维生素C促进小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的实验研究

目的:利用经典的悬滴培养法形成拟胚体(EBs),诱导小鼠胚胎干细胞(m ESCs)在体外分化为心肌细胞,观察维生素C作为诱导剂对m ESCs体外诱导分化为心肌细胞的影响,进而寻找一种高效、安全的诱导方法。方法:复苏m ESCs,传代培养后,利用悬滴法使m ESCs形成拟胚体,用含0.1mg/m L维生素C的分化培养基对其进行诱导分化,以不添加任何诱导剂作为对照组,观察出现搏动拟胚体的时间,搏动拟胚体的数量,计算分化比率,统计搏动频率,并进行免疫荧光染色测定心肌肌钙蛋白T(c Tn T)的表达。结果:小鼠胚胎干细胞可自发分化为心肌细胞,但效率较低,0.1mg/m L的维生素C能明显提高m ESCs分化为心肌细胞的效率,约83.3%的EBs出现搏动,显著高于未添加任何诱导剂组,搏动频率为(81.2±7.8)次/分钟。两组搏动心肌细胞c Tn T免疫染色阳性。结论:维生素C能够显著提高m ESCs向心肌细胞分化效率,应用维生素C体外诱导m ESCs向心肌细胞分化是一种较为理想的体外诱导方式。     

Integrin β1在维生素C诱导小鼠诱导性多能干细胞向心肌样细胞分化中的作用

目的:探讨整联蛋白β1（Integrin β1）在维生素C（Vc）诱导小鼠诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）向心肌样细胞(cardiomyocytes，CMs)分化中的作用。方法: 在立式显微镜下，分别摘取胚胎(12.5 d、14.5 d及16.5 d)BALB/c胎鼠、新生（出生1 d，P1）和成年BALB/c小鼠的心脏，提取总RNA，半定量及实时定量PCR分析心脏发育不同时期Integrin β1的表达。利用悬滴培养形成拟胚体(embryoid　body，EB)的方法体外诱导iPSCs向心肌样细胞分化，诱导过程中分别添加Vc和integrin β1抑制剂（HMβ1-1）处理，共分为3组:对照组、Vc处理组和Vc+HMβ1-1处理组。诱导分化的第3、5、7天，半定量及实时定量PCR检测Oct4、integrin β1和心肌特异性因子（α-MHC、MLC2a）。用免疫荧光染色法检测心肌特异性结构蛋白心肌肌钙蛋白 I（cTnI）的表达。结果: Integrin β1在心脏胚胎发育时期（E12.5、E14.5、E16.5、P1）的表达递增（P<0.01），成年期表达有所回落（P<0.01）。半定量及实时定量PCR的结果提示，Vc组α-MHC、MLC2a的表达显著高于对照组（P<0.01），加integrin β1抑制剂HM β1-1后表达量降低(P<0.01)。跳动EBs计数的结果提示，诱导分化第10、14、18、22、26天，Vc组跳动EBs的百分率显著高于对照组（P<0.01）；而Vc+ HMβ1-1组跳动EBs的百分率相对于Vc组显著降低（P<0.01）。免疫荧光染色显示，Vc组有较强的cTnI表达，添加integrin β1抑制后，Vc+HMβ1-1组cTnI的表达明显减弱。结论: Vc可促进iPSCs向心肌细胞分化，其机制可能是通过integrin β1介导。     

机械牵张对诱导多能干细胞向心肌细胞分化的研究

目的研究机械牵张对诱导多能干细胞向心肌细胞分化效率的影响。方法诱导多能干细胞形成拟胚体后将拟胚体分为四组:对照组(未行牵张处理),牵张组1(5-6天行24小时牵张),牵张组2(5-6天行24小时牵张,7-8天再行24小时牵张),牵张组3(5-6天行24小时牵张,7-10天再行72小时牵张),通过对小鼠诱导多能干细胞施加20%形变率的机械牵张力后,于第15天,分别计数每组跳动克隆数目从而初步在上述四组中选出诱导效率最高组,此后用荧光免疫染色、Westernblot、RT-PCR和激光共聚焦法,进一步鉴定对照组和初步筛选出的牵张组最终分化效率和细胞成熟度差异。结果机械牵张刺激下,分化15天时,牵张组2的跳动克隆数上升(P<0.05),初步筛选出牵张组2可以提高分化效率;统计α-MHC免疫荧光染色面积发现牵张组2是对照组的2.1倍(P<0.05);牵张组2TroponinI的蛋白表达量为对照组的1.7倍(P<0.05);半定量PCR结果发现,心肌细胞标志基因β-MHC,MLC-2v及心肌细胞早期转录因子Nkx2.5的表达量分别提高了6.7倍、4.4倍和11.4倍(P值均<0.05);激光扫描共聚焦显微镜对分化来的单个心肌细胞进行α-actinin观察发现,牵张组2有利于心肌细胞的伸展和成熟。结论初步验证机械牵张力作为一种刺激诱导因素,20%拉伸形变率,牵张组2(贴壁的拟胚体5-6天行24小时牵张,7-8天再行24小时牵张)的处理方法可以显著促进诱导多能干细胞向心肌细胞的分化效率,为以后的深入研究和临床应用提供了实验基础。     

血管内皮生长因子对诱导多能干细胞向心肌细胞分化的影响

目的观察血管内皮生长因子(VEGF)对小鼠诱导多能干细胞(iPSCs)向心肌细胞分化的诱导作用。方法采用悬滴培养法,分别以10、20、50 ng/ml的VEGF对iPSCs细胞进行诱导分化,自然分化作为阴性对照组,加入1%二甲亚砜诱导剂为阳性对照组,倒置显微镜下观察细胞生长情况,记录跳动的拟胚体出现的时间和数目,计算心肌细胞分化率,细胞免疫荧光检测心肌细胞cTnT的表达,RT-PCR检测心肌发育基因α-MHC和β-MHC mRNA的表达。结果与自然分化组相比,三个浓度组的VEGF均可提高iPSCs的心肌细胞分化率(P<0.05),浓度为20 ng/ml时,iPSCs的心肌细胞分化率最高;与二甲亚砜组相比无统计学差异(P>0.05)。分化的心肌细胞可自发搏动,同时表达心肌特异蛋白cTnT和调控心肌发育的基因α-MHC和β-MHC;VEGF可上调α-MHC和β-MHC的表达(P<0.05)。结论 VEGF可以促进诱导iPSCs向心肌细胞分化。     

心肌营养素-1诱导小鼠诱导性多能干细胞心肌细胞定向分化的实验研究

目的:观察心肌营养素-1(CT-1)对小鼠诱导性多能干细胞(miPSCs)心肌细胞定向分化的诱导作用。方法:实验分为对照组与CT-1处理组。miPSCs经悬滴法诱导形成拟胚体,第3天培养基中加入1μmol/ml CT-1(CT-1组),对照组采用普通培养基。于第4、7、10和14天,收取细胞样本,采用实时PCR检测心脏特异标志物基因的表达。用免疫荧光染色及流式细胞术检测干细胞标志物Oct4和心肌特异性分化标志物肌钙蛋白I(cTnI)的表达。用透射电镜观察心肌样细胞的超微结构。结果:CT-1组第10天,样本中心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)基因表达的水平为同期对照组的1.75倍,有显著性差异(P<0.05)。免疫荧光染色法检测显示,两组均有cTnI表达。流式细胞术鉴定的结果显示,对照组与CT-1组cTnI的阳性率分别为28.5%和56.4%,有显著性差异(P<0.05)。电镜观察显示,CT-1组肌原纤维及胞内线粒体明显增多,肌纤维排列规则,可见细胞间桥粒连接和缝隙连接。结论:CT-1可显著提高miPSC向心肌细胞定向分化的效率。     

诱导多能干细胞向心肌细胞分化的研究进展

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是通过重编程体细胞而得到的类似胚胎干细胞和胚胎APSC多能细胞的一种细胞类型。iPSCs向心肌细胞分化是一种使心肌细胞再生,治疗心肌梗死、心力衰竭等相关疾病的一种新兴技术。本文通过对近年来发表的iPSCs向心肌细胞分化的相关文献的整理、总结和分析,介绍近年来iPSCs及其向心肌细胞分化的相关研究进展、所面临的问题以及未来的发展方向。     

胚胎干细胞向心肌细胞诱导分化的研究进展

胚胎干细胞具有多向分化潜能,在器官移植及组织修复治疗方面具有广阔的应用前景。近来研究表明,胚胎干细胞在相关基因、转录因子调控以及体内外细胞因子、激素、微环境等作用下能够诱导分化为心肌细胞。但临床应用胚胎干细胞进行心脏修复治疗还有许多问题需要研究和解决。     

胚胎干细胞向心肌细胞诱导分化的研究进展

胚胎干细胞具有多向分化潜能,在器官移植及组织修复治疗方面具有广阔的应用前景.近来研究表明,胚胎干细胞在相关基因、转录因子调控以及体内外细胞因子、激素、微环境等作用下能够诱导分化为心肌细胞.但临床应用胚胎干细胞进行心脏修复治疗还有许多问题需要研究和解决.     

不同诱导条件对小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的实验研究

目的 :比较小鼠胚胎干细胞 （ESC）在不同诱导条件下分化为心肌细胞的分化比率。方法 :用鼠胚成纤维细胞（MEF）作为饲养层促进 ESC增殖并抑制其分化 ,用维甲酸 （RA ）、二甲基亚砜 （DMSO）、转化生长因子β1 （TGF-β1 ）、激活素 - A（activin- A）为分化诱导剂 ,采用三步法诱导 ESC分化为心肌样细胞 ,并比较各组分化比率。结果 :各组实验用的各种诱导剂均能诱导 ESC分化为心肌样细胞 ,尤以 TGF- β1 （2 ng/m l）、activin- A（2 0 ng/ml）及 2 0 %胎牛血清 （FCS）组成的分化培养基可以使其分化比率高达 88% ,显著高于其它各组 （P<0 .0 1）。结论 :以 MEF饲养层培养 ,TGF- β1 、activin- A作分化诱导剂可作为一种比较简便、稳定、高效的 ESC分化条件。     

间充质干细胞向心肌细胞分化的诱导研究

间充质干细胞是具有多向分化潜能的成体干细胞,能在多种诱导条件下形成心肌细胞。化学因素:化学小分子可以通过改变间充质干细胞DNA甲基化和组蛋白修饰(乙酰化、甲基化和磷酸化等)等表观遗传特性;物理因素:电磁场和力学因素可以诱导间充质干细胞;生物因素:生长因子、激素等对心肌细胞的发育起着重要作用等这些诱导条件,在体外环境下成功诱导间充质干细胞分化为心肌细胞。该文阐述不同的诱导条件对间充质干细胞向心肌细胞分化的影响和相关机制。     

Apelin促进人诱导性多能干细胞心肌定向分化的研究

目的探讨Apelin对人诱导性多能干细胞(hiPSC)的心肌定向分化作用。方法 hiPSC经悬浮法诱导形成拟胚体,分为Apelin处理组(Apelin组)和对照组。Apelin组在高糖DMEM培养液中加入10μmol/ml Apelin,分别于第3、7、11、15、21天采用RT-PCR、Western blot法检测及免疫荧光染色,观察干细胞全能性标记物Oct4、心肌祖细胞标记物Nkx 2.5、心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)的表达变化。结果 Apelin组iPSC在诱导分化后第3天Oct4和Nanog基因表达水平明显降低,分别为同期对照组的(63.2±10.1)%和(51.7±1.6)%(P<0.01);诱导分化后第7天Nkx 2.5和cTnI基因表达水平明显升高,分别为同期对照组的(162.4±22.5)%和(250.6±22.3)%(P<0.05,P<0.01);诱导分化后第15天时,cTnI表达为同期对照组的(156.2±6.4)%(P<0.05);免疫荧光染色显示,cTnI阳性细胞明显多于对照组。结论 Apelin可明显促进hiPSC的心肌定向分化。     

基于iPSC诱导分化具有电生理活动心肌细胞方法的研究

目的:通过诱导多潜能干细胞i PSC体外定向分化为心肌细胞的方法,已经成为干细胞和心血管领域研究的有效工具,也为临床治疗带来新希望。本文依据胚胎发育的分子调控机制,探索建立体外定向分化心肌的方法。方法:使用干细胞培养基培养i PSCs生长至80%,换成含6μmol/L Chir99021和25μg/L Activin A的基础培养基培养48h,基础培养基为含有2%的B27、64μg/L l-ascorbic acid2-phosphate的RPMI 1640培养基,换为含2μM Wnt-C59的WNT信号抑制剂培养基培养48h,最后换为维持培养基继续培养,每两天换液,约第8天可见心肌开始搏动。结果:i PSC在向成熟心肌分化时,显微镜下可观察到明显的肌丝肌节结构,具有心肌特异性标志物TNNT 2,MLC 2a的强阳性表达,并表现出自发跳动的电生理活动。结论:该方法可以成功诱导i PSC高效分化为具有电生理功能的心肌细胞。     

大鼠诱导多能干细胞向肝系细胞的诱导分化

目的本研究探讨利用诱导因子将大鼠诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)快速高效诱导分化为肝细胞样细胞(hepatocyte-like cells,HLCs)。方法利用诱导因子将iPSCs向肝系细胞方向分化,采用免疫细胞化学染色和RT-PCR方法检测培养20 d时细胞各种肝系细胞标志表达。结果培养分化20 d的iPSCs形成肝细胞样集落,表达肝系细胞特征性标志,并且具有尿素合成和糖原贮备能力。结论利用诱导因子可有效地将大鼠iPSCs诱导分化为HLCs,有望为细胞移植治疗各种肝脏疾病提供种子细胞。