SLP-2基因反义核酸对食管鳞癌细胞系TE12生长和增殖的影响

背景与目的应用cDNA微阵列从食管鳞癌配对组织中得到一批在食管鳞癌中差异表达的基因,其中包括SLP-2(stomatin-likeprotein2,SLP-2),它在食管鳞癌中高表达。为验证SLP-2在食管鳞癌中的高表达,构建SLP鄄2真核表达载体,以探讨SLP鄄2与食管鳞癌发生、发展的关系。方法利用PCR从正常食管上皮cDNA中扩增SLP-2的开放阅读框,将SLP-2重组到pcDNA3.1/myc-His(-)中,构建SLP鄄2的真核表达质粒。然后将重组子导入食管鳞癌细胞系TE12中。半定量RT鄄PCR鉴定转染细胞,获得阳性细胞克隆。采用MTT比色法、平板克隆形成实验、流式细胞术和MTS比色法分析SLP鄄2对TE12细胞的影响。结果SLP鄄2在食管鳞癌中高表达。SLP鄄2基因反义转染抑制TE12细胞SLP鄄2表达时,可抑制细胞生长和增殖,导致S期阻滞,并抑制TE12细胞的粘附功能。结论食管鳞癌中SLP鄄2表达上调促进TE12细胞过度生长和增殖,并参与食管鳞癌的转移。     

真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9的构建及表达

目的：克隆人类Ubc9基因cDNA全长,构建Ubc9的真核表达载体并表达。方法：采用RT-PCR技术从人小细胞肺癌NCI-H446细胞总RNA中扩增Ubc9 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pUCM-T载体,测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体（pEGFP-N1）上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果：测序证实克隆的Ubc9全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实Ubc9正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论：成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9。     

SLP-2蛋白在食管鳞状细胞癌中的表达及其与肿瘤侵袭转移的关系

目的 探讨SLP-2蛋白在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其与食管鳞状细胞癌临床病理特征的关系.方法 收集18例新鲜配对的食管鳞状细胞癌及正常食管上皮组织,应用Western blot法检测SLP-2蛋白的表达水平.将220例配对的食管鳞状细胞癌组织和正常食管上皮组织构建组织芯片,采用免疫组化SP法检测SLP-2蛋白的表达情况,并分析SLP-2蛋白的表达与食管鳞状细胞癌临床病理特征之间的关系.结果 Western blot法检测结果显示,SLP-2蛋白在18例新鲜食管鳞状细胞癌组织中的高表达率为72.2%.免疫组化染色结果显示,SLP-2蛋白在220例食管鳞状细胞癌组织中的高表达率为54.1%,明显高于其在正常食管上皮组织中的高表达率(3.6%,P＜0.001).SLP-2蛋白的高表达与食管鳞状细胞癌的浸润深度相关(P=0.033),而与其他临床病理特征均无关(均P＞0.05).结论 SLP-2可能作为一个新的肿瘤相关基因在食管鳞状细胞癌的发生发展过程中发挥着重要作用;SLP-2蛋白的高表达与食管鳞状细胞癌的侵袭转移密切相关.     

PIAS3绿色荧光蛋白表达载体构建及其对胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响

目的：构建PIAS3绿色荧光蛋白真核表达载体,探讨外源性PIAS3对胶质瘤细胞U251周期和凋亡的影响。方法：利用RT-PCR扩增人全长PIAS3编码序列,并将其克隆到带有绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-N1中,得到重组质粒pEGFP-N1-PIAS3。应用脂质体法转染体外培养的人胶质瘤U251细胞株。荧光显微镜观察蛋白表达,用RT-PCR和Westernblot检测PIAS3的表达,Annexin V2FITC和PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,流式细胞术检测细胞增殖周期变化。结果：转染PIAS3基因的细胞株外源目的基因和蛋白表达增强,瞬时转染48 h后,光镜下可见部分细胞变圆,部分细胞脱落死亡;对照组和未转染组无明显变化。流式细胞仪分析显示,pEGFP-N1-PIAS3转染组凋亡细胞增多,细胞凋亡率显著高于未转染组和pEGFP-N1转染组,P=0.0073;U251细胞转染pEGFP-N1-PIAS3后细胞周期阻滞于S期,S期细胞比例增高,P=0.025,G2期细胞比例降低。结论：外源性PIAS3使U251阻滞在S期,诱导胶质瘤细胞凋亡。     

sFv及重组人IFN—α融合基因表达载体的构建及瞬时表达

目的：构建pEGFP-sFv-rhIFN－α表达载体，观察其在成骨肉瘤细胞9901中的瞬时表达。方法：应用PCR方法对各目的基因进行扩增交经测序载体pGEM-T-Easy测序后，以逆转录病毒载体pLXSN中的多克隆位点将二者融合为融合基因sFv-rhIFN－α，并将其亚克隆至pEGFP-N3的EcoRI和BamHI位点间，成功构建表达载体pEGFP-sFv-rhIFN－α，并在该载体转梁人成骨肉瘤细胞9901后观察融合蛋白表达情况。结果：酶切鉴定证实sFv-rhIFN－α融合基因片段已克隆到pEGFP-N3的EcoRI和BamHI位点间，并在转梁人成骨肉瘤细胞9901中观察到sFv-rhIFN－α融合基因及绿色荧光蛋白的表达。结论：pEGFP-sFv-rhIFN－α表达载体便于观察转染细胞中sFv-rhIFN－α融合蛋白的表达情况及蛋白定位，为单链抗体基因联合细胞因子基因疗法提供有利条件。     

APC蛋白功能区域重组质粒的构建及其在结肠癌细胞株HCT-116中的表达

 目的　构建并鉴定含有APC蛋白不同功能区域的真核细胞表达载体pEGFP-N3-APC1～5,转染人类结直肠癌细胞HCT-116,观察重组质粒在细胞内的表达。方法　根据APC基因的功能结构以及APC突变簇集区的特点,设计特异性引物扩增APC基因特异性的功能区域片段。将扩增出的5个APC片段克隆到pEGFP-N3载体的N端,经测序分析对重组质粒pEGFP-N3-APC1～5进行鉴定。使用脂质体转染法将重组质粒转染人类结直肠癌细胞HCT-116,通过观察细胞中绿色荧光蛋白的表达情况来检测APC功能区域在细胞内的表达。以RT-PCR法进一步验证重组质粒在细胞中的表达。结果　构建5个pEGFP-N3-APC结构区域的重组真核表达载体,重组真核表达载体转染HCT-116细胞后,细胞中均可见绿色荧光蛋白的表达。RT-PCR结果显示,5个重组质粒在HCT-116细胞中均可表达。结论　真核细胞表达载体pEGFP-N3-APC1～5的成功构建,为进一步研究其在细胞内的功能,筛选结直肠癌基因治疗的有效且易于基因操作的靶标片段提供了基础。础。     

HSV-TK2重组TNF-α融合基因表达载体的构建及在肝细胞癌细胞中的瞬时表达

目的：构建双特异性细胞因子融合基因表达载体及在肝细胞癌细胞中瞬时表达。方法：应用PCR方法对各目的基因进行扩增并经测序载体pGEM-T-Easy测序后，以逆转录病毒载体pLXSN中的多克隆位点将二者融合为融合基因TK-TNF-α，并将其亚克隆至pEGFP-N3的EcoRl和BamHl位点间，成功地构建表达载体pEGFP-TK-TNF-α仅，并在该载体转染人肝细胞癌细胞HCC9204后观察融合蛋白表达情况。结果：酶切鉴定证实TK-TNF-α融合基因片段已克隆到pEGFP-N3的EcoRl和BamHl位点问，并在转染人肝细胞癌细胞7901中观察到TK-TNF-α融合基因绿色荧光蛋白的表达。结论：pEGFP-TK-TNF-α表达载体便于观察转染细胞中融合蛋白的表达情况及蛋白定位，为双特异细胞因子基因疗法提供有利条件。     

真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9的构建及表达

目的:克隆人类Ubc9基因cDNA全长,构建Ubc9的真核表达载体并表达。方法:采用RT-PCR技术从人小细胞肺癌NCI-H446细胞总RNA中扩增Ubc9 cDNA基因片段,经过酶切鉴定后,克隆至pUCM-T载体,测序证实碱基序列无误后,再克隆至真核绿色荧光蛋白表达载体(pEGFP-N1)上,并转染到真核细胞,观察其在真核细胞中的表达。结果:测序证实克隆的Ubc9全长cDNA阅读框正确完整,酶切和序列测定证实Ubc9正确插入pEGFP-N1载体中,该重组载体能够在真核细胞中表达。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Ubc9。     

CYP2E1基因过表达细胞株的建立及鉴定

目的： 应用分子克隆技术,构建CYP2E1基因过表达载体,转染L02肝细胞,建立CYP2E1过表达细胞株并进行鉴定,为深入研究环境和职业毒物的毒作用机制提供模型细胞。方法：根据GenBank提供的CYP2E1 基因cDNA序列设计引物,PCR扩增该基因并将其克隆到慢病毒过表达载体pLVX-acGFP1-C1中,将已经构建的慢病毒载体对293FT细胞进行转染,收集病毒上清,感染正常L02肝细胞。用嘌呤霉素进行筛选得到转染CYP2E1基因的L02细胞,通过基因测序、荧光定量PCR和Western blot对细胞株进行鉴定。结果：测序证明重组慢病毒过表达载体CYP2E1基因序列与GenBank提供的CYP2E1序列一致,荧光定量PCR检测转染CYP2E1基因的L02细胞比正常肝细胞CYP2E1 mRNA表达提高273倍,Western blot实验显示转染CYP2E1基因的L02细胞CYP2E1蛋白表达水平比正常肝细胞提高3.2倍。结论：成功构建了CYP2E1基因过表达细胞株,可应用于环境毒物和职业毒物的分子机制 研究。     

ECM1-pEGFP—N2真核表达载体的构建及其在人乳腺癌细胞系MCF-7中的表达

目的构建细胞外基质蛋白1基因（ECM1）的真核表达载体ECM1-pEGFP-N2，检测其在人乳腺癌细胞系MCF-7中表达。方法采用PCR方法，以ECMleDNA为模板，扩增出ECM1基因，用Bg1 Ⅱ和KpnⅠ双酶切ECM1基因和pEGFP-N2载体，连接酶切目的片段，转化大肠杆菌DH5，筛选阳性克隆酶切、测序鉴定；利用脂质体介导的转染技术转染MCF-7细胞，荧光显微镜检测报告基因表达产物EGFP，免疫组化检测ECM1蛋白表达。结果利用PCR克隆出约1．6kb的ECM1基因；PCR鉴定、酶切鉴定及测序结果证实成功构建ECM1-pEGFP-N2真核表达载体；转染MCF-7细胞后，可在细胞内观察到报告基因产生的绿色荧光，用免疫组化方法可检测到ECM1蛋白。结论成功构建了ECM1-pEGFP-N2真核表达载体，并在MCF-7细胞中表达，为进一步研究ECM1的功能奠定了基础。     

EZH2基因对人食管癌细胞增殖的影响

目的:探讨过表达或沉默果蝇Zeste基因增强子人类同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)基因对食管癌细胞增殖的影响.方法:选用人食管癌细胞株ECA 109、TE1、KYSE30、KYSE 170作为研究对象,采用实时荧光定量PCR(qPCR)、Western blotting法分别检测食管癌细胞EZH2mRNA和蛋白的表达水平,然后采用qPCR检测过表达和沉默EZH2基因后对4株食管癌细胞EZH2mRNA的表达变化;CCK-8增殖实验、克隆形成实验检测过表达和沉默EZH2基因及EZH2抑制剂DZNep(3-deazaneplanocin A)处理对食管癌细胞增殖能力和克隆形成率的影响.结果:食管癌ECA 109、TE1细胞中EZH2 mRNA和蛋白水平明显高于KYSE30、KYSE 170细胞(P＜0.05).食管癌TE1、ECA 109细胞转染EZH2-ShRNA后EZH2表达水平下调(均P＜ 0.05)、细胞增殖能力降低(1.07±±0.08 vs 1.59±±0.09,P＜0.05;0.88±0.08 vs 1.05±0.11,P＜0.05)、克隆形成数下调[(200.00±11.43) vs (480.00±±13.10)个,P＜0.05;(88.00±±8.16) vs (220.00±±±14.69)个,P＜0.05].KYSE30、KYSE 170细胞转染EZH2过表达质粒后EZH2表达水平升高(均P＜0.05)、细胞增殖能力显著增强(1.06±0.07 vs 0.76±0.06,P＜0.05;3.36±±0.30 vs 1.50±0.08,P＜0.05)、克隆形成数显著升高[(45.00±3.27) vs (18.00±±1.63)个,P＜0.05;(65.00±4.08) vs (23.00±±2.45)个,P＜0.05];DZNep处理后,ECA109和TE1细胞增殖能力降低(均P＜0.05)、克隆形成数下降(均P＜0.05).结论:EZH2基因能有效促进食管癌细胞的增殖和克隆形成能力,为深入研究EZH2作为食管癌治疗的新靶点提供了实验研究基础.     

PTPN6 基因对人食管鳞状细胞癌Eca109 和Yes-2 细胞恶性生物学行为的影响

[摘要] 目的：探讨非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶6（non-receptor protein tyrosine phosphatase 6,PTPN6）基因在不同食管鳞状细胞癌细胞株中的表达及其对Eca109、Yes-2 细胞恶性生物学行为的影响。方法：应用qPCR 法检测不同食管鳞癌细胞株（TE1、Eca109、Kyse150、Kyse170、Yes-2）中PTPN6 mRNA的表达水平,以pcDNA3.1-PTPN6 质粒分别瞬时转染食管鳞癌细胞株Eca109和Yes-2,应用qPCR和Wb法检测PTPN6 mRNA和蛋白的表达水平,并应用MTS、克隆形成实验、划痕实验和Transwell 法检测过表达PTPN6 基因对食管鳞癌细胞恶性生物学行为的影响。结果：PTPN6 基因在5 种食管鳞癌细胞侏中表达均明显下调（均P<0.05）。与转染空载体的对照组相比,经pcDNA3.1-PTPN6 转染后,Eca109 和Yes-2 细胞均高水平表达PTPN6（P<0.05 或P<0.01）;过表达PTPN6 基因后,Eca109 和Yes-2 细胞的增殖、迁移和侵袭能力均明显被抑制（均P<0.05）。结论：PTPN6 基因高表达能抑制食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭,其可能是影响食管鳞癌细胞生物学特性的一个重要因素。     

Stomatin-like protein 2 is overexpressed and related to cell growth in human endometrial adenocarcinoma

Stomatin-like protein 2 (SLP-2) is a novel and unusual stomatin homologue of unknown functions. It was first identified to be overexpressed and involved in regulating cell growth and cell adhesion in human esophageal squamous cell carcinoma. We show herein the involvement of SLP-2 in human endometrial adenocarcinoma, and the effects of SLP-2 on endometrial adenocarcinoma cell growth. The expression of SLP-2 was evaluated in human endometrial adenocarcinoma by semi-quantitative RT-PCR, Westernblotting and immunohistochemistry. Sense and antisense SLP-2 eukaryotic expression plasmids were transfected into the human endometrial adenocarcinoma cell line HEC-1B. MTT assay and flow cytometry assay were performed to investigate the roles of the SLP-2 gene. SLP-2 was overexpressed in endometrial adenocarcinoma compared with their normal counterparts (P相似文献   

小窝蛋白-1和E-钙黏蛋白在食管癌TE1细胞系中的表达及其意义

目的:检测小窝蛋白-1(Cav-1)和E-钙黏蛋白(E-cad)在食管癌TE1细胞系中的表达水平,探讨Cav-1在食管癌转移中可能的作用及机制。方法:化学合成针对Cav-1基因3个不同靶点的siRNA(Cav-1 siRNA1,Cav-1 siRNA2和对照siRNA),分别转染食管癌TE1细胞系,以未转染细胞为空白对照,转染对照siRNA细胞为阴性对照。采用Western blot法检测RNA干扰后TE1细胞中Cav-1和E-cad的表达情况;Transwell方法检测各组细胞的迁移和侵袭能力。结果:Western blot检测结果提示,与空白对照组比较,Cav-1 siRNA使食管癌TE1细胞系中Cav-1表达水平降低(P<0.01),E-cad表达水平升高(P<0.01);Transwell迁移及侵袭试验结果提示转染Cav-1 siRNA后细胞的迁移、侵袭能力较空白对照组显著减弱(P<0.05)。结论:Cav-1可能通过调节E-cad的表达影响食管癌的转移。     

lncRNA DGCR5通过上调EGFR表达促进食管鳞状细胞癌TE1细胞的恶性生物学行为

目的：探讨长链非编码 RNA（long non-coding RNA,lncRNA）DiGeorge 综合征临界区基因 5（digeorge syndrome critical region gene 5,DGCR5）对食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）TE1细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其机制。方法：采用qPCR检测ESCC细胞系 TE1、Yes-2、KYSE150 和 Eca9706 中 DGCR5 的表达水平。将siRNA-DGCR5（si-DGCR5）和阴性对照组（si-NC）质粒转染进TE1细胞,用CCK-8、划痕愈合、Transwell小室法分别检测TE1细胞增殖、迁移和侵袭能力。依据GEPIA数据库资料分析食管癌组织中 DGCR5 表达与细胞表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）的相关性,并用qPCR和Western blotting（WB）检测ESCC细胞系中EGFR mRNA和蛋白表达水平,进一步用WB实验检测转染 si-DGCR5 前后 TE1细胞中EGFR蛋白的表达水平。结果：DGCR5 在 ESCC 细胞系中均高表达（均 P<0.01）,转染siDGCR5组TE1细胞中DGCR5的表达水平明显低于si-NC组（P<0.01）。敲低DGCR5后,TE1细胞的增殖、侵袭和迁移能力显著低于si-NC组细胞（均 P<0.01）。GEPIA 数据库的分析显示,食管癌组织中 DGCR5 表达水平与 EGFR 的表达呈正相关（P<0.01）。敲低DGCR5后TE1细胞中EGFR蛋白表达水平明显下降（P<0.01）。结论：lncRNA DGCR5在ESCC细胞中呈高表达,可能通过上调EGFR表达来促进TE1细胞的增殖、侵袭和迁移等恶性生物学行为。     

r-H2AX在不同食管癌株系中的剂量时间效应特点

目的   通过检测不同食管癌株系的r-H2AX时间剂量效应关系,了解r-H2AX的动力学特点。 方法   将食管癌ECA109和TE13两种细胞株分别给予1、2、4和8Gy 的6MV-X线照射,并分别于0.5、1、2、4、8、12、24 h收集细胞提取蛋白,检测r-H2AX时间及剂量效应特点。 结果   (1) ECA109细胞和TE13细胞随着放疗剂量的增加,r-H2AX表达量第一次最高点出现的时间逐渐提前。(2) ECA109细胞接受低剂量照射后,r-H2AX在24 h内能够恢复到放疗前的水平,且剂量越低恢复越快;TE13细胞接受1、2、4和8Gy照射后24 h内r-H2AX均不能恢复到放疗前水平。(3)在0.5、1、2 h这3个时间点,随着放疗剂量的增加,r-H2AX的表达量并不都是逐渐增加。 结论   TE13细胞较ECA109细胞敏感,照射后r-H2AX更难恢复到正常水平。