高糖+ADSCs组、高糖+ADSCs(FOXO1+)组和高糖+ADSCs(FOXO1+)+自噬抑制剂3-MA组。利用茜素红染色检测ADSCs成骨分化能力。应用油红O染色检测ADSCs成脂分化能力。通过CCK-8法和流式细胞术检测MPC5细胞活力和细胞凋亡。通过免疫荧光检测MPC5细胞自噬相关蛋白LC3。采用Western blot法检测FOXO1、Bax、Bcl-2、p62和LC3-Ⅱ的蛋白表达。结果 流式细胞术检测显示CD29和CD90在ADSCs中高表达,而CD34和CD45表达极低;此外,茜素红染色和油红O染色结果都证实了成功分离了ADSCs。Western blot法检测结果显示,FOXO1在ADSCs(FOXO1+)细胞中高表达,表明慢病毒转染成功;同时,ADSCs(FOXO1+)细胞与MPC5细胞间接共培养明显提高MPC5细胞的FOXO1表达水平。CCK-8和流式细胞术检测发现,FOXO1过表达能够显著增强高糖诱导的MPC5细胞活力和减弱细胞凋亡。另外,免疫荧光检测表明FOXO1过表达能够促进高糖抑制的MPC5细胞自噬。同时,加入自噬抑制剂3-MA可减弱ADSCs(FOXO1+)细胞对高糖诱导足细胞损伤的修复作用。结论 过表达FOXO1的ADSCs具有修复糖尿病肾病足细胞损伤的作用,其作用机制是通过促进细胞自噬有效抑制高糖诱导的MPC5细胞凋亡。     

基于数据挖掘分析 FOXO1在成熟 B细胞肿瘤中的表达及靶基因预测

目的：利用数据挖掘分析 FOXO1 在B细胞肿瘤中的表达情况,并进一步探讨 FOXO1对 B细胞肿瘤的影响。方法：利用 Oncomine 数据库分析 FOXO1 基因在B细胞肿瘤中 mRNA 水平的变化。通过 BIOGPS分析人体正常组织和其相应的肿瘤组织中 FOXO1 基因的表达差异。利用GEPIA做 FOXO1 基因的表达水平与B细胞肿瘤患者生存期的相关性分析。在 String?DB 数据库中探索 FOXO1 基因在细胞信号转导通路中的位置以及与其关系密切的上下游基因。结果：与正常组织相比,B细胞肿瘤组织中 FOXO1 基因在 mRNA 水平呈低表达,FOXO1 基因的表达水平与B细胞肿瘤患者的总体生存时间无明显相关性（Log?rank P=0.39）。EP300、JUN、MYC、STAT1、FOS、SPI1、E2F1等基因与 FOXO1 有明显或潜在的相互作用。结论：大样本数据挖掘能迅速获取B细胞肿瘤组织中 FOXO1 表达的相关信息,为探索FOXO1在B细胞肿瘤发生发展中的作用提供科学的理论基础。     

siRNA干扰对NIT-1细胞株G蛋白耦联受体40表达的影响

目的 利用siRNA技术抑制G蛋白耦联受体40(GPR40)在小鼠胰岛NIT-1细胞中的表达.方法 化学合成3对GPR40 siRNA和1对FITC标记GAPDH siRNA,siPORT NeoFX转染试剂介导siRNA转染到NIT-1细胞中,通过转染FITC标记GAPDH siRNA以优化转染条件,在优化条件下转染三对GPR40 siRNA,分别于转染24、48、72 h后利用RT-PCR和western blotting检测GPR40 mRNA和蛋白表达抑制率.结果 根据优化的转染条件转染三对GPR40 siRNA,三对siRNA均能有效降解GPR40的mRNA并进一步抑制其蛋白表达,这一作用持续72 h以上,其中siRNA1表现了最高的抑制效率.结论 GPR40 siRNA可高效、特异地抑制NIT-1细胞GPR40表达.     

小檗碱对NIT-1细胞胰岛素分泌的影响

目的 探讨小檗碱对NIT-1细胞胰岛素分泌的影响及可能的作用机制.方法 采用小檗碱干预后,用MTT法、放射免疫法及Western blotting确定小檗碱干预的合适浓度范围及检测NIT-1细胞胰岛素水平和腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-ac-tivated protein kinase,AMPK)蛋白的表达.结果 小檗碱在浓度为100μmol/L时对基础培养基和高糖培养基干预的NIT-1细胞的增殖存在显著性抑制作用(P<0.05);而小檗碱在浓度为30μmol/L时就明显抑制高脂培养基诱导的NIT-1细胞的增殖(P<0.05).小檗碱分别对基础、高糖和高脂诱导的NIT-1细胞短时相干预(1 h)后,显示葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)被明显抑制(P<0.05);小檗碱对高糖高脂诱导的NIT-1细胞长时相干预(24 h)后显示基础胰岛素分泌和GSIS均有一定的增加(P<0.05,P<0.01).小檗碱可以促进高糖高脂诱导的NIT-1细胞AMPK蛋白的表达.结论 小檗碱不仅仅作为一种AMPK激活来调节胰岛素分泌,其也可能通过其他的通路进一步影响胰岛素分泌.     

FOXO1在急性白血病中的表达及临床意义

目的：探讨转录因子叉头框蛋白O1 （FOXO1）在成人急性白血病（AL）患者及健康人外周血中的表达及其临床意义.方法：应用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）测定40例成人AL组及50例对照组外周血中FOXO1的含量,并进行比较.结果：AL组外周血中FOXO1的表达明显高于对照组（P＜0.05）,AL组经标准化疗后完全缓解（CR）者FOXO1的含量低于化疗前（P＜0.05）,部分缓解和未缓解（PR/NR）者其含量亦降低,但降低不明显,与化疗前比较差异无统计学意义（P＞0.05）,而FOXO1在CR者中的表达低于PR/NR者,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论：成人AL外周血中FOXO1呈高表达,而化疗后完全缓解者呈低表达,可能参与白血病的发生发展.     

用RD-PCR技术获取IL-1β作用前后NIT-1细胞的差异表达基因

目的：获取IL-1β作用前后NIT-1细胞的差异表达基因，为进行差异基因的克隆和鉴定奠定基础。方法：利用转基因小鼠胰岛β细胞系(NIT-1)，通过应用一种改良的筛选差异基因的技术(Restriction diSplay PCR，RD-PCR技术)筛选cDNA的差异表达条带。结果：通过对比对照组与实验组凝胶电泳结果，找出79条表达有差异的奈带，包括实验组出现的新条带和实验组缺失的条带。结论：应用RD-PCR技术成功分离了IL-1β作用前后NIT-1细胞的差异表达条带，为大量筛选、克隆与鉴定与B细胞破坏机制相关的新基因奠定基础．有助于了解胰岛素依粕型耱尿病(IDDM）发病的分子机制。     

大鼠胰岛α细胞及其分泌物对β细胞功能的影响

目的：探讨大鼠胰岛α细胞和胰高血糖素样肽1（GLP-1）对β细胞（INS-1细胞,即胰岛素瘤细胞）功能的影响,阐明α细胞与INS-1细胞混合移植对降糖效果影响的可能机制。方法：采用MTT法分析10%、20%和30%胰岛α细胞条件培养基和0.03、0.30、3.00和30.0 mg·L^-1 GLP-1作用下INS-1细胞的增殖能力;采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测10%、20%和30%胰岛α细胞、胰岛α细胞条件培养基和不同浓度GLP-1作用下INS-1细胞胰岛素释放水平;采用激光共聚焦显微镜分析高糖和GLP-1作用下INS-1细胞内Ca²⁺浓度;采用Western blotting法分析不同浓度的胰岛α细胞条件培养基和不同浓度GLP-1作用下胰岛素蛋白表达水平;将INS-1细胞、INS-1细胞与α细胞的混合物移植至糖尿病裸鼠左肾包膜下,监测血糖,观察肾脏形态,采用免疫组织化学法检测移植部位细胞中胰岛素和胰高血糖素水平。结果：与对照组比较,胰岛α细胞条件培养基和GLP-1均可促进INS-1细胞增殖和胰岛素释放（P < 0.05）。激光共聚焦显微镜分析,GLP-1可刺激INS-1细胞内Ca²⁺浓度升高（P < 0.05）。Western blotting法检测,与对照组比较,胰岛α细胞条件培养基和GLP-1作用下INS-1细胞中胰岛素蛋白表达水平差异无统计学意义（P > 0.05）。与移植前比较,糖尿病裸鼠肾包膜下移植INS-1细胞35d时血糖明显下降（P < 0.05）,甚至出现低血糖,移植部位明显肿胀;移植INS-1和α细胞混合物的糖尿病裸鼠血糖无明显变化（P > 0.05）,移植部位未见明显肿胀。免疫组织化学染色,移植INS-1细胞部位的组织既表达胰岛素又表达胰高血糖素。结论：胰岛α细胞及其分泌物可促进INS-1细胞增殖和胰岛素释放,但α细胞与INS-1细胞混合移植给糖尿病裸鼠可降低INS-1细胞移植的降糖效果,其机制可能与INS-1细胞既表达胰岛素基因又表达胰高血糖素基因有关。     

谷氨酸脱羧酶抗体和胰岛细胞抗体对1型糖尿病的诊断价值

目的 探讨谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)、胰岛细胞抗体(ICA)对1型糖尿病诊断的敏感度和特异度。方法 应用酶联免疫方法检测45例l型糖尿病患者和50例健康人血清GAD-Ab与ICA。结果 测量GAD-Ab的敏感度是48．9％，特异度94％；测量ICA的敏感度是26．7％，特异度96％；而GAD-Ab与ICA平行试验的敏感度62．5％。结论 GAD-Ab与ICA联合检测对1型糖尿病的诊断更敏感。     

环孢霉素A抑制NIT-1胰岛β细胞胰岛素释放并下调线粒体氧化磷酸化酶系基因的表达

目的 研究免疫抑制剂环孢霉素A(CsA)对NIT-1胰岛β细胞胰岛素分泌的影响及在基因水平上对线粒体氧化磷酸化水平的影响。方法 体外培养NIT-1胰岛β细胞，用10μmol／LCsA处理24和48h。放射免疫测定法(RIA)检测胰岛素释放，半定量RT-PCR检测CsA处理NIT-1胰岛β细胞后线粒体氧化磷酸化酶系中的几种主要成员(Nuox23、Cox7c和Atp5K)在mRNA水平上的表达。结果 CsA处理24和48h可显著抑制胰岛素的释放并下调Nuox23、Cox7c和Atp5K基因mRNA表达。结论 CsA下调线粒体氧化磷酸化酶系基因的表达可能是其降低ATP合成引起胰岛素释放下降的机制之一。     

BTBD10蛋白在大鼠胰岛和INS-1细胞株的表达

目的观察BTBD10蛋白在大鼠胰岛和INS-1细胞株的表达。方法利用构建好的BTBD10多克隆抗体,采用多重免疫荧光技术和激光共聚焦显微镜观察BTBD10在3月龄Fischer344大鼠的胰腺组织和大鼠胰岛β细胞株INS-1细胞中的表达。结果 BTBD10蛋白定位在大鼠胰腺组织的胰岛β细胞中,与胰岛素的定位重叠,而在胰腺的外分泌腺和胰岛α细胞中无表达,同时显示BTBD10定位在大鼠胰岛β株INS-1细胞的细胞浆中,表达量高。结论 BTBD10特异性表达于大鼠胰岛β细胞中,提示BTBD10可能与胰岛β细胞功能和胰岛素分泌有关。     

小鼠PPA1重组腺病毒的构建及在胰岛β细胞中的表达

目的:构建小鼠PPA1重组腺病毒,观察重组腺病毒在小鼠胰岛和β－TC6细胞中的表达,以及对脂肪酸引起的胰岛β细胞凋亡的影响?方法:将目的基因PPA1插入到腺病毒穿梭质粒pAdtrack－CMV中,质粒经PCR鉴定正确后用PmeⅠ酶切线性化,转到含有腺病毒骨架pAdeasy－1的 BJ5183细菌中进行同源重组,重组成功的质粒经PacⅠ酶切线性化后转染QBI－293A细胞,经包装得到Ad－PPA1腺病毒?根据绿色荧光蛋白(GFP)检测病毒滴度和感染效率?用病毒感染小鼠胰岛和β－TC6细胞,以Western blot法检测PPA1蛋白表达水平?Hoechst染色法检测PPA1对细胞凋亡的影响?结果:重组腺病毒载体pAdeasy－PPA1经酶切鉴定确认构建成功,将pAdeasy－PPA1转染QBI－293A细胞,观察细胞病变效应提示病毒成功包装?重组腺病毒能够有效感染小鼠胰岛和β－TC6细胞并成功过表达 PPA1蛋白?Hoechst染色结果表明过表达PPA1可保护脂肪酸引起的胰岛β细胞凋亡?结论:成功构建携带小鼠PPA1基因的重组腺病毒,并证实过表达PPA1具有抗凋亡的作用,为进一步研究PPA1在胰岛β细胞中的功能奠定了基础?     

AMPK对心肌细胞FOXO1转录因子活性及泛素连接酶MuRF1表达的影响

目的 研究AMP激活的蛋白激酶(AMPK)特异性激动剂AICAR对心肌细胞FOXO1转录因子活性及泛素连接酶MuRF1蛋白表达的影响,探讨AMPK对心肌细胞蛋白质降解通路的可能作用.方法 培养出生1～3 d大鼠心肌细胞,用AICAR干预激活AMPK,并用Western blotting检测其对FOXO1转录因子活性,以及MuRF1蛋白表达的影响.结果 AICAR能够激活心肌细胞AMPK,与对照组比较,AMPK激活后显著抑制FOXO1磷酸化(P＜0.01),促进MuRF1蛋白表达(P＜0.01).结论 AMPK可能通过激活心肌细胞FOXO1的转录活性,上调MuRF1蛋白表达,参与心肌细胞蛋白质降解的调控.     

FOXO1在乳腺癌中的表达及临床意义

目的 探讨FOXO1在乳腺癌发生发展过程中的作用及其临床意义.方法 选取2012年6月至2013年1月在广东医学院附属医院经病理证实的乳腺癌组织、癌旁正常乳腺组织、乳腺良性病变组织分别50例、37例、20例,采用免疫组织化学法及实时荧光定量PCR法(RT-PCR)检测各组标本的FOXO1蛋白及mRNA的表达.结果 FOXO1蛋白在癌性组的染色阳性率为46.0%,而在良性组和癌旁组中阳性率分别为75.0%、70.2%;RT-PCR检测结果显示,癌性组、癌旁组、良性组的FOXO1 mRNA表达量分别为(0.526±0.011)、(0.885±0.017)、(0.841±0.026),FOXO1蛋白及FOXO1 mRNA在癌性组标本中的表达均较癌旁组及良性组明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05).乳腺癌组织中FOXO1蛋白的表达及FOXO1 mRNA与肿瘤大小、腋窝淋巴结转移有关(P<0.05),而与患者绝经状态、年龄、人表皮生长因子受体2(Her-2)、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及Ki-67无关(P>0.05).结论 FOXO1蛋白及mRNA的表达与乳腺癌肿瘤大小、腋淋巴结转移有关,可作为判断乳腺癌预后的生物学指标之一.