用原核增强子提高hTERT启动子介导的基因表达

目的:探讨原核增强子能否提高hTERT启动子的转录活性及对其肿瘤特异性的影响。方法:将增强子SV40、CMV分别或组合构建一系列GFP和荧光素酶报告基因载体,转染人肝癌、鼻咽癌、宫颈癌、结直肠癌细胞、成纤维肉瘤和正常成纤维细胞,流式细胞仪计数和双荧光酶分析系统检测基因的表达效率。结果:在正常成纤维细胞中这些载体均不能有效表达;而在肿瘤细胞中hTERT启动子能介导基因表达但效率不高,增强子能使基因表达增强3~26倍,特别是单独CMV增强子和SV40-CMV双增强子使荧光素酶表达提高20~26倍,是常用的CMV增强子/启动子的2~7倍;完整CMV增强子/启动子对hTERT启动子的活性影响因不同细胞而异。结论:增强子能显著增强hTERT启动子的转录活性并对其肿瘤特异性没有影响,CMV增强子或SV40-CMV双增强子/hTERT启动子是高效特异的通用调控元件,用于靶向性肿瘤基因治疗具有巨大潜力。     

hTERT启动子的克隆及hTERT启动子/SV40增强子在食管癌细胞中的转录活性

目的 克隆hTERT启动子核心序列,研究hTERT启动子/SV40增强子在食管癌细胞中的联合转录活性。 方法 以人基因组DNA为模板,PCR扩增hTERT启动子核心片段;将其分别插入荧光素酶基因报告质粒pGL3-Basic和pGL3-Enhancer中,构建hTERT启动子调控的表达载体pGL3-hTERTp和由hTERT启动子/SV40增强子联合调控的表达载体pGL3-hTERTp-SV40en,将上述重组质粒分别瞬时转染食管癌细胞Eca-109、EC1和人胚肺成纤维细胞MRC-5,用荧光素酶检测试剂盒检测转染细胞中荧光素酶基因的表达水平并以此计算hTERT启动子和hTERT启动子/SV40增强子在各种细胞中的转录活性。结果 克隆出长213 bp的hTETR启动子核心片段,DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子的碱基序列完全一致;成功构建真核表达载体pGL3-hTERTp和pGL3-hTERTp-SV40en;hTETR启动子在食管癌细胞Eca-109和EC1中均有转录活性,在MRC-5细胞中无明显转录活性;hTERT启动子/SV40增强子在食管癌细胞Eca-109和EC1中的转录活性显著高于hTETR启动子的单独转录活性。结论 hTERT启动子在食管癌细胞中具有靶向性转录活性,SV40增强子能显著增强hTERT启动子在食管癌细胞中的转录活性,有可能作为肿瘤靶向性基因治疗的转录调控元件。     

hTERT启动子的克隆及在MCF7乳腺癌细胞中的特异转录活性

背景与目的：利用肿瘤特异性启动子增强肿瘤细胞中治疗基因的转录选择性是达到基因治疗靶向性的有效途径。人端粒酶催化亚基（hTERT）在大部分肿瘤细胞中呈特异性高表达，有可能成为肿瘤特异性启动子。本文扩增了hTERT基因启动子并分别克隆于报告基因重组质粒pEGFP-1和pGL3-Basic，检测并证实hTERT启动子在乳腺癌细胞MCF7中的特异转录活性。方法：采用套式PCR法扩增hTERT启动子，将其分别克隆到含报告基因增强绿色荧光蛋白（EGFP）的重组质粒pEGFP-1和含Luciferase的重组质粒pGL3-Basic，经脂质体分别转染人乳腺正常上皮细胞系HBL100和乳腺癌细胞MCF7，荧光显微镜观察EGFP的表达情况，并测定两种细胞中荧光素酶转录表达差异。结果：与正常细胞HBL100相比，hTERT启动子在MCF7细胞呈现强的绿色荧光表达；荧光素酶活性检测与其一致，hTERT启动子在MCF7乳腺癌细胞的荧光素酶相对活性RLU／U值（33784）约相当于HBL100细胞中（2400）的15倍。结论：hTERT启动子在乳腺癌MCF7细胞中具有很强的特异性，为进一步开发肿瘤的特异性基因治疗奠定实验基础。     

人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子的克隆及其在人肺癌细胞中转录活性的研究

目的克隆人端粒酶催化亚单位(hTERT)的启动子，并检测它在多种人肺癌细胞株和人胚肺成纤维细胞株中的转录活性，为肺癌靶向性基因治疗的研究奠定基础。方法以人胚肾293细胞基因组DNA为模板，应用PCR方法克隆hTERT 5’端上游旁侧序列长约1．1kh的启动子片段，经DNA测序无误后克隆人荧光素酶报告质粒pGL3-Basic的荧光素酶基因上游，构建pGL3-hTER Tp重组质粒，用脂质体法瞬时转染人肺癌细胞株A549、SPC-A-1、LTEPa-2、NCI—H446、YTMLC、GLC-82、A2，以及人胚肺成纤维细胞株MRC5，转染48h后检测hTERT启动子在各细胞株中的转录活性。结果琼脂糖凝胶电泳显示PCR克隆的hTERT启动子片段长约1.1kb。DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致，其5’端和3’端分别位于hTERT基因转录起始位点上游1126bp和43bp，片段长度为1084bp。采用双酶切和PCR两种方法鉴定pGL3-hTERTp重组质粒，均显示构建成功。瞬时转染及荧光素酶活性检测实验显示，hTERT启动子在所检测的肺癌细胞株中均有高低不同的转录活性，而在MRC-5细胞株中无转录活性。结论该实验克隆的1084bp大小的hTERT启动子在多种肺癌细胞株中均有转录活性，在人胚肺成纤维细胞中无转录活性。hTERT启动子有可能作为调控元件用于肿瘤靶向性基因治疗。     

小鼠TERT启动子的克隆及在肿瘤细胞中的转录活性研究

目的：克隆不同长度的小鼠端粒酶逆转录酶（mouse telomerase reverse transeriptase,mTERT）启动子,研究其在小鼠肝癌细胞Hepal-6、结肠癌细胞CT26、恶性黑色素瘤细胞B16和小鼠成纤维细胞NIH3T3中的转录活性。方法：以Hepal-6细胞的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增不同长度的mTERT启动子片段,分别命名为mTERT1至7;然后分别克隆入荧光素酶报告基因质粒pGL3～Basic构建真核表达载体;采用脂质体Lipofectamine2000将重组质粒分别和pRL—CMV共转染Hepal-6、CT26、B16和NIH3T3细胞,采用双荧光素酶法检测不同长度的mTERT启动子片断在细胞中的转录活性。结果：双酶切和测序鉴定均显示不同长度的mTERT启动子克隆成功及其表达载体构建成功;荧光素酶活性检测显示mTERT1至5在3种肿瘤细胞中有较高的转录活性,而在NIH313细胞中的活性较低,mTERT6和mTERT7在所有细胞中均很低;同一片断在不同肿瘤细胞株中活性不同。结论：mTERT核心启动子区位于ATG上游333bp内,且具有肿瘤特异性。     

hTERT启动子调控的SEA-CD80基因共表达重组腺病毒载体的构建及在不同肿瘤细胞中的表达鉴定

目的：构建肿瘤靶向性葡萄球菌肠毒素 A 和 CD80基因共表达重组腺病毒载体。方法：采用 PCR 技术从质粒 pShuttle - AFP - CD80扩增人 CD80全长 cDNA 片段,克隆至已构建载体 pMD18- T - BIS,取代小鼠CD80 cDNA 片段。重组质粒命名为 pMD18- T - hBIS。经酶切,将 CWV 增强子修饰的人端粒酶反转录酶启动子从已构建载体 pGL3- CWVE - hTP,亚克隆至穿梭质粒 pShuttle2,然后经酶切将片段 hCD80- IRES - SEA从 pMD18- T - hBIS 质粒亚克隆至 CWV 增强子修饰的人端粒酶反转录酶启动子下游,构建质粒 pShuttle2-CE - hTP - hBIS。再与腺病毒骨架质粒 pAdEasy -1共转化 E. coli BJ5183,以获得的重组子（命名为 Ad - CE- hTP - BIS）转染 Ad293细胞制备病毒并纯化。将病毒分别感染人肝癌细胞 H7721、宫颈癌细胞株 Hela 细胞和原代培养的人牙龈成纤维细胞,经免疫荧光染色后,激光共聚焦显微镜观察 SEA 和 CD80在细胞膜的表达情况。结果：重组腺病毒能够使 CD80和 SEA 在人肝癌细胞 H7721、宫颈癌细胞株 Hela 细胞膜上共表达,而在人牙龈成纤维细胞中不表达。结论：成功地构建了多肿瘤靶向性 SEA 和 CD80基因共表达重组腺病毒载体。为应用 SEA 和 CD80基因对人多种肿瘤进行靶向基因治疗奠定了基础。     

人脂肪酸合成酶FAS启动子的克隆及其在几种肿瘤细胞中的转录活性分析

目的:克隆人脂肪酸合成酶基因FAS启动子的序列,构建重组荧光素酶表达载体pGL3-FAS,并分析其在几种肿瘤细胞中的转录活性,为其作为肿瘤靶向基因治疗的工具提供依据。方法:以人基因组DNA为模板,PCR扩增FAS启动子区680bp活性序列,经测序鉴定正确后,克隆至荧光素酶表达载体pGL3-enhancer中,构建成重组荧光素酶表达载体pGL3-FAS。将pGL3-FAS通过脂质体转染胃癌细胞系SGC-7901、人宫颈癌细胞系Hela、人乳腺癌细胞系SKBR3、人肝癌细胞系HepG2以及NIH3T3成纤维细胞系中,应用荧光素酶检测系统测定荧光素酶活性,通过内参校正得到相对转录活性。结果:成功扩增出大小约为680bp的FAS启动子序列,经测序鉴定与Genebank报道的一致。经酶切鉴定,成功构建重组荧光素酶表达载体pGL3-FAS。瞬时转染pGL3-FAS,发现其在SGC-7901、Hela、SKBR3、HepG2细胞中均具有较强的荧光素酶活性,且荧光素酶活性高于强启动子SV40驱动的pGL3-control载体;而在正常成纤维细胞中,转录活性较低。结论:FAS启动子在肿瘤细胞中具有强转录活性,而在正常细胞中转录活性很低,具有良好的肿瘤靶向性,为肿瘤靶向基因治疗提供理论依据。     

hTERT启动子调控的融合自杀基因CD:UPRT载体的构建及其应用

目的 构建hTERT启动子调控的融合自杀基因CD:UPRT表达载体,研究其对人胃癌细胞SGC7901的体外靶向性杀伤作用。方法 PCR扩增hTERT核心启动子片段,克隆入荧光素酶报告基因质粒pGL3 Basic,检测hTERT启动子在人胃癌细胞SGC7901和人成纤维细胞HLF中的转录活性。构建hTERT启动子调控的CD:UPRT基因表达载体hTERT CD:UPRT,将其和CMV启动子调控的CD:UPRT基因表达载体pcDNA3.1 CD:UPRT用脂质体转染法分别转染入SGC7901和HLF细胞,筛选稳定表达细胞系,用RT PCR和Western blot方法检测CD基因的表达,用MTT法检测5 FC对转染细胞的杀伤作用。结果 成功克隆hTERT核心启动子;荧光素酶活性检测显示,hTERT启动子在SGC7901细胞中的转录活性为阳性对照的(21.50±2.15)%,而在HLF细胞中仅有背景活性。成功构建hTERT启动子调控的CD:UPRT基因表达载体,转染pcDNA3.1 CD:UPRT的SGC7901和HLF细胞以及转染hTERT CD:UPRT的SGC7901细胞在mRNA和蛋白质水平均可检测到CD基因的表达,且对5 FC敏感;而转染hTERT CD:UPRT的HLF细胞未检测到CD基因的表达,对5 FC不敏感。结论 构建的hTERT启动子调控的融合自杀基因系统CD:UPRT/5 FC能在体外靶向性杀伤SGC7901细胞。     

乳腺癌细胞特异性MGA启动子的扩增及功能分析

目的 探讨人乳腺球蛋白（mammaglobin A, MGA）基因启动子的乳腺肿瘤细胞特异性和调控元件,并验证MGA启动子载体系统在活体肿瘤组织中的表达活性。方法 PCR扩增5.6 kb大小的人MGA启动子片段,并在此基础上构建四个含有萤火虫荧光素酶报告基因的重组载体;瞬时转染到乳腺癌细胞系T47D和人胚肾细胞系HEK293T后,利用双荧光素酶报告基因体系,检测各个MGA启动子活性;稳定转染MGA重组载体到乳腺癌细胞系T47D（T47DEM）,进行裸鼠皮下造瘤,活体成像检测报告基因活性。结果 （1）双增强子的启动子活性低于单增强子启动子（降低82%）;（2）定点删除YY1结合元件后,启动子活性下降76.2%,乳腺肿瘤细胞特异性下降38.4%;（3）定点删除Nkx2.5后,启动子活性没有明显变化,但特异性降低31.9%;（4）细胞株T47DEM在体形成肿瘤后,表现出明显的报告基因活性。结论 研究了两个增强子叠加和两个转录因子结合位点（YY1和Nkx2.5）对MGA启动子活性和特异性的影响;构建的细胞株（T47DEM）可以用于治疗乳腺癌药物的在体筛选。     

Melanoma-specific expression in first-generation adenoviral vectors in vitro and in vivo -- use of the human tyrosinase promoter with human enhancers

Current treatment regimens for patients with metastatic melanoma are not curative, and new treatment strategies are needed. One possible approach is targeted treatment using the tyrosinase promoter for melanoma-specific expression of genes delivered by adenoviral (Ad) vectors. In this study, a vector with the human minimal tyrosinase promoter and two human enhancer elements (2hE-hTyrP) was compared with different hybrid promoter constructs, containing tyrosinase regulatory sequences and the viral simian virus 40 (SV40) promoter. The tissue specificity of the first-generation vectors was measured by enhanced green fluorescence protein (EGFP) reporter flow cytometry in 12 human melanoma and nonmelanoma cell lines. In the melanotic melanoma cells, the activity of the 2hE-hTyrP promoter was comparable with the activity of the cytomegalovirus promoter, and the background expression levels obtained in the nonmelanoma cell lines confirmed the strict tissue-specific property of this promoter. The hybrid SV40-based promoters were effective, but no tissue specificity was observed even after the inclusion of tyrosinase enhancer elements identical to the elements used in the 2hE-hTyrP promoter. The in vivo tissue specificity of the 2hE-hTyrP vector was demonstrated in subcutaneous xenografted tumors by ex vivo detection of EGFP fluorescence with the IVIS Imaging equipment and fluorescence microscopy visualizing the in situ EGFP expression in tumor sections. The tyrosinase mRNA level in the 12 cell lines was measured by quantitative real-time RT-PCR, and the expression levels reliably reflected to what extent the 2hE-hTyrP promoter could drive the gene expression in the individual cell lines. In conclusion, the human tyrosinase promoter fused to two human tyrosinase enhancers (2hE-hTyrP) can be used for efficient tissue-specific expression from first-generation Ad vectors in melanoma cell lines both in vitro and in vivo, as predicted by the quantitative tyrosinase mRNA levels in the melanoma and nonmelanoma cell lines tested.