马链球菌兽疫亚种10株国内猪源分离株对小鼠免疫效力的评价

目的近年来马链球菌兽疫亚种引起的猪链球菌病在我国造成重大损失。为评价猪源兽疫亚种分离株的抗原变异,取国内10省市分离的10株猪源兽疫亚种分离株,分别制备灭活抗原,加入弗氏完全佐剂免疫12 w龄ICR小鼠,4 w后加入弗氏不完全佐剂进行再次免疫,再次免疫2 w后分别用5 LD50同源菌株和1.6×105CFU ATCC35246株攻击。结果表明,同源菌株攻击,免疫保护率均在90%以上;而以ATCC35246攻击的异源菌免疫小鼠,免疫保护率为80%-100%。可见我国不同地区的猪源马链球菌兽疫亚种分离株的抗原性差异不大,单一菌株制备的疫苗具有应用前景。     

马链球菌兽疫亚种毒力因子

马链球菌（Streptococcusequi）属于兰氏分菌的C群链球菌,包括马链球菌马亚种（Streptococcus．equi subsp．equi）、马链球菌兽疫亚种（S．equi subsp．zooepidemicus）和马链球菌类马亚种（S．equi subsp．equisimilis）其中兽疫亚种没有宿主专嗜性,容易发生变异,来源不同的菌株抗原性可能不同。该菌可通过消化道、外伤、手术、注射疫苗或治疗等途径感染多种动物,引发败血症、脑膜炎、心内膜炎、关节炎、乳腺炎等。人类因食用污染的食物或与发病动物密切接触后,亦可引发该菌感染。马链球菌兽疫亚种主要引起猪的链球菌病,曾在我国华南、西南和华东等地区广泛流行,至今仍给我国养猪业造成较大的危害。毒力因子（virulent factor）是指构成细菌毒力的物质。马链球菌兽疫亚具有类M蛋白、金属结合蛋白、链激酶、IgG结合蛋白、纤连蛋白、透明质酸荚膜等毒力因子,在该菌感染、侵袭以及抵抗机体吞噬的过程中,起着重要的作用。     

24株停乳链球菌似马亚种的分子鉴定和基因分型

目的 探讨停乳链球菌似马亚种(Streptococcus dysgalactiae subspecies equisimilis,SDSE)感染的临床分布特点及分子特征。方法 收集SDSE感染患者的临床资料及相应分离菌株,分离株经全自动微生物分析系统、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)及PCR扩增16S rRNA和链激酶前体基因等3种方-法进行鉴定。对SDSE菌株进行M蛋白基因(emm)分型和多位点序列分型(Multilocus sequence typing, MLST),并通过BioNumerics 6.6软件进行聚类分析。结果 24株停乳链球菌似马亚种主要分离自咽拭子、皮肤、血液,分别占58.33%、20.83%、8.33%;24株SDSE被分为5种emm类型,以stCNSRT2.0(n=16,66.7%)占优势,其次是stG840.0(n=3,12.5%)。通过MLST分型,共有6种ST型别,以ST44(n=17,70.8%)为主,ST605为新定义的ST型。结论 本研究中SDSE分离株具有分子多样性,ST605为首次报告的MLST型别。     

肺炎链球菌自溶酶蛋白抗原表位的预测、克隆及重组表达

目的用生物信息学的方法预测肺炎链球菌自溶酶蛋白(LytA)可能的抗原表位,合成带有linker(Gly4 Ser1)3序列的融合基因片断(l1l2),并在原核系统表达。方法利用多种生物信息学软件,在二级结构预测抗原表位分值的基础上结合单参数分析结果,预测并设计LytA可能的重组抗原表位(L1L2)。扩增该表位基因l1l2,利用分子克隆技术构建重组质粒。经测序鉴定后,转入宿主菌JM109中原核表达L1L2多肽片断与载体标签蛋白还原性谷胱苷肽(GST)的融合蛋白GST-L1L2。结果预测表明序列2～28(EINVSKLRTDLPQVGVQPYRQVHAHST)、序列98～112(FMTDYRLYIELLRNL)分别为可能的B细胞和T细胞抗原表位。用PCR技术合成了l1l2片段,构建重组质粒pGEX-4T-1-l1l2,成功转化大肠杆菌JM109。结论经测序验证成功构建了重组质粒pGEX-L1L2,并转化大肠杆菌JM109,SDS-PAGE分析显示该重组质粒在原核系统中得到了表达,为后继多肽疫苗研究奠定了基础。     

牛带绦虫亚洲亚种乳酸脱氢酶基因的克隆表达及免疫原性分析

目的 对牛带绦虫亚洲亚种成虫乳酸脱氢酶基因（LDH）进行克隆、表达和免疫原性分析。 方法 将牛带绦虫亚洲亚种成虫TaLDH克隆到原核表达质粒pET-30a（+）中,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,表达产物通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白pET-30a（+）-TaLDH用蛋白质印迹（Western blotting）分析其免疫原性。 结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均显示重组质粒pET-30a（+）-TaLDH构建成功。SDS-PAGE结果表明,目的基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得高效表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白,浓度为0.9 mg/ml。Western blotting分析结果显示,重组蛋白pET-30a（+）-TaLDH能识别感染牛带绦虫亚洲亚种的猪血清和患者血清,在相对分子质量(Mr)35 000处有一清晰条带,表明其具有免疫反应性。 结论 牛带绦虫亚洲亚种成虫乳酸脱氢酶基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的高效表达。     

弓形虫GRA6抗原基因的克隆与表达

目的在大肠杆菌中高效表达弓形虫抗原GRA6。方法采用聚合酶链反应(PCR)从弓形虫昆山分离株和RH株总DNA中分别扩增到编码GRA6的基因，经DNA序列分析后导入表达载体。PGEX-5X-3。然后在大肠杆菌BL21-Codon Plus(DE3)-RP中进行表达，以SDS-PAGE和Westen blotting进行鉴定，用GST亲和层析柱纯化表达产物。结果1．在我们所比较的336个碱基中，弓形虫昆山分离株与RH株之间碱基基本一致。2．得到一分子量为49kDa的融合蛋白。占大肠杆菌总蛋白的25．55％，通过Westen blotting证实，该重组抗原能被弓形虫感染的人特异性IgM和IgG血清所识别。结论1．弓形虫昆山分离株和RH株的GRA6基因片段几乎完全一致；2．在大肠杆菌中得到了高效表达的融合蛋白；3．该重组抗原能被弓形虫感染的人特异性IgM和IgG血清所别．可用于构建具有高度敏感性和特异性的弓形虫病检测试剂盒．     

恙虫病东方体47kDa蛋白基因部分片段的克隆与表达

目的　表达恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi,Ot) 4 7kDa保护性抗原蛋白。 方法　采用PCR方法 ,从OtKarp株基因组DNA中扩增出 4 7kDa蛋白基因片段 ,鉴定后将该片段克隆于原核表达载体 pBV2 2 0 ,构建成重组质粒pBV -4 7。用该重组质粒转化E coli,转化子在 4 2℃诱导表达并对其鉴定。结果　 (1)获得长约 14 30bp的PCR片段 ,序列分析结果与已知 4 7kDa基因序列相同 ;(2 )SDS -PAGE检测表达产物 ,在相对分子量 4 0× 10 3 处有表达带 ;(3)经薄层扫描分析 ,目的蛋白占全菌蛋白的 19% ;(4)免疫印迹实验证明其具有免疫反应性。结论　获得了 4 7kDa基因片段 ,并在大肠杆菌中实现了表达 ,表达产物具有免疫反应性。     

奶牛乳腺炎无乳链球菌临床分离株fbsA基因的克隆与序列分析

目的克隆并分析牛乳腺炎无乳链球菌内蒙古地区临床分离株表面蛋白fbsA基因核苷酸及编码氨基酸序列,预测其潜在的抗原表位。方法以无乳链球菌内蒙古地区临床分离株为材料,根据GenBank中公布的无乳链球菌fbsA基因序列设计特异性克隆引物,采用同源克隆法,PCR扩增fbsA基因序列,采用DNA Star生物信息学软件预测分析其编码氨基酸的潜在抗原性。结果克隆的fbsA基因序列大小为321bp,编码107个氨基酸残基,与GenBank中公布的B群无乳链球菌fbsA基因核苷酸序列同源性为98.13%,氨基酸序列同源性为99%。预测克隆基因编码氨基酸抗原性指数良好。结论成功克隆出内蒙古地区奶牛乳腺炎无乳链球菌表面蛋白fbsA基因序列,并预测其编码氨基酸具有潜在抗原性为进一步研究其原核表达产物的抗原性及致病机制奠定了基础。     

天津地区汉坦病毒分离株TJJ16 M基因片段克隆和序列分析

目的分析天津地区汉坦病毒分离株TJJ16 M基因的分子特征。方法采用细胞培养法从鼠肺标本中分离汉坦病毒TJJ16,提取TJJ16感染Vero-E6细胞的总RN A,经逆转录扩增病毒cDNA,继而进行PCR分别扩增M1和M2基因片段,克隆于T载体并测序拼接,对其进行序列分析和生物信息学分析。结果汉坦病毒TJJ16株的M基因片段全序列长为3616nt,仅有1个开放读码框架(ORF),编码1 136个氨基酸,序列分析表明其为汉滩型(HTN型)汉坦病毒,与HTN型Q32株同属1个亚型。结论TJJ16病毒株M基因片段的克隆和序列分析证实其为HTN型,系天津地区的首次报道。     

结核分枝杆菌Rv1009基因蛋白的克隆和表达

目的 克隆表达结核分枝杆菌促Rv1009基因,序列测定正确后进行融合、表达.方法 采用热启动聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1009编码基因,用限制性内切酶消化后插入pGEX 4T-2载体中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,目的基因经IPTG诱导,表达Rv1009基因蛋白.结果 经PCR扩增在1300bp处发现一条目的片段,获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1009基因蛋白,经诱导后高效表达分子量为64KD的外源蛋白,与预期分子量大小一致,凝胶自动扫描分析,在A600值为0.6,IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导表达3 h时融合蛋白表达量即达峰值,占菌体总蛋白的22.8%.结论 构建了结核分枝杆菌Rv1009基因重组表达载体,获得了RPF样融合蛋白的高效表达,为今后深入研究奠定了基础.     

猪链球菌2型毒力因子部分片段的克隆与表达

根据猪链球菌2型(Streptococcussuistype2)胞外蛋白因子(extracellularfactorprotein,EF)的基因(epf)序列,设计合成一对引物,以猪链球菌2型江苏分离株SS2-H的基因组为模板,扩增epf基因1585-2547位序列,进行T/A克隆,转化入宿主菌DH5α中。提取阳性克隆质粒进行双酶切并纯化,将目的片段向克隆到表达载体pET-32a中组氨酸的下游,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导可表达分子量约为53000的融合蛋白。免疫转印分析表明,该融合蛋白具有EF的抗原表位。     

肺炎链球菌不同菌株自溶酶基因的克隆、序列分析及重组表达

目的克隆肺炎链球菌自溶酶(LytA)的基因序列，并进行重组表达。方法分别提取不同临床分离株的基因组DNA，根据已知肺炎链球菌野生R6株LytA基因序列设计引物，进行PCR扩增，将获得的目的基因片段克隆人原核表达质粒，然后测序；利用生物信息学方法，对不同临床分离株LytA基因序列进行比较分析，同时进行LytA基因的重组表达。结果从不同临床分离株的基因组中均扩增出完整的LytA基因片段，成功构建了重组质粒pGEX-4T-1-LytA。比较不同临床分离株LytA基因的DNA序列及推测的氨基酸序列，发现各株LytA基因序列及氨基酸序列间存在差异。通过异丙基巯基半乳糖(IPTG)诱导，LytA基因在大肠埃希菌JM109中得到高效表达，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示pGEX-4T-1-LytA融合蛋白相对分子质量约62000，与理论预测一致。结论序列分析发现各分离株的LytA基因序列及氨基酸序列间存在差异，但同源性极高，推测LytA基因序列保守，可用于疫苗研发。     

猪链球菌2型四川株溶血素主要抗原决定簇基因的克隆及表达

目的研究有效的猪链球菌病疫苗。方法采用PCR方法,以四川株、参考菌株和江苏分离株猪链球菌2型基因组DNA为模板扩增溶血素基因,克隆至PMD18-T载体。提取阳性质粒,进行PCR和酶切鉴定。经测序正确后,构建原核表达载体pET32a-SLY,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG进行诱导。结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量约为43ku的重组蛋白,表达产物经纯化后,免疫印迹法（Western-blotting）分析证实,该重组蛋白与SS2-6阳性血清发生特异性反应。结论本实验旨在通过对溶血素主要抗原决定簇基因的克隆表达,分析表达产物的抗原性和免疫原性,为进一步对猪链球菌2型疫苗共表达的研制奠定基础。     

2型猪链球菌中国强毒株溶血素样蛋白基因的原核表达及其抗血清制备

目的克隆2型猪链球菌溶血素样蛋白(Hemolysin-like protein,HLP)编码基因并进行原核表达,纯化重组蛋白并制备相应的多克隆抗体。方法采用PCR法,从2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组扩增基因hlp,构建重组表达质粒pET32a::hlp,转化E.coliBL21(DE3),筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物;His亲和层析柱纯化重组蛋白;重组蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,间接ELISA和Western blot检测多抗血清。结果构建的重组质粒在宿主菌中可高效表达,His亲和层析柱纯化获得较高纯度的重组蛋白;重组蛋白免疫新西兰兔后获得高效价的抗血清。结论在原核系统中成功地表达了hlp基因编码的蛋白,并以重组蛋白为抗原制备出高效价的多抗血清,为进一步研究hlp基因的功能奠定了基础。     

日本血吸虫嗜肌素样蛋白编码基因的克隆表达及其免疫原性研究

目的克隆和表达日本血吸虫嗜肌素样蛋白(SjcMLP)编码基因,并研究其重组抗原的免疫原性。方法PCR扩增SjcMLP编码基因,并亚克隆人表达载体pQE30。将重组表达质粒pQE 30-SjcMLP转入宿主菌E. coli M15,异丙基-βD-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用金属Ni螯合物亲和层析柱(Ni-NTA)纯化SjcMLP重组蛋白(reSjcMLP)。纯化的reSjcMLP采用十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹试验(Western blot)作进一步分析。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定用reSjcMLP免疫C57BL/6小鼠血清中的抗体水平。结果 SDS-PAGE分析表明获得的重组抗原的大小约24.8 kDa,与预的融合蛋白大小相符。Western blot昱示该重组抗原能被日本血吸虫尾蚴感染兔血清识别。用该重组抗原包被进行ELISA检测,免疫血清滴度高达1：12 800。但动物免疫试验结果减虫效果不明显。结论SjcMLP编码基因以可溶性融合蛋白的形式得到表达,动物免疫试验未诱导出明显的保护力     

Cloning of α-β fusion gene from Clostridium perfringens and its expression

AIM: To study the cloning of α-β fusion gene from Clostridium perfringens and the immunogenicity of α-β fusion expression.METHODS: Cloning was accomplished after PCR amplification from strains NCTC64609 and C58-1 of the protective antigen genes of α-toxin and β-toxin. The fragment of the gene was cloned using plasmid pZCPAB. This fragment coded for the gene with the stable expression of α-β fusion gene binding. In order to verify the exact location of the α-β fusion gene, domain plasmids were constructed. The two genes were fused into expression vector pBV221. The expressed α-β fusion protein was identified by ELISA, SDS-PAGE, Western blotting and neutralization assay.RESULTS: The protective α-toxin gene (cpa906) and the β-toxin gene (cpb930) were obtained. The recombinant plasmid pZCPAB carrying α-β fusion gene was constructed and transformed into BL21(DE3). The recombinant strain BL21(DE3)(pZCPAB) was obtained. After the recombinant strain BL21(DE3)(pZCPAB) was induced by 42℃, its expressed product was about 22.14% of total cellular protein at SDS-PAGE and thin-layer gel scanning analysis. Neutralization assay indicated that the antibody induced by immunization with α-β fusion protein could neutralize the toxicity of α-toxin and β-toxin.CONCLUSION: The obtained α-toxin and β-toxin genes are correct. The recombinant strain BL21(DE3)(pZCPAB)could produce α-β fusion protein. This protein can be used for immunization and is immunogenic. The antibody induced by immunization with α-β fusion protein could neutralize the toxicity of α-toxin and β-toxin.     

肺炎支原体P1黏附蛋白基因的克隆与表达

目的对肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，Mp)3’端的P1黏附蛋白基因片段进行基因克隆、重组表达、蛋白纯化和表达产物的免疫性分析，为临床诊断试剂和疫苗的研制打下基础。方法应用PCR技术直接从MpFH株染色体DNA中扩增894bp的3’端p1基因片段(p1’)，将此基因片段插入表达载体pGEX-6P-1后，转入大肠杆菌BL21扩增后提取重组质粒进行酶切、PCR扩增及核苷酸测序进行鉴定。诱导阳性克隆株表达重组蛋白后纯化，用兔抗Mp多克隆血清通过免疫印迹实验鉴定其免疫反应性。结果插入重组质粒的p1基因片段经测序后，与GenBank中p1基因核苷酸序列(AF290001、AF290002、AF286371、AE000002、M21519、M18639)比较，其同源性为99．66％～100%。氨基酸序列同源性为99．32％～100%。经SDS—PAGE分析。重组蛋白的相对分子量约为59kDa。免疫印迹实验证实重组蛋白是P1黏附蛋白抗原。结论成功构建了pGEX-6P-1-p1’重组质粒并获得表达。此p1’基因重组质粒表达的蛋白具有免疫反应性，有希望成为特异性抗原诊断试剂和疫苗的候选抗原。     

猪链球菌2型四川人源分离株ZYH18纤连蛋白结合蛋白基因的克隆和序列分析

目的对2005年猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2，S．suis 2）四川资阳人源分离株ZYH18纤连蛋白结合蛋白（FBPS）基因进行克隆和序列分析。方法以ZYH18的基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增出纤连蛋白／血纤蛋白原结合蛋白基因片段，克隆于pMD-T18栽体，构建成载体pMD-T—fbps，转化到宿主菌TG1中，进行序列测定（GenBank登录号为DQ345444）。测序结果与实验室保存的其它7株猪链球菌2型临床分离菌株测序结果及GenBank提交序列AF438158进行编码区基因的同源性比对。结果成功克隆了实验室保存的分离于不同时间和地点的，包括ZYH18在内的8株S．suis2临床分离菌株的．朋加基因，并对其编码区基因进行了同源性比对。结论实验室保存的8株菌的FBPS编码区基因同源性高达100％，并不因分离时间和地点的不同而不同；与GenBank提交序列AF438158同源性为99％，存在两个氨基酸的差异。     

刚地弓形虫硫氧还蛋白基因的克隆 表达及鉴定

目的 目的 克隆刚地弓形虫硫氧还蛋白 （Thioredoxin,Trx） 基因, 构建原核表达载体, 通过诱导表达和纯化蛋白, 免 疫家兔制备多克隆抗体。方法 方法 采用PCR技术扩增刚地弓形虫Trx基因, 克隆至原核表达载体pET?28a （+） 中, 转化大肠 埃希菌 （E. coli） Rosetta, 用IPTG诱导目的蛋白表达, 采用镍亲和层析法获得纯化蛋白并免疫家兔制备多克隆抗体。利用 Western blotting技术鉴定多克隆抗体的特异性。结果 结果 成功从刚地弓形虫 cDNA 中扩增出 Trx 目的基因, 构建了 Trx/pET?28a （+） 重组质粒, 获得抗Trx重组蛋白的多克隆抗体。Western blotting技术检测出弓形虫Trx蛋白的特异性条 带。结论 结论 用制备的兔抗Trx多克隆抗体能检测弓形虫Trx在速殖子内的表达, 为进一步深入研究刚地弓形虫Trx功能 奠定了基础。