抑制转化生长因子β和Notch信号通路诱导人胆囊上皮细胞分化为功能性肝细胞样细胞

目的 通过小分子化合物改变细胞命运,诱导人胆囊上皮细胞（hGBEC）分化为具有功能的肝细胞样细胞。方法 在基质胶中对原代hGBEC进行三维培养,生长培养基中添加B27添加剂、N2添加剂、N-乙酰半胱氨酸、表皮生长因子、肝细胞生长因子等。添加小分子化合物/蛋白因子对细胞进行诱导分化,筛选出关键作用因子。采用PCR、qPCR和免疫荧光染色检测干细胞标志物及肝细胞相关标志物的表达情况,通过脂肪BODIPY-493染色、糖原过碘酸希夫染色和白蛋白ELISA检测评估细胞的肝样功能。结果 三维培养的hGBEC表达造血干细胞抗原CD133、上皮细胞黏附分子、肝细胞核因子4α等肝脏干细胞和肝前体细胞标志物。TGF-β信号通路抑制剂和Notch信号通路抑制剂是诱导hGBEC分化的关键作用因子。分化条件下所得细胞表达肝细胞功能标志物α1-抗胰蛋白酶、细胞色素P450 3A4、白蛋白和延胡索酰乙酰乙酸水解酶,可以贮存糖原,具有合成脂肪的能力,能够分泌白蛋白。结论 hGBEC可在体外长期培养,通过抑制TGF-β和Notch信号通路可初步诱导其分化为具有部分肝功能的肝细胞样细胞。     

Y-27632对小鼠骨髓间充质干细胞凋亡的影响

目的：观察ROCK抑制剂Y－27632对体外缺血清培养的小鼠骨髓间充质干细胞凋亡的影响。方法原代分离培养小鼠骨髓单个核细胞,应用流式细胞术对细胞CD29、CD44、CD90、CD34表面标志进行检测。成骨、成脂肪、成软骨分化后分别进行茜素红、油红O及甲苯胺蓝染色。将第3代细胞随机分为3组：对照组、模型组（无血清）、Y－27632组（无血清＋10μmol／L Y－27632）,分别于培养后24、48、72 h收集细胞进行流式细胞仪TUNEL法观察各组细胞凋亡率,培养后24 h Western blot法检测ROCK1及cleaved caspase 3表达。结果分离的骨髓单个核细胞CD29（＋）、CD44（＋）、CD90（＋）、CD34（－）,三系分化后茜素红染色（＋）,油红O染色（＋）,甲苯胺蓝染色（＋）。 Y－27632能明显降低由于缺血清培养导致的BMSCs的凋亡率（P＜0.01）,Y－27632能够明显降低ROCK及cleaved－caspase 3表达（ P＜0.01）。结论分离的骨髓单个核细胞就是骨髓间充质干细胞。Y－27632能够抑制由于缺血清培养导致的小鼠骨髓间充质干细胞的凋亡。     

人外周血树突状细胞的诱导及其生物学特性的研究

目的：建立体外诱导和扩增人外周血树突状细胞（ＤＣ）的方法,并分析其生物学特性。方法：造血动员后外周血单个核细胞经贴壁去除悬浮细胞,加入细胞因子（ＩＬ－４,ＧＭ－ＣＳＦ和ＴＮＦ＿α）培养８８天。用流式细胞仪分析细胞的表型,经ＥＬＩＳＡ法测定其培养上清中的ＩＬ－１２,并将诱导的树突状细胞与脐带血原始Ｔ细胞混合培养,用＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测定细胞的增殖指数。结果：贴壁的造血动员后外周血单个核细胞在体外经     

4种全能性基因转入人胚胎成纤维细胞诱导多能性干细胞系的建立及其鉴定

目的：利用人类胚胎成纤维细胞（human embryonic fibroblast cells,hEFs）获得诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）系并对其全能性进行鉴定。方法：本研究采用慢病毒感染的方法将含有Oct4,Sox2,Nanog和Lin28全能性基因的慢病毒颗粒转导hEFs,获得iPSCs,并对其进行碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP）染色,以及检测表面标记,端粒酶活性,EB分化和畸胎瘤形成等,同时进行核型分析以及短串联重复序列（short tandem repeat,STR）分析。结果：所获得的iPSCs表达多能性细胞的表面标记,具有高的端粒酶活性,可在体内体外向内中外三胚层分化,与hESCs相似。经STR分析证实,iPSCs确实来源于hEFs而非胚胎干细胞的污染。结论：4种全能性基因转入hEFs可诱导获得与胚胎干细胞相似的iPSCs,有助于进一步的表观遗传学重编程以及干细胞多能性维持的研究。     

人脐血间质干细胞一般特性及其多向分化潜能

 【目的】观察人脐血间质干细胞增殖能力、细胞表面分子标志及多向分化潜能。【方法】从人脐血中分离出单个核贴壁细胞并进行体外培养。将细胞以单克隆抗体标记后用流式细胞仪进行检测。向培养细胞中加入成骨、成软骨和成脂肪诱导剂，检测其多向分化能力。【结果】脐血间质干细胞原代培养时间为7周。流式细胞分析显示这些细胞CD29、CD13、CD44等表达为阳性，但是它们不表达造血干细胞表面标志物。加入成骨诱导剂会导致细胞碱性磷酸酶的表达。采用微球培养法并加入软骨诱导剂对细胞进行诱导，用阿尔新蓝染色显示有蛋白多糖表达。在加入成脂诱导剂后，会导致细胞形态学改变，且油红O染色为阳性。【结论】通过体外传代培养的方法可以从人脐血单个核贴壁细胞中得到纯化的间质干细胞。脐血有望成为间质干细胞的替代来源。     

应用四色荧光分析技术测定造血干细胞移植后患者CD45RA+细胞的变化

目的探讨流式细胞技术测定造血干细胞移植(HSCT)后患者外周血中初始T细胞CD45RA 的变化与临床意义。方法收集来自南方医院的49例造血干细胞移植病人的移植前、移植之后15、30、90和180 d不同时间点的90份肝素抗凝外周血标本。应用流式细胞技术测定外周血CD4 CD45RA /CD8 CD45RA 细胞数的动态变化。结果在49名造血干细胞移植患者外周血标本中选择90份样本进行检测,移植后30 d,CD8 CD45RA 细胞即能恢复到正常水平,而CD4 CD45RA 细胞产量半年之内仍低于正常并持续缓慢增长。经HSCT患者的胸腺再生输出功能明显低于自体干细胞移植患者(P<0.01)。异体外周血干细胞移植患者的胸腺恢复能力显著比异体骨髓移植患者更快(P<0.05)。结论通过流式细胞仪检测患者外周血中CD4 CD45RA / CD8 CD45RA 细胞的变化,可以相对定量地检测患者的胸腺再生输出功能,并通过测量新生T细胞的合成来监视胸腺功能在免疫重建中的作用,为临床干细胞移植治疗提供有力的数据。     

人脐血间质干细胞一般特性及其多向分化潜能

【目的】观察人脐血间质干细胞增殖能力、细胞表面分子标志及多向分化潜能。【方法】从人脐血中分离出单个核贴壁细胞并进行体外培养。将细胞以单克隆抗体标记后用流式细胞仪进行检测。向培养细胞中加入成骨、成软骨和成脂肪诱导剂，检测其多向分化能力。【结果】脐血间质干细胞原代培养时间为7周。流式细胞分析显示这些细胞CD29、CD13、CD44等表达为阳性，但是它们不表达造血干细胞表面标志物。加入成骨诱导剂会导致细胞碱性磷酸酶的表达。采用微球培养法并加入软骨诱导剂对细胞进行诱导，用阿尔新蓝染色显示有蛋白多糖表达。在加入成脂诱导剂后，会导致细胞形态学改变，且油红O染色为阳性。【结论】通过体外传代培养的方法可以从人脐血单个核贴壁细胞中得到纯化的间质干细胞。脐血有望成为间质干细胞的替代来源。     

Alport综合征患者尿肾状杆细胞诱导成多能干细胞系的建立

目的:从Alport综合征（AS）患者尿肾状杆细胞成功诱导成多能干细胞（iPSCs）。掌握建立iPSCs细胞系的技术与方法。方法:利用慢性病毒介导4种转录因子（Oct4,SOX2,Klf4,c-Myc）诱导从尿液中分离出的尿肾状杆细胞,建立诱导成干细胞样的克隆。挑选成功诱导的iPSCs克隆进行扩大培养,并对克隆进行免疫荧光检测,克隆形态观察,RT-PCR分析iPSCs细胞相关基因,体外三胚层分析及核型鉴定。结果:成功地从尿肾状杆细胞诱导成iPSCs,所获得的iPSCs可以表达人胚胎干细胞多能性分子标记,具有体外分化3个胚层的能力。在培养过程中能始终保持核型的稳定,并且能自我增殖、更新、分化。结论:Alport综合征患者尿液中的尿肾状杆细胞成功诱导为iPSCs,为今后研究AS提供了良好的细胞模型。     

体外培养神经干细胞分化为类胰岛样组织的研究

目的：观察体外培养的神经干细胞是否可以被诱导分化为类胰岛样组织。方法：体外培养神经干细胞，在胰岛素等外源性复合成分（ITS）诱导分化后，分别进行胰腺上皮干细胞特异性标志物CK－19、胰腺β细胞特异性成分胰岛素和胰腺α细胞特异性成分胰高糖素等的免疫细胞化学染色鉴定。结果：体外培养的神经干细胞经诱导分化3d后，在神经干细胞集落附近可见散在或成群分布的上皮样细胞，并呈CK－19免疫阳性反应。继续培养2－4周后，上皮样细胞增多，细胞圆形或呈鹅卵石样排列，进一步增生形成类胰岛样组织，其中大多数细胞呈胰岛素免疫反应阳性，少数细胞呈胰高糖素免疫反应阳性。结论：体外培养的神经干细胞具有向类胰岛样组织分化的潜能，它能分化为胰岛的α细胞和β细胞。     

人体脂肪干细胞培养及成骨诱导分化

目的 通过成人脂肪体外分离培养脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）研究其生理特性及在特定培养条件下向成骨分化,探讨脂肪源性干细胞作为骨组织工程的种子细胞的前景.方法 从成人脂肪中利用胶原酶消化法分离并体外培养干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,CCK8检测细胞活性,P3代脂肪干细胞通过成骨诱导液诱导向骨细胞分化,BCIP/NBT比色法染色检测碱性磷酸酶（AKP）,茜素红染色检测钙结节形成,RT-PCR检测碱性磷酸酶（ALP）、骨桥蛋白（OP）表达变化.结果 成人脂肪间质来源的ADSCs,能稳定传代,增殖能力旺盛;流式细胞检测证实其特异表达相关干细胞表面标记物;成骨诱导后表现出呈典型的成骨细胞形态;ALP染色阳性,茜素红染色阳性,诱导培养0、3、7、14、21、28天后RT-PCR定量检测证实细胞中ALP、OP阳性表达.结论 成人脂肪中可分离得到ADSCs,其稳定表达特异性的表面抗原,并且经过相应诱导培养后可向骨细胞分化,阳性表达OP、ALP,可作为优良的骨组织工程的种子细胞来源.     

肝脏NK/NKT细胞及其生物学意义

对天然杀伤细胞（NK cell）的研究近年受到高度关注。研究发现，肝脏NK/NKT细胞含量在机体天然免疫反应时可增加10倍，可能是机体最大的专职天然免疫的器官，对抵御病理、寄生菌、恶性转化细胞等的侵害具有十分重要的意义。本文就肝脏NK/NKT细胞的功能特点和生物学特性、当前的研究进展及热点问题以及进一步研究的思路和切入点作一述评。     

大鼠肝星形细胞、枯否细胞的同步分离培养与鉴定

目的:建立经济、简便的同步分离培养肝星形细胞及枯否细胞的方法。方法:应用胶原酶和蛋白酶对大鼠肝脏进行原位灌流、消化,获得大鼠肝脏非实质细胞,经18%(W/V)的Nycodenz密度梯度离心,一步分离肝星形细胞及枯否细胞;肝星形细胞处在界面,枯否细胞则处在界面下;台盼蓝染色鉴定细胞活力;Desmin免疫细胞化学染色鉴定肝星形细胞;溶菌酶免疫细胞化学染色鉴定枯否细胞。结果:该方法分离的肝星形细胞和枯否细胞的纯度达95%左右。肝星形细胞得率(3.0±0.5)×107/肝,枯否细胞得率(4.0±0.5)×106/肝。结论:应用Nycodenz一步密度梯度离心法可以很好的同时分离肝星形细胞和枯否细胞。     

肿瘤干细胞与肝癌干细胞相关研究进展

随着干细胞研究领域发展的日趋成熟,科学家们发现干细胞的这一特性和癌细胞之间有惊人的相似性.肿瘤可能起源于正常干细胞的转化,相似的信号通路可能既调节干细胞也调节癌细胞的自我更新,且癌细胞中可能含有"肿瘤干细胞".本文阐述了目前研究较少的肝癌干细胞的最新研究进展.     

人脐血CD34+细胞和贴壁细胞体外诱导树突状细胞及其鉴定

目的 从人脐血中不同的前体细胞扩增树突状细胞(DCs)，并对其进行鉴定。方法 用免疫磁珠法分离人脐血CD34^ 细胞，以GM—CSF、TNF-α、FL、SCF和IL-4诱导生成DC；用Ficoll分离脐血单个核细胞，2h贴壁后的细胞，以GM-CSF、IL-4和TNF-α诱导生成DC。观察细胞形态，流式细胞仪分析表面标志(CDla、CD80、HLA-DR)，并检测其刺激同种异体T细胞增殖的能力。结果 人脐血CD34^ 细胞和贴壁细胞体外诱导生成的细胞均具有典型的DC形态特征，表达高水平的DC分化抗原CDla，MHCⅡ类抗原递呈分子HLA—DR和CD80共刺激分子，并具有刺激同种异体T细胞增殖的能力。前者扩增DC的效率更高。结论 从人脐血CD34^ 细胞和贴壁细胞均可诱生出功能性DC，是DC理想的组织来源。     

Lewis肺癌细胞与其衍生细胞系的比较

目的 对比Lewis肺癌细胞（LLC）及LLC原位接种后获得的第一代衍生细胞（R1-LLC）和R1-LLC原位接种后获得的第二代衍生细胞（R2-LLC）间的生物学特性,比较该三种细胞在原位种植模型中的侵袭转移能力。方法 离体实验：采用cck8法、克隆球形成实验、Tanswell侵袭实验分别检测细胞的增殖、侵袭能力,透射电镜观察细胞和组织的结构形态;活体实验：观察在7、14、21d时LLC、R1-LLC、R2-LLC细胞分别原位种植模型中的成瘤与转移情况,统计成瘤率与成瘤时间。结果 LLC、R1-LLC、R2-LLC细胞的增殖能力无明显差异（p＞0.05）,侵袭能力R2-LLC＞R1-LLC＞LLC（p＜0.05）。活体实验显示LLC、R1-LLC、R2-LLC成瘤率分别为66.67%、80%、93.33%（ P<0.05）。结论 在离体及活体实验中,R2-LLC比R1-LLC及LLC细胞具有更强的侵袭及转移特性。     

原核和真核细胞表达HBeAg的应用研究

目的：将原核细胞和真核细胞分别克隆表达生产的HBeAg,经适当纯化后进行检测分析,并在乙型肝炎抗HBe检测中进行应用和比较。方法：分别用大肠杆菌和家蚕细胞表达生产HBeAg,并用Saphacryl S-200柱层析进行纯化;紫外分光光度法测定表达产物的蛋白含量;EIA法测定HBeAg和HBcAg效价及评估HBeAg的应用效果。结果：原核细胞HBeAg：比活性为10000／mg,HBeAg/HBcAg＝50,用于抗HBe的检测时特异性为96％,灵敏度符合国家卫生部panel要求,真核细胞HBeAg：比活性为160000／mg,HBeAg/HBcAg＝5000,用于抗HBe的检测时特异性为100％,灵敏度高于国家卫生部panel要求的1－2个滴度。结论：真核细胞表达的HBeAg比活性高HBcAg含量低,在抗HBe检测时的应用效果优于原核细胞。     

特异性抗原致敏的DC-CIK与DC-CTL细胞对黑色素瘤抑瘤作用的比较

目的：比较特异性抗原致敏的树突状细胞（DC）诱导的杀伤细胞（CIK）和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对B16黑色素瘤的抑瘤作用。方法：采用特异性肿瘤抗原致敏的DC与CIK和CTL细胞共同培养,分析其免疫表型,流式细胞检测癌细胞增殖周期中G0/G1期、S期、G2/M期细胞比率和细胞凋亡指数（AI）、细胞增殖指数（PI）的变化;并用MTT法检测其对肿瘤细胞的抑瘤作用。结果：DC-CIK及DC-CTL均可以影响肿瘤细胞的细胞周期,并具有诱导细胞凋亡的作用,但DC-CIK与DC-CTL之间无显著性差异;DC-CTL细胞组抑瘤作用较DC-CIK明显升高。结论：特异性抗原致敏的DC-CIK与DC-CTL细胞对B16黑色素瘤均有抑瘤作用,但DC-CTL更高效而特异。     

CIK、DC-CIK细胞杀伤胃癌MKN-28细胞的作用比较

目的研究细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)与树突状细胞(DC)共培养后对胃癌MKN-28细胞株的杀伤作用。方法取正常人外周血,分离出外周血单个核细胞(PBMC),加入不同的细胞因子分别诱导出DC和CIK细胞,共培养成DC-CIK细胞,以MTS法测定不同组CIK细胞对MKN-28杀伤活性。结果与单纯CIK细胞相比较,DC-CIK组细胞增殖速率明显提高(P<0.05);具有更强的杀伤胃癌MKN-28细胞株的活性(P<0.05),效靶比为20.0∶1时,DC-CIK组对MKN-28的杀伤活性为(38.02±2.06)%,>CIK组的(29.78±1.84)%,差异有统计学意义。结论 DC-CIK细胞是一种增殖活性和细胞毒作用均高于单纯CIK细胞的免疫活性细胞。     

以表皮干细胞与HaCaT细胞为种子细胞构建组织工程皮肤的比较研究

目的 比较人表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)与人永生化角质细胞HaCaT作为种子细胞构建组织工程皮肤的差异.方法 Ⅳ型胶原快速黏附法分选表皮干细胞,无血清培养基DK-SFM培养,取第2代备用;应用DK-SFM培养HacaT细胞,取对数生长期的细胞备用;利用组织工程技术构建真皮等价物(dermal equivalent);将上述备用的两种种子细胞分别接种在真皮替代物的表面,构建组织工程皮肤,先后进行浸没培养和气-液面器官型培养,从形态学、物理特性、HE染色等方面观察比较培养物的差异.结果 以ESCs构建的组织工程皮肤收缩快,分层分化近似于正常皮肤,具有较好的张力和韧性.以HaCaT细胞构建的组织工程皮肤分层少,生长慢,张力韧性较差.两种皮肤的直径都随培养时间的增加而缩短,且在3～7 d各检测时相点间有显著性差异(P＜0.05).结论 ESCs比永生化的HaCaT细胞更适合作为种子细胞构建组织工程皮肤.     

分离、纯化及鉴定肝细胞和免疫细胞分泌的HMGB1

目的:分离纯化肝细胞HepG2与免疫细胞U937分泌的高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1),并加以鉴定.方法:体外培养人肝细胞HepG2与免疫细胞U937,采用400 ng/mL的脂多糖( lipopolysaccharide,LPS)刺激20 h后收集细胞...