三维动态灌注法构建大段组织工程化骨修复羊胫骨干节段性缺损

[目的]观察三维动态灌注法构建的大段组织工程化骨修复羊胫骨干节段性骨缺损的效果.[方法]利用自行设计的灌注型生物反应器对复合骨髓基质干细胞的大段磷酸三钙柱状载体进行动态灌注培养或静态培养2周,通过葡萄糖日耗量、乳酸生成量监测细胞在载体内的扩增.在羊胫骨干节段性骨缺损中分别植入β磷酸三钙、静态培养和动态灌注培养的组织工程化骨,通过X线片、大体观察、硬组织切片和形态计量学检查观察其修复骨缺损的效果.[结果]动态培养法葡萄糖日耗量及乳酸生成量明显高于静态培养法.单纯β磷酸三钙、静态培养和动态灌注培养的组织工程化骨植入骨缺损16周后的临床愈合率分别为0/6、2/6、4/6.动态灌注培养组的材料残余率明显低于单存材料组(P<0.05).[结论]三维动态灌注培养法构建的大段组织工程化骨修复羊长骨节段性缺损的效果优于传统静态培养法.     

动态旋转系统构建组织工程化血管模型中血管内皮细胞分泌功能监测

目的 比较静态和动态旋转系统中构建组织工程化血管模型中血管内皮细胞分泌功能。方法新型可降解材料聚羟基丁酸酯(PHB),用胶原包埋,形成多孔状PHB 胶原管形支架。分离传代、分化人脐静脉内皮细胞,接种于PHB管型支架内腔面,分别在静态、动态旋转系统中培养14 d后,测定血管内皮细胞分泌一氧化氮(NO)、前列环素(PGI2)水平。结果 在动态旋转系统构建组织工程化血管模型中血管内皮细胞分泌NO、PGI2水平显著高于静态系统,在11 d NO分别为(120.52±3.83)μmmol／L、(80.98±5.98)μmmol／L,PGI2分另9为(20.48±1.52)μg／L,(16.59±1.29)μg／L,与静态系统相比,差异有显著性(P<0.05)。结论胶原包埋PHB支架有利于细胞的黏附和生长,可作为组织工程化血管的支架材料。在动态旋转系统构建组织工程化血管模型中血管内皮细胞,具有与正常血管类似的"生理功能"。     

人体尿道粘膜上皮细胞的连续培养

目的：探讨人尿道粘膜上皮细胞体外培养技术，为构建组织工程化尿道提供种子细胞。方法：取尿道下裂患者尿道粘膜，经中性蛋白酶和胰蛋白酶消化，获取粘膜上皮细胞接种于含8％胎牛血清培养基中连续培养，观察细胞形态变化及生、增殖过程。结果：体外培养细胞长满后呈上皮细胞特有的铺路石样外观，体外可连续传9-10代，生长期50-60d。细胞角质蛋白免疫组织化学染色阳性，透射电镜下可见上皮细胞间特有的桥粒结构。结论：尿道粘膜上皮细胞可在体外连续培养，4代以内的培养细胞可用于组织工程化尿道的构建。     

组织工程化肌腱体外构建的环境优化及系统设计

目的 设计一套构建具有一定功能和形态的肌腱组织的体外培养方法。方法 根据肌腱细胞体内的生物力学环境，在细胞的培养过程中，设计一套能够提供张力和参数测量系统的生物反应器，在肌腱的培养过程中对肌腱施加不同形式的张应力作用，以期在体外获得力学性能优化的自体肌腱。结果 细胞培养和张应力控制系统是由完全透明的有机材料制成的，整个系统由细胞培养室、测量系统和排换液系统等部分构成，在长期的肌腱细胞培养中，可提供肌腱一材料支架动态的培养方式。细胞培养室能很方便与气动肌腱连接，产生持续的脉冲张力作用。结论 用肌腱生物反应器可以使肌腱组织复合物在形成过程中始终处于力学环境中，促进肌腱组织中胶原纤维的平行排列，提高肌腱的力学性能，为组织工程化肌腱的产业化提供一种新的方法。     

生物组织工程化气管的研究进展

生物组织工程化气管是利用组织工程学的原理和技术在体外构建出具有气管主要生理功能的一种具有生物活性的人工气管，作为气管缺损外科修复的气管替代物。它的构建过程是，首先选取一定数量的经体外培养扩增种子细胞，把它们种植在生物相容性好、可降解的支架材料上；然后将此细胞材料复合物置于生物反应器当中或自体皮下，经过一段时间的诱导分化和培养即形成组织工程化气管。与其它种类的气管替代物相比，组织工程化气管具有无免疫原性、无排斥反应、有生物活性等优点，这将为寻找一种适合机体内环境的气管移植材料带来一条有希望的途径。但是该领域的研究工作还面临着诸如组织工程化气管的血管化、体外培养和植入后的感染等难题，要将组织工程化气管真正应用到临床，还有很长的路要走。我们从细胞支架的研究、种子细胞的选择和组织工程化气管的构建这三方面对组织工程化气管的研究进行综述。     

多孔明胶微载体旋转培养hMSC的研究

[目的]观察利用多孔微载体结合旋转细胞培养系统(rotary cell culture system,RCCS)培养人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cell,hMSC)对其增殖的影响。[方法]体外分离hMSC,扩增至第2代(P2)后分为两组。实验组采用多孔明胶微载体CultiSpher G在RCCS内进行动态培养,对照组则继续静止培养。应用倒置显微镜、扫描电镜对微载体表面的细胞粘附、生长情况进行观察,并在不同的时相点取样,行细胞计数、MTT检测,了解细胞的增殖情况。[结果]接种24 h后,大部分细胞贴附于微载体表面,随培养时间延长细胞数量增多并分泌大量基质。MTT检测及细胞计数提示细胞对数生长期较静止培养方法延长,达到生长高峰时旋转培养方法收获细胞总量为接种时10.75倍,而静止培养方法为3.19倍;细胞周期检测两种方法差别不大,大部细胞均处在S1期。[结论]Culti Spher G微载体旋转培养系统是体外扩增hMSC的有效方法,利用该系统可为工程化组织的构建提供大量特性稳定的种子细胞。     

猪骨髓间质干细胞分离培养及向成软骨细胞表型诱导分化的实验研究

目的建立猪骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)体外分离培养和在特定诱导液作用下向成软骨细胞表型转化,为其作为组织工程化软骨的种子细胞提供实验基础。方法取猪的胸骨骨髓6~8ml,经密度梯度离心法得到骨髓单个核细胞,在低糖改良Eagle's细胞培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM)培养2周,将其分为两组,对照组应用高糖DMEM无血清完全培养基培养;实验组在对照组培养基基础上加入转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1),在显微镜下观察细胞形态,第7,14d时用免疫组织化学法检测型胶原分泌。结果诱导早期两组细胞形态变化不明显,3d后实验组MSCs由纤维样梭形逐渐向多角形、多边形转变;实验组第7,14d型胶原免疫组织化学阳性,对照组为阴性。结论体外培养猪的BMMSCs生长稳定,传代后仍保持未分化状态,具有分化为软骨的潜能,为基础研究和组织工程提供了一个理想的种子细胞来源。     

应用旋转细胞培养系统建造组织工程化人工软骨的实验研究

组织工程学的兴起 ,为临床上修复因各种原因导致的软骨缺损带来了希望[1 ,2 ] 。旋转细胞培养系统 (ＲＣＣＳ)具有模拟微重力、高密度培养细胞、组织的特性[3] 。目前 ,国外已经将其广泛用于组织工程研究领域。本研究旨在应用ＲＣＣＳ进行组织工程化人工软骨的再造研究 ,探讨ＲＣＣＳ提供的外部环境对形成组织工程化人工软骨的影响。1.材料与方法 :Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶购于Ｓｉｇｍａ公司 ;乙交酯和丙交酯的共聚物 (ＰＬＧＡ)泡沫材料由中国科学院化学所提供 ,材料孔径为 2 0 0～ 30 0 μｍ ,孔隙率为 90 % ;ＲＣＣＳ购于Ｓｙｔｈｅｃｏｎ…     

人组织工程软骨的实验研究

目的　了解组织工程研究的基本原理 ,完善制作组织工程化人软骨的技术方法 ,探讨天然可吸收材料组织 ,引导再生胶原膜作为人软骨细胞体外培养支架的可行性 ,为广泛开展组织工程的研究与应用开辟新的途径。方法　利用组织工程技术制作人组织工程化软骨 ,并应用组织学方法 ,对获得的人组织工程化组织形态和功能进行表征。结果　培养的软骨细胞均匀沉降于医用组织引导再生胶原膜上 ,1周后形成一层乳白色软骨样组织 ;植入 8周后从裸鼠体内获得软骨样组织 ,组织学检测证实软骨细胞的存在 ,软骨细胞可以分泌硫酸软骨素。结论　医用组织引导再生胶原膜以其特有的三维结构和细胞网结功能 ,可以作为组织工程技术应用研究中软骨细胞培养的支架 ;利用组织工程技术 ,能够完成人组织工程化软骨的制作。     

泌尿外科组织工程技术的研究现状和展望

泌尿外科组织工程技术为泌尿道的组织、器官的微创修复和功能重建带来了新的希望。近年来，有关泌尿系组织工程的种子细胞和支架材料的研究以及组织工程化组织如肾脏、输尿管、膀胱、尿道、阴茎海绵体等的实验和临床研究报道层出不穷。其基本方法是应用细胞生物学和工程学的原理，将体外培养扩增后具有生物学活力及特定功能的细胞（种子细胞）与可降解生物支架材料复合，然后将该细胞-支架复合物（组织工程化组织）植入体内组织缺损部位，     

组织工程化小口径血管在体移植的研究

我们通过体外构建、体内培养的方法构建组织工程化和血管,然后植入动物的股动脉,探讨利用小口径组织工程化血管进行血管移植的可能性.     

生物反应器在组织工程中的应用进展

工程化大块组织的构建是目前组织工程研究中遇到的一个难题。工程化组织没有自己的血供系统,营养物质的供给和代谢产物的排出主要通过弥散和渗透作用完成,且这些作用是有限的,因此阻碍了工程化大块组织的构建。针对这一难题,国内外许多研究机构将生物反应器应用到工程化组织的构建过程中。近年出现的各种各样生物反应器的共同特点是既明显改善了工程化大块组织内部的物质转运,又对复合在各种支架材料上的种子细胞施加了适当的流体应力刺激,更有利于工程化组织的构建。动态的物质转运及流体应力是生物体内重要的两个微环境因素,生物反应器能够在一定程度上模拟这种体内微环境,因此对构建工程化组织具有重要意义。     

应用生物反应器构建组织工程化血管的实验研究

目的探讨利用生物反应器体外构建具有完整结构的组织工程化血管的可行性。方法从6月龄毕格犬颈总动脉获取平滑肌细胞,颈外静脉获取内皮细胞,经体外培养扩增。然后,先将平滑肌细胞接种于聚羟基乙酸(PGA)上,形成细胞—材料复合物,将该复合物置于生物反应器内培养。模拟成年哺乳动物循环系统的参数,予以动态力学刺激(搏动频率:75次/分;扩张量<5%)。8周后,在其上接种内皮细胞,对照组不接种内皮细胞,培养5d后取材检测。结果组织学染色显示,平滑肌纤维成分排列较规则,有层次感,内皮细胞完整;对照组未见内皮细胞层结构。结论利用生物反应器可在体外构建具有完整结构的组织工程化血管。     

组织工程化人工骨修复骨缺损的实验研究

[目的]观察兔骨髓基质细胞与生物活性玻璃联合培养构建的组织工程化人工骨修复兔桡骨缺损的效果,探讨组织工程化人工骨促进骨缺损修复的作用机制.[方法]体外分离培养兔的骨髓基质细胞,经过传代扩增后,与生物活性玻璃联合立体培养构建组织工程化人工骨后,植入兔桡骨缺损处.通过大体形态观察、影像学、组织学、扫描电镜检查及生物力学分析,分别与单纯植入生物活性玻璃、髂骨以及空白组进行对比,观察各组对骨缺损修复的效果.[结果]植入组织工程化人工骨的兔桡骨缺损完全愈合,成骨效果与自体髂骨相似明显优于其他组.[结论]骨髓基质细胞复合生物活性玻璃构建的组织工程化人工骨能很好的完成骨缺损的修复.     

组织工程化血管的研究现状

组织工程化血管是在体外构建有生理活性的血管移植物,为心血管外科临床提供新的血管替代物来源。本文介绍近年来血管组织工程所涉及的主要环节,包括种子细胞、支架材料及构建方法新进展及该领域今后的发展方向。     

利用ADSCs在生物反应器中构建小口径血管的初步研究

目的 尝试利用人的脂肪基质干细胞(Adipose-derived stromal cell,ADSCs)在生物反应器中构建组织工程化小血管.方法 采用脂肪抽吸术获取人脂肪组织,将脂肪细胞分离、传代培养;对培养的第三代细胞进行脂肪干细胞表型鉴定;同时称取一定量的聚羟基乙酸(PGA)制成片状材料,消毒晾干备用,将细胞接种在PGA材料上,静态培养半天后置于生物反应器中动态培养4周,然后进行初步检测.结果 从形态学观察,细胞伸展呈成纤维细胞样,生长有方向性,5～6 d后可见克隆开始形成.对第三代ADSCs进行检测,结果显示除CD166、CD105有高的表达外,CD14、CD34表达很低.从反应器取出的样品能形成血管样组织,扫描电镜观察:样品基质分泌旺盛.结论 采用组织工程方法,从动态培养的角度可以在体外利用ADSCs构建血管形状的组织,为进一步研究ADSCs在血管组织工程中的应用提供了一种好的方法.     

组织工程化血管构建的初步实验研究

目的探讨组织工程化血管构建的初步实验方法。方法预构具有三维结构的胶原蛋白-几丁聚糖骨架,以人血管内皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞作为种子细胞,培育后二步法种植并行工程化血管成熟培养。经生物学检测,补片修补实验鼠腹主动脉人为缺损。结果人血管内皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞可作为种子细胞应用;预制的三维骨架具有良好的组织和细胞兼容性,种植种子细胞后可形成良好的细胞黏附、生长;体外静态及生物反应器培养,工程组织中细胞数及细胞外基质含量明显增加（P〈0．05）;血小板凝集试验表明该工程组织具有一定的抗凝特性;修补大鼠腹主动脉缺损,术后10d可维持通畅。结论胶原蛋白-几丁聚糖预构的三维骨架可应用于血管组织工程研究,细胞种植后经成熟培养,可初步构建具有一定强度和抗凝特性的组织工程化血管。     

组织工程化软骨分泌蛋白的初步蛋白质组学分析

目的通过蛋白质组学筛选组织工程化软骨分泌的可溶性蛋白中具有软骨诱导作用的因子。方法分别培养人软骨细胞与皮肤成纤维细胞,接种到PGA上,两种细胞-材料复合物培养2周后,移至无血清培养基中培养6d,并收集所有培养液,用于差异蛋白质组学分析。结果蛋白组学分析显示有21个差异点。对其中差异最大的点作质谱分析,显示该蛋白与Col2A1异构体2最为匹配。结论用蛋白质组学方法 ,可以高通量筛选软骨细胞分泌的,与软骨分化相关的重要蛋白;Col2A1异构体2可能与软骨分化有关。     

脐静脉内皮细胞来源的微囊泡促进腹膜样组织血管化的初步研究

目的探讨人脐静脉内皮细胞(hUVECs)来源的微囊泡(MVs)促进大鼠腹膜间皮细胞(rPMC)增殖及促进组织工程化腹膜样组织血管化的作用。方法采用胶原酶消化法获得hUVECs,无血清培养法刺激释放MVs,并对MVs行电镜检测。rPMC与hUVECs来源的MVs体外共培养,对细胞及上清液分别行CCK、ELISA和RT-PCR检测。将rPMC种植在小肠粘膜下层(SIS)表面,分别与加入MVs的培养基和单独培养基预培养1周后,植入裸鼠皮下;2周后取出移植物行HE染色,镜下观察。结果透射电镜下可以看到有完整的膜结构的hUVECs分泌的MVs。加入MVs组与对照组相比,能明显促进rPMC增殖(P<0.05),同时在上清液中加入MVs组VEGF浓度明显高于对照组(P<0.05)。分别对两组rPMC行VEGF的RT-PCR检测,加入MVs组比对照组表达明显增高。对取出的移植物行HE染色,加入MVs组和对照组相比,可见新生的微血管密度明显增高(P<0.05)。结论 hUVECs来源的MVs能够明显促进rPMC的增殖,诱导rPMC产生VEGF高表达,刺激组织工程化腹膜样组织血管化,为以腹膜间皮细胞作为尿道组织工程种子细胞和大范围尿道缺损修复提供了理论基础。     

骨髓间充质干细胞复合组织工程化脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤

目的：体外培养扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs），复合组织工程化脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤，为进一步临床应用奠定基础。方法：将SD大鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增后，以生长状态良好的骨髓间充质干细胞接种于制备好的组织工程化脱细胞真皮支架上，进行体外联合培养，构建组织工程皮肤。观察细胞生长情况及组织工程皮肤结构。结果：体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞生长良好，传代扩增容易，组织工程化脱细胞真皮基质去细胞完全，骨髓间充质干细胞在脱细胞真皮基质中生长良好，可体外构建组织工程皮肤。结论：利用体外扩增培养的骨髓间充质干细胞及制备的组织工程化脱细胞真皮基质可以体外联合构建组织工程皮肤。