体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为T淋巴细胞

目的 体外诱导小鼠胚胎干细胞(ESC)分化为T淋巴细胞. 方法 借助小鼠胚胎干细胞体外自然分化形成的类胚体(EB)中含有=三胚层细胞的独特细胞环境,加入多种细胞因子和胸腺肽α1,体外诱导小鼠ESC向T淋巴细胞分化.利用流式细胞仪在不同时间点检测诱导细胞表面T淋巴细胞发育相关的表面标志CD25、CD44、CD3、CD4、CD8以及T细胞受体(TCR)αβ和TCRγδ分子的表达水平. 结果 诱导3 d后,出现CD44+细胞;第6天出现CD44+、CD44+CD25+和CD25+细胞群;第15天开始表达CD3分子;1周后开始出现CD4+CD8+双阳性细胞.随着诱导时间的延长,CD3+细胞和CD4+CD8+细胞的百分比不断升高.培养1个月后,出现少量的CD4+和CD8+的单阳性细胞.诱导细胞早期表达TCRαβ和TCRγδ.随着诱导时间的延长,T细胞进一步成熟,诱导细胞以TCRαβT细胞为主. 结论 细胞因子和胸腺肽α1的共同作用可以在体外诱导小鼠胚胎干细胞分化成具有T淋巴细胞表型的细胞,且细胞的表型变化与T细胞体内正常的胸腺发育过程中的表型变化一致.     

食蟹猴胚胎干细胞的培养及向神经细胞诱导分化

目的 建立食蟹猴胚胎干细胞系体外培养体系,并诱导其向神经细胞分化,为在体移植实验奠定基础。方法 用小鼠胚胎成纤维细胞作为滋养层,长期培养食蟹猴胚胎干细胞。在无血清培养基中添加小鼠重组Noggin的方式诱导其向神经细胞分化,并对分化各阶段细胞进行免疫组化染色检测分化效果。结果 食蟹猴胚胎干细胞在滋养层上成克隆样生长,可以长期扩增超过20代并保持胚胎干细胞的特性。诱导向神经细胞分化约14d,即可形成呈玫瑰花环样的神经前体细胞结构,可见大量Nestin阳性细胞,及部分Tuj-1阳性细胞;分化约21d时,可见大量Nestin阳性细胞以及大量Tuj-1阳性细胞;分化超过35d,可见GFAP阳性细胞,而Tuj-1阳性细胞减少。结论 成功建立食蟹猴胚胎干细胞的培养体系,在此基础上诱导其分化可获得大量神经前体细胞,尤其是早期神经细胞。     

体外定向诱导胚胎干细胞分化为表皮样干细胞的研究

目的　探索体外定向诱导小鼠胚胎干细胞 (embryonicstemcell,ES)分化为表皮样干细胞的条件 ,为胚胎干细胞来源的表皮样干细胞的临床应用 ,及ES细胞的定向分化机制的研究奠定基础。　方法　采用与人羊膜共培养法对小鼠胚胎干细胞进行定向诱导。实验分 3组 :1 羊膜上皮面向上 ,铺布全孔底 ;2 羊膜上皮面向上 ,铺布半孔底 ;3 以不加羊膜组为对照。用流式细胞仪、免疫组织化学技术对分化后的细胞进行鉴定。　结果　共培养 3～ 4d后 ,在第 1、2实验组中的人羊膜上皮面上 ,小鼠ES细胞形成表皮样干细胞集落 ,表达高水平的表皮干细胞特异标志物整合素 β1 、CK19和CK15。流式细胞仪检测结果显示 :整合素 β1 、CK19和CK15阳性细胞比率均较对照组有显著差异 (P <0 0 1)。而在第 2实验组中无羊膜覆处 ,细胞贴壁生长 ,形成表皮样细胞单层 ,细胞呈多边形 ,排列紧密 ,表达整合素 β1 ,仅见少数CK19和CK15阳性细胞散布于表皮样细胞之间。流式细胞仪检测结果显示 :整合素 β1 阳性细胞率与对照组有显著差异 (P <0 0 1) ,而CK19和CK15阳性细胞率与对照组差异不明显。　结论　人羊膜可诱导小鼠胚胎干细胞向表皮样细胞定向分化 ,并提示生长在羊膜上皮面上的细胞克隆可能是表皮样干细胞 ,而贴壁生长的细胞可能是表皮样细     

胚胎干细胞的定向心肌分化及其调控机制

胚胎干细胞是具有分化为各种类型组织细胞潜能的全能干细胞,可在体外大量扩增,细胞因子、激素、诱导剂和细胞内转录因子等可诱导和调控胚胎干细胞进行心肌细胞定向分化,这将使干细胞移植治疗心肌损伤性疾病成为可能.探讨胚胎干细胞向心肌细胞的定向分化及其调控机制,进而可在体内外调控干细胞向心肌细胞的定向分化,这将为临床应用干细胞分化新生心肌细胞以治疗心肌损伤性疾病提供理想的细胞来源和可靠的理论依据.     

体外诱导人胚胎干细胞向神经细胞分化的研究进展

<正>胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)是从着床前胚胎内细胞团(inner cell mass,ICM)中分离出来的能在体外培养的一种全能干细胞。它具有在体外可以大量增殖并保持未分化状态和在一定条件下能向内、中、外三个胚层组织和细胞分化的生物学特性。胚胎干细胞也易于进行基因改造操作和制造嵌合体动物,从而成为细胞与个体之间的桥梁以及临床移植治疗新的细胞来源。1998年Thomoson等与shanablott等分别建立了来源于人类胚细胞群和原始生殖细胞的人胚胎干细胞系,科学家们看到了在体外培育所需的组织细胞以取代患者体内的病损组织细胞来治疗多种疑难病的曙光。     

CREG基因沉默诱导小鼠ESCs来源的EBs自发性凋亡

目的: 探讨E1A激活基因阻遏子(CREG)基因沉默诱导鼠源性胚胎干细胞(ESCs)来源的胚胎小体(EBs)自发性凋亡的作用。方法: 应用pDS-shRNA-CREG逆转录病毒真核表达载体和绿色荧光蛋白(GFP)的对照载体,感染鼠源性胚胎干细胞R1,筛选获得稳定的细胞克隆(R1-shCREG和R1-GFP);用小鼠胚胎成纤维细胞株STO作为饲养细胞,进行R1、R1-shCREG和R1-GFP细胞培养。倒置显微镜观察3种ESCs的生长情况。碱性磷酸酶(AKP)染色和小鼠心肌接种畸胎瘤形成实验检测转染后ESCs分化情况。当ESCs生长至亚融合状态时进行传代,去除白血病抑制因子(LIF)并悬浮培养制备EBs。用RT-PCR技术和Western blotting方法分别检测3组EBs培养7 d时CREG和cleaved caspase-3蛋白和mRNA的表达, Annexin V/PI流式细胞术检测EBs细胞凋亡情况。结果: 经pDS-shRNA-CREG逆转录病毒真核表达载体及 GFP的质粒载体转染获得稳定转染的细胞克隆。AKP染色证实R1、R1-GFP和R1-shCREG 3组ESCs均保持未分化状态。同时,体内和体外分化研究证实,R1和R1-GFP组细胞具有三胚层分化能力,小鼠心肌内注射的ESCs形成畸胎瘤组织;而R1-shCREG则不能够形成畸胎瘤类似物,细胞分化能力降低,且细胞死亡现象增加。培养7 d的R1-shCREG/EB组 CREG蛋白表达量较R1/EB组和R1-GFP/EB组均降低; CREG的mRNA表达下降;而cleaved caspase-3 mRNA和蛋白表达均显著升高;同时, R1-shCREG/EB细胞凋亡率明显升高。结论: 下调CREG表达可抑制ESCs分化,促进ESCs来源的EBs细胞凋亡的发生。     

胚胎干细胞的定向心肌分化及其调控机制

胚胎干细胞是具有分化为各种类型组织细胞潜能的全能干细胞,可在体外大量扩增,细胞因子、激素、诱导剂和细胞内转录因子等可诱导和调控胚胎干细胞进行心肌细胞定向分化,这将使干细胞移植治疗心肌损伤性疾病成为可能。探讨胚胎干细胞向心肌细胞的定向分化及其调控机制,进而可在体内外调控干细胞向心肌细胞的定向分化,这将为临床应用干细胞分化新生心肌细胞以治疗心肌损伤性疾病提供理想的细胞来源和可靠的理论依据。     

分子影像学方法示踪胚胎干细胞移植治疗急性肝损伤

背景：胚胎干细胞具有多向分化潜能,已被用于急性肝损伤的治疗,但其在体内治疗过程中的增殖迁移情况尚不清楚。 目的：利用分子影像技术监测移植胚胎干细胞在急性肝损伤修复过程中的行为。 方法：利用慢病毒载体,将萤火虫荧光素酶、红色荧光蛋白以及单纯疱疹病毒胸苷激酶三融合基因转入小鼠胚胎干细胞(D3)中,筛选得到稳定整合3个报告基因的D3胚胎干细胞系。将上述胚胎干细胞或分化了6 d的拟胚体细胞通过脾脏注射到急性肝损伤SV129模型小鼠体内,利用生物发光成像技术监测移植的细胞。 结果与结论：RT-PCR结果显示,三融合基因的转入并未影响胚胎干细胞Oct-4和Nanog的表达。利用小动物活体成像系统可以观察到移植细胞从脾脏迁移到肝脏的过程。移植的胚胎干细胞和拟胚体细胞都在肝脏处形成畸胎瘤,由于单纯疱疹病毒胸苷激酶同时也是自杀基因,可以与更昔洛韦作用诱导转基因细胞死亡,通过注射更昔洛韦来抑制畸胎瘤的生长并逐步将其杀死。组织学分析显示,畸胎瘤里包含来自于3个胚层的组织。提示三融合基因的转入并未影响胚胎干细胞的多向分化潜能,且胚胎干细胞用于细胞治疗有潜在的成瘤风险,影响了对肝损伤的修复,治疗策略有待进一步改进,并需要实时监控其在体内的行为。     

类胚体中残留胚胎干细胞数量与其致瘤性相关性的初步研究

目的 探讨类胚体(EBs)中残留未分化胚胎干细胞(ESCs)的数量与其致瘤性的相关性.方法 小鼠R1胚胎干细胞株,体外类胚体诱导分化10d,流式细胞仪检测残留未分化ESCs表面标志SSEA-1阳性率.将第10天EBs消化打散后重新给予ESCs常规培养体系培养,观察EBs中残留未分化ESCs形态,流式细胞仪检测残留细胞表面标志物;第10天EBs消化打散后以104～2×106细胞量分别注射至裸鼠四肢肌肉内,观察不同细胞数量与畸胎瘤形成的相关性.结果 ESCs分化为EBs 10 d后有(13.5±0.75)%的细胞表达SSEA-1,提示存在残留未分化ESCs.残留未分化细胞生长形态呈克隆样,高表达SSEA-1等未分化ESCs标志.EBs消化打散后仅在注射2×l06个细胞的部位形成畸胎瘤,瘤体组织中存在成熟的内胚层、中胚层和外胚层组织,其余各组均未见畸胎瘤的形成.结论 胚胎干细胞分化为类胚体后仍存在残留未分化胚胎干细胞,并需要一定细胞数量才具有致瘤性.     

维甲酸诱导小鼠胚胎干细胞向神经样干细胞分化

目的探讨维甲酸（RA）诱导体外培养的小鼠胚胎干细胞（ESC）向神经样干细胞定向分化。方法在无白血病抑制因子（LIF）存在的条件下，将体外培养的ESC悬浮培养4天，形成拟胚体（EB），再经RA诱导4天后进行细胞冰冻切片，行免疫细胞化学染色计数生殖特异性基因Oct-4和神经干细胞特异性标志物Nestin的表达百分率。结果经诱导的ESC呈现Oct-4阳性细胞百分率为67．34％，而Nestin阳性细胞百分率为36．52％。结论体外培养的小鼠ESC经RA诱导后有部分细胞定向诱导分化为神经样干细胞。     

生殖细胞核因子在精原干细胞体外培养分化中的表达

目的 将分离纯化的小鼠精原干细胞(SSCs)体外培养并诱导分化,检测生殖细胞核因子(GCNF)在小鼠SSCs诱导分化前后的表达.方法 用干细胞因子(SCF)诱导小鼠SSCs向精母细胞分化,通过间接免疫荧光染色和RT-PCR,检测GCNF在小鼠SSCs诱导分化前后的表达.结果 小鼠SSCs向精母细胞诱导分化前后,在倒置相差显微镜下进行形态学观察,细胞形态未发生明显变化,仍然呈圆形或椭圆形,核较大;间接免疫荧光及RT-PCR结果均显示,原代培养的小鼠SSCs呈现GCNF阴性,但是向精母细胞诱导分化2d后,GCNF开始表达.结论 GCNF在体外培养小鼠SSCs向精母细胞分化的早期有表达,提示GCNF可能参与了SSCs的早期分化.     

胚胎干细胞来源的巢蛋白阳性细胞向胰岛素分泌细胞分化的实验研究

目的探讨胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的诱导，为糖尿病患者实施细胞移植治疗建立基础。方法将胚胎干细胞（ESC）在成纤维细胞（MEF）饲养层上扩增后脱离饲养层，让ESC自发分化成拟胚体（EB），再将EB诱导为巢蛋白（nestin）阳性的神经前体细胞（NPC），最后将NPC诱导成胰岛素分泌细胞（IPC）。结果ESC在MEF饲养层上扩增4d后，在悬浮培养状态下自发分化为EB。将EB在NPC选择性培养基中做贴壁培养后，ESC先分化为上皮样细胞，再分化为神经细胞样细胞。经过nestin免疫组化检测，在经过NPC培养基诱导4d的细胞，nestin阳性细胞占86．5％。nestin阳性细胞在IPC选择性培养基中诱导5～6d后，可分化成胰岛素分泌细胞。结论ESC来源的nestin阳性细胞既可以分化为NPC，也可以分化为IPC。     

Derivation, characterization and differentiation of human embryonic stem cells: comparing serum-containing versus serum-free media and evidence of germ cell differentiation

BACKGROUND: This study was designed to establish human embryonic stem cell (hESC) lines, to identify the differences when maintained in serum-containing versus serum-free medium and to test their potential of in vitro differentiation. METHODS: Procedures including immunosurgery were performed on 11 donated human blastocysts to establish hESC lines. The cell lines were characterized and maintained using either serum-free or serum-containing media to compare their morphology, Oct-4 expression, apoptosis and growth speed. Differentiation of these lines was evaluated by the morphology and the expression of genes belonging to the three embryonic germ layers and the germ cell lineage. RESULTS: Three hESC lines were established, and they grew at similar speed in both media (serum-containing or serum-free), but hESC cultured in serum-containing medium yielded significantly higher percentages of morphologically good colonies and cells expressing Oct-4. These cell lines differentiated spontaneously in vitro into cells expressing markers belonging to all three embryonic germ layers and germ cell markers, including c-Kit, STELLA, VASA and growth differentiation factor 9 (GDF9), in directly adherent culture. CONCLUSIONS: Three hESC lines with Taiwanese ancestry have been established, and they retain the in vitro differentiation potential with or without embryoid body (EB) formation. The data support that hESC may be capable of differentiation into germ cells although further confirmation is needed. It is also suggested that strategies such as stepwise adaptation will be needed before implementing a serum-free culture condition for hESC lines that have previously been derived in a medium containing serum.     

持续Wnt信号通路激活促进胚胎干细胞源造血干细胞的增殖

背景：如何提高胚胎干细胞诱导效率、促进胚胎干细胞源造血干细胞体外增殖成为目前急需解决的课题。目的：以外源性Wnt3a作为诱导剂,激活培养中的小鼠胚胎干细胞Wnt/β-catenin信号通路,观察该通路的激活是否促进胚胎干细胞向造血祖细胞的定向分化。方法：用外源性wnt3a(100 µg/L)持续作用ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞21 d,通过细胞免疫荧光及蛋白免疫印迹检测细胞内β-catenin蛋白含量,QRT-PCR检测Wnt下游靶标基因的表达量来确定经典Wnt/β-catenin信号通路是否被激活,然后采用单层贴壁培养法诱导其向造血干细胞分化,流式细胞仪检测造血发育相关表面标志CD34⁺/Sca-1⁺,同时以QRT-PCR法检测造血相关基因的表达情况。结果与结论：ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞经wnt3a(100 µg/L)连续培养21 d后发现β-catenin蛋白在细胞内积累;Wnt信号通路的下游靶标基因Pitx2、Frizzled、Sox17、Oct4的表达量均出现不同程度的增加,可见经典Wnt/β-catenin信号通路有被激活;单层贴壁培养法诱导其向造血干细胞分化的过程中检测到CD34⁺/Sca-1⁺细胞含量在14 d时占总细胞量高达20.2%,而对照组的仅占11.9%。造血相关基因骨形态发生蛋白4、FLK2及CD34的表达量均增加,而Smad5的表达则明显受到抑制。说明Wnt3a持续作用可激活Wnt/β-catenin信号通路,并促进ES-E14TG2a小鼠胚胎干细胞向造血干细胞的定向分化。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

In vitro direct osteogenesis of murine embryonic stem cells without embryoid body formation

Embryonic stem cells (ESCs) posses the ability to self-renew and differentiate into a multitude of lineages, including the osteogenic lineage in vitro. Currently, most approaches have focused on embryonic body (EB)-mediated osteogenic differentiation, which relies on formation of all three germ layers resulting in limited yields and labour-intensive culture processes. Our study aimed at developing an efficient culture strategy resulting in the upregulated in vitro osteogenic differentiation of murine ESCs (mESCs), which completely avoided EB formation. Specifically, mESCs were cultured in HepG2 conditioned medium for 3 days and then directed into osteogenic differentiation for 21 days without prior EB formation. The mineralised bone nodules generated were characterized by Alizarin red S-staining, phenotypic alkaline phosphatase expression, time-course analysis of ALPase activity, the presence of type I collagen and osteopontin, and osteocalcin, cbfa-1/runx-2, and osterix gene expression. Our method of direct osteogenic differentiation of mESCs represents a novel and efficient approach that results in enhanced yields and could have significant applications in bone tissue engineering.     

Pluripotent stem cell lines

The derivation of human embryonic stem cells 10 years ago ignited an explosion of public interest in stem cells, yet this achievement depended on prior decades of research on mouse embryonic carcinoma cells and embryonic stem cells. In turn, the recent derivation of mouse and human induced pluripotent stem cells depended on the prior studies on mouse and human embryonic stem cells. Both human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells can self-renew indefinitely in vitro while maintaining the ability to differentiate into advanced derivatives of all three germ layers, features very useful for understanding the differentiation and function of human tissues, for drug screen and toxicity testing, and for cellular transplantation therapies. Here we review the family of pluripotent cell lines derived from early embryos and from germ cells, and compare them with the more recently described induced pluripotent stem cells.     

胚胎干细胞向表皮样干细胞分化体外条件的研究

目的　探索体外诱导胚胎干细胞分化为表皮样干细胞的最佳条件 ,为研究其分化的调控机理及寻找新的皮肤组织工程种子细胞奠定基础。方法　将小鼠胚胎干细胞与人羊膜共培养 ,以不同的羊膜铺布方式 ,分 4个实验组 :(1)羊膜上皮面向上铺布全孔底 ,(2 )羊膜基底面向上铺放全孔底 ,(3)羊膜上皮面向上铺布半孔底 ,(4)羊膜基底面向上铺布半孔底 ,以未加羊膜为对照组 ,倒置显微镜下观察细胞的生长和形态分化 ,用抗 β1整合素单克隆抗体免疫组化检测胚胎干细胞向表皮样干细胞的分化。结果　培养 4～ 5d后 ,实验组 (3)中的ES细胞分化为表皮样干细胞 ,细胞呈多边形 ,体积增大 ,排列紧密 ,形成大面积细胞单层 ,而其他各实验组 ,ES细胞虽可分化为表皮样细胞 ,但呈集落生长 ,不形成细胞单层 ;对照组大量细胞死亡 ,形态各异。各实验组的细胞绝大多数呈现 β1整合素阳性 ,而对照组未见 β1整合素阳性细胞。结论　与羊膜共培养可诱导胚胎干细胞分化为表皮样干细胞 ,羊膜上皮面向上铺布半孔底的效果最佳     

人胚胎生殖干细胞移植对大鼠心肌梗死的影响

目的:探讨直接注射移植人胚胎生殖干细胞对大鼠心肌梗死的影响.方法:缝扎SD大鼠左冠状动脉前降支,建立心肌梗死模型.取5～10周人胚胎生殖腺嵴,组织块体外培养,生物学鉴定为人胚胎生殖干细胞(hEG).将其直接注射于大鼠急性心肌梗死边缘.于移植后1 d、1、2、4周处死大鼠,免疫组织化学方法观察心肌特异转录因子GATA-4和抗人细胞核抗体MAB1281在移植细胞的表达.结果:免疫组织化学显示移植组MAB1281检测阳性,GATA-4在移植细胞阳性表达.结论:hEG细胞直接注射移植大鼠心肌梗死处,细胞能存活并呈现向心肌细胞分化的表现,显示出正常心肌细胞的光镜结构.     

多潜能干细胞的研究进展

多潜能干细胞是一类具有向外胚层、中胚层以及内胚层细胞分化的干细胞,从胚胎发育早期分离获得的胚胎干细胞、胚胎生殖细胞到成体组织骨髓、睾丸中获得的干细胞,都具有三胚层分化能力.近年来,研究证实,可以将成体分化细胞经基因操作逆转为多能干细胞.就各种来源多潜能干细胞的特点予以综述,并对细胞间可能存在的关系加以探讨.