miR-106b靶向调控胰岛素分泌细胞诱导分化过程中Ngn3基因的表达

目的实现骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells,bMSCs）向胰岛素分泌细胞（insulin—producingcells,IPCs）的诱导分化并验证分化过程中miR-106b靶向调控Ngn3基因表达。方法首先,分离培养bMSCs,应用活化素A（activinA）和B细胞素（betacellulin）将其诱导分化为IPCs。然后,采用靶基因预测软件miRanda和TargetScan对miR-106b和Ngn3基因的靶向匹配关系进行预测并通过双荧光素酶报告基因系统鉴定。qRT—PCR检测诱导分化过程中miR-106b和Ngn3的表达。结果诱导分化后的细胞双硫腙染色呈猩红色,免疫荧光化学显示有胰岛素表达。生物信息学方法预测发现miR-106b和Ngn3基因二者匹配良好,通过双荧光素酶报告基因系统检测发现miR-106b能结合到Ngn3mRNA的3’UTR并有效抑制其表达。qRT—PCR检测结果表明,miR-106b的表达水平与Ngn3表达呈负相关。结论miR-106b能调控IPCs诱导分化过程中Ngn3的表达。     

人脂肪基质细胞向胰岛素分泌细胞的分化诱导

目的:体外分离培养人脂肪来源基质细胞（hADSCs）,并定向诱导hADSCs向胰岛样细胞分化,探讨hADSCs分化为胰岛素分泌细胞的潜能。方法:从脂肪抽吸物中分离hADSCs,利用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、上皮细胞生长因子(EGF)、尼克酰胺和exendin-4等因子诱导hADSCs向胰岛样细胞分化。采用RT-PCR检测诱导前后胰岛素、胰十二指肠同源性盒因子(Pdx-1)、葡萄糖转运因子2(Glut-2)和胰高血糖素(glucagon)基因的表达;双硫腙染色鉴定胰岛样细胞团;免疫荧光染色检测诱导后细胞胰岛素和Pdx-1的表达;ELISA检测诱导后细胞在低糖和高糖环境中胰岛素的分泌量。结果:诱导7 d左右细胞由长梭形逐渐变成多边形,并且细胞开始呈岛状聚集,21 d左右形成胰岛样细胞团。双硫腙染色阳性;RT-PCR显示,诱导后细胞表达胰岛素、Pdx-1、Glut-2和glucagon基因;免疫细胞化学显示,诱导后细胞表达胰岛素和Pdx-1;葡萄糖刺激实验显示胰岛素的释放,并且随着葡萄糖浓度增加胰岛素的释放量也增加。结论:体外hADSCs具有分化为胰岛素分泌细胞的潜能,为将来应用于临床移植治疗糖尿病奠定了基础。     

小鼠骨髓干细胞有诱导分化为胰岛素分泌细胞的可能性

【目的】探讨小鼠骨髓干细胞有无被诱导分化为胰岛素分泌细胞的可能性。【方法】培养小鼠骨髓干细胞，采用含GLP-1和nicotinamide的无血清培养液诱导分化，在培养过程中，检测有关基因的表达。【结果】培养的小鼠骨髓干细胞具有与献报道相似的生物学特性；在诱导分化第7天，有ngn3和pax-1基因表达；在诱导分化第14天，有nkx2．2、pdx-1和ins2基因表达。【结论】小鼠骨髓干细胞有诱导分化为胰岛素分泌细胞的可能性，值得进一步研究。     

胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞的诱导条件

目的：探索胚胎干细胞ES—D3分化为胰岛素分泌细胞的诱导条件。方法：ES—D3细胞培养于鼠胚成纤维细胞滋养层上，对数生长期时转入无血清含bFGF的DMEM液中，隔天换液，2周后，用DTZ染色、ELISA、免疫细胞化学染色等方法鉴定诱导生成的胰岛素分泌细胞及其所分泌的胰岛素。结果：ES—D3细胞在不含白血病抑制因子和滋养细胞的无血清培养体系中呈悬浮生长，并于第4天形成拟胚体，加入促分化因子bFGF可使胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化，诱导生成的胰岛素分泌细胞在培养基中自我组装形成三维立体细胞簇。诱导第17天，DTZ染色发现大量被染成暗红色的胰岛素分泌细胞，免疫细胞化学染色亦证实了胰岛素分泌细胞的存在；同时，用ELISA法检测到胰岛素分泌。随着诱导天数增加，DTZ染色阳性细胞数及胰岛素含量均增加?结论：胚胎干细胞ES—D3在无血清含bFGF培养基中能被诱导分化为胰岛素分泌细胞，且该细胞能够分泌胰岛素。     

干细胞向胰岛素分泌细胞诱导分化的研究进展

近年来,糖尿病的发病率不断上升,而且发病更趋年轻化。文献报道:全世界的糖尿病患者已超过2亿,并且以每年200万人的速度增加。我国的糖尿病患者已经超过4000万,预计到2010年将达到6000万人,其中Ⅰ型糖尿病占5%左右。糖尿病患者虽然采用胰岛素治疗在一定程度上能够改善患者的糖代谢紊乱,然而长期的胰岛素注射不仅给患者带来不便,并且不能有效地防止或逆转糖尿病引起的微血管病变及其并发症。胰岛移植不仅能够纠正糖代谢紊乱,而且还能有效地防止或逆转糖尿病引起的微血管病变及其并发症。     

小鼠骨髓干细胞有诱导分化为胰岛素分泌细胞的可能性

[目的] 探讨小鼠骨髓干细胞有无被诱导分化为胰岛素分泌细胞的可能性.[方法] 培养小鼠骨髓干细胞,采用含 GLP-1和 nicotinamide的无血清培养液诱导分化,在培养过程中,检测有关基因的表达.[结果]培养的小鼠骨髓干细胞具有与文献报道相似的生物学特性;在诱导分化第 7天,有 ngn3和 pdx-1基因表达;在诱导分化第 14天,有 nkx2.2、 pdx-1和 ins2基因表达.[结论] 小鼠骨髓干细胞有诱导分化为胰岛素分泌细胞的可能性,值得进一步研究.     

miR-802靶向Hnf1B抑制胰岛素分泌的作用研究

探究miR-802对于胰岛β细胞分泌胰岛素的影响及其作用机制。利用miR-802类似物及miR-802抑制剂分别在胰岛原代细胞及Min6细胞过表达或敲降miR-802;采用ELISA法检测miR-802对胰岛素分泌的影响;通过miRNA靶基因数据库预测、荧光素酶报告法和Western blot法确证miR-802的靶基因;最后开展功能回复实验阐明miR-802调控胰岛β细胞分泌胰岛素的作用机制。结果表明:在胰岛原代细胞和Min6细胞中过表达miR-802能抑制胰岛β细胞分泌胰岛素;qPCR和Western blot实验证明miR-802通过抑制靶基因肝细胞核因子1B(hepatocyte nuclear factor 1β,Hnf1B)的转录和翻译,从而抑制胰岛素的分泌。     

Pdx1诱导胰岛素分泌细胞形成研究进展

Pdx1基因对胰腺发育胰岛功能的影响有着十分重要的作用,近年来利用Pdx1在体外细胞培养的转分化作用,将成体肝细胞、胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、肠上皮细胞等诱导分化成胰岛素分泌细胞的试验研究已经成为糖尿病基因和细胞学治疗的研究热点之一.     

miR-499-5p调控AKT2基因对骨肉瘤MG63细胞凋亡和迁移的影响

目的 探讨miR-499-5p在骨肉瘤MG63细胞中的表达及其对MG63细胞凋亡和迁移的影响.方法 运用生物信息学软件TargetScan和miRanda对miR-499-5p和AKT2基因的靶向配对关系进行预测.未转染细胞设为空白对照组(control组),脂质体2000转染miR-499-5p模拟物为mimics组,转染干扰AKT2基因的siRNA为siRNA组.Real-time PCR检测3组细胞中miR-499-5p和AKT2 mRNA的表达情况,westernblot检测AKT2蛋白的表达情况,流式细胞术检测3组细胞凋亡情况,细胞划痕实验检测体外的迁移情况.结果 TargetScan和miRanda显示miR-499-5p和AKT2基因二者靶向配对良好.Real-time PCR检测结果表明转染mimics后,AKT2 mRNA的表达量降至(45.06±8.12)％,与control组(100％)比较,差异有显著性意义(P＜0.05).Western blot检测结果表明mimics组AKT2蛋白相对表达量为(0.32±0.05),与comtrol组(0.69±0.11)比较,明显降低,P＜0.05.流式细胞术和细胞划痕实验结果显示mimics组MG63细胞凋亡率(18.97±2.41)％及细胞划痕愈合率(63.54±5.43)％,与control组(10.35±2.56)％和(90.35±6.81)％相比差异均有显著性意义(P＜0.05).结论 miR-499-5p能够下调骨肉瘤MG63细胞中AKT2基因的表达,促进癌细胞的凋亡以及抑制细胞的迁移.     

谷氨酸铬对四氧嘧啶性糖尿病小鼠胰岛及B细胞形态结构的影响

[目的]探讨谷氨酸铬对糖尿病小鼠胰岛及B细胞的影响.[方法]用四氧嘧啶制作糖尿病小鼠模型,随机分为糖尿病对照组、实验Ⅰ组(每日灌胃给予谷氨酸铬250μg/kg)及实验Ⅱ组(每日灌胃给予谷氨酸铬125μg/kg),另设正常对照组.实验周期为3周,利用免疫组织化学方法观察胰岛及B细胞的组织学变化.[结果]实验Ⅰ组小鼠胰岛内空虚部分明显缩小,B细胞及其颗粒增多,界限较清楚.[结论]谷氨酸铬对四氧嘧啶所致小鼠胰岛及B细胞的损伤具有明显的改善作用.     

MiR-217对小鼠胰腺成体干细胞增殖的调控作用

为了进一步研究miR-217在小鼠胰腺成体干细胞生长过程中的调控作用,在培养的胰腺成体干细胞中过表达miR-217,用Western blot和免疫荧光的方法检测miR-217对细胞增殖的影响。结果显示,miR-217能够明显抑制胰腺成体干细胞增殖相关蛋白Cyclin D1和Ki-67的表达。使用生物信息学软件预测miR-217的靶基因,并通过双荧光素酶报告基因的方法验证了miR-217对靶点的靶向性,实验结果表明,miR-217能够抑制PMIR-REPORT-Sirt1-3′UTR荧光素酶活性。进一步在二维培养的胰腺成体干细胞中,过表达miR-217检测Sirt1的表达变化,qPCR和Western blot表明在胰腺成体干细胞中miR-217能够抑制Sirt1的蛋白水平的表达,但对mRNA水平没有影响。在胰腺成体干细胞中分别加入Sirt1的抑制剂尼克酰胺和激动剂白藜芦醇,尼克酰胺能够抑制胰腺成体干细胞的增殖,而白藜芦醇促进了胰腺成体干细胞的增殖。以上结果说明,miR-217通过Sirt1调控胰腺成体干细胞的生长,低表达的miR-217有助于维持胰腺成体干细胞的增殖。     

lprG基因表达上调对THP1细胞表达谱的影响

目的分析lprG基因表达上调对THP1细胞表达谱的影响。方法建立稳定表达lprG的THP1细胞系,通过qPCR及Western印迹法检测lprG的表达。用RNA-seq分析稳定表达lprG对THP1细胞基因表达谱有何影响。对测序数据进行分析,作GO及KEGG通路的显著性富集分析,并选取6个差异表达基因进行qPCR验证。结果成功构建稳定表达lprG的THP1细胞系。RNA-seq检测发现共有712个差异表达的基因,其中419个上调,占58.8%,293个下调,占41.2%。富集分析显示,lprG的异位表达可影响THP1细胞多种生理或代谢过程。qPCR结果与RNA-seq结果一致。结论lprG会影响THP1细胞内与Toll样受体信号通路、补体、细胞吞噬、溶酶体及过氧化物酶体等过程相关的基因的表达,这可为进一步研究lprG与巨噬细胞相互作用机制提供前期基础。     

多基因修饰小鼠诱导多潜能干细胞分化为胰岛素分泌细胞

目的观测胰岛素转录关键调控因子胰腺十二指肠同源框蛋白1(PDX-1)、神经分化因子1(NeuroD1)及肌腱膜纤维肉瘤癌基因同系物A(MafA)对小鼠诱导多潜能干细胞(iPS细胞)分化为胰岛素分泌细胞的作用。方法筛选鉴定小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)重编程的iPS细胞。以重组腺病毒Ad-mPDX-1-IRES-GFP、Ad-mNeuroD1-IRES-GFP、Ad-mMafA-IRES-GFP联合感染小鼠iPS细胞,体外培养后以RT-PCR检测胰岛B细胞功能基因表达;免疫荧光检测胰岛素蛋白表达及定位;ELISA检测不同糖浓度(0、5、10、20、30、40mmol/L)下胰岛素的分泌量。结果起源于MEFs的iPS细胞能形成边缘光整的致密克隆,表达干性基因Nanog、Rex-1、SSEA-1,并能在体内外分化为三胚层组织,显示MEFs被成功地重编程为iPS细胞。Ad-PDX-1-IRES-GFP、Ad-mNeuroD-IRES-GFP、Ad-mMafA-IRES-GFP感染的小鼠iPS细胞能分化为胰岛类B细胞,RT-PCR结果显示其胰岛B细胞功能基因的表达与小鼠胰岛B细胞株MIN6相似。免疫荧光检测可见胰岛类B细胞内有胰岛素表达。ELISA检测结果显示胰岛类B细胞对不同浓度葡萄糖有较好的反应性。结论胰岛素转录关键调控因子PDX-1、NeuroD1和MafA三者能协同作用,使小鼠iPS细胞分化为具有显著胰岛素合成和分泌能力的胰岛素分泌细胞。     

PDX-1对成肌细胞株C2C12分化为胰岛素分泌细胞的作用

[目的]探讨PDX-1对成肌细胞株C2C12分化为胰岛素分泌细胞的作用.[方法]将C2C12细胞分别经过不同浓度的类胰高血糖素(GLP-1)诱导120 h后,瞬间转染胰腺十二指肠同源框(PDX-1)基因,用RT-PCR检测PDX-1的表达,流式细胞仪、放射免疫法检测细胞内和培养基中是否存在胰岛素.[结果]GLP-1可以直接诱导C2C12细胞表达PDX-1;PDX-1瞬时转染C2C12细胞后,胰岛素分泌细胞阳性率比值(1.19±0.10)、培养基中的胰岛素含量(2.45±1.48)×10-6U/mL均明显升高(P＜0.05);单独的40 nmol/L GLP-1诱导与瞬间转染PDX-1相比,阳性率比值及胰岛素浓度的差别均无统计学意义.[结论]GLP-1可以诱导C2C12表达PDX-1,而且PDX-1可以促进C2C12分泌胰岛素.提示GLP-1诱导C2C12分化为胰岛素分泌细胞可能与PDX-1有关.     

siR N A 干扰 A T1 R 基因调控链脲佐菌素诱导NIT －1细胞凋亡的实验研究

目的：用siRNA干扰技术沉默小鼠胰岛素瘤NIT－1细胞血管紧张素Ⅱ1型受体（ AT1R）基因,探讨其对链脲佐菌素（STZ）诱导的胰岛素瘤细胞凋亡的影响。方法针对小鼠AT1R基因,设计并合成3对siRNA序列,脂质体法转染至NIT－1细胞,荧光显微镜观察荧光强度检测转染效率,Real－time PCR检测AT1R mRNA表达量判断不同干扰序列及干扰时间的基因沉默效果;分4组：空白组不予任何干预,STZ组予5 mmoL／L STZ干预30 min,si－AT1R组予40 nmol／L si－AT1R转染24 h,si－AT1R＋STZ组予40 nmoL／L si－AT1R转染24 h后5 mmoL／L STZ干预30 min;Real－time PCR检测Caspase－3 mRNA表达量,Hoechst33342染色荧光显微镜和Annex-in V－FITC／PI流式细胞术检测细胞凋亡率。结果40 nmol／L siRNA转染的荧光强度最强,转染后AT1R mRNA表达量明显下降,si－AT1R－2转染24 h的沉默效果最佳（92.20％）;Caspase－3 mRNA表达量：STZ组与空白组比增加了2.37倍（P＜0.05）,si－AT1R＋STZ组与STZ组比减少了11.28％,但差异无统计学意义;细胞凋亡率：STZ组与空白组比增加了3.27倍（P＜0.05）,si－AT1R＋STZ组与STZ组比减少了26.82％（P＜0.05）。结论本研究建立了稳定的胰岛细胞AT1R基因沉默模型;RNA干扰沉默胰岛细胞AT1R基因可通过下调Caspase－3 mRNA表达量降低STZ诱导的细胞凋亡率,提示AT1R介导了STZ诱导的胰岛细胞凋亡过程。