5个VNTR位点用于我国三省65株结核分支杆菌菌株基因分型的研究

目的初步探讨我国结核分支杆菌的数目可变串联重复位点 (VariableNumberofTandemRepeat ,VNTR)的分布特征及其在基因分型中的应用。方法　选取结核分支杆菌基因组中的 5个VNTR位点 ,采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术 ,并应用BioNumerics(Version3.0 )软件进行处理 ,分析结核分支杆菌DNA中VNTR分布多态性。结果　检测分析的 6 5株结核分支杆菌具有明显的多态性 ,共分成 12个不同的型别 ,其中大部分菌株属于一个型 ,占 6 4 .6 % ,其他菌株呈散在分布。结论　我国结核分支杆菌的VNTR具有明显的多态性。VNTR分型技术具有简便、快速、特异、重复性好等优点 ,可广泛用于结核病的分子流行病学研究。     

对硝基苯甲酸(PNB)替代BACTEC460NAP进行分支杆菌分群的初步研究

用PNB替代BACTEC系统中NAP药物,将PNB加入7H_(12)B培基内,鉴定结核菌与非结核分支杆菌两大菌群。实验10株标准菌株和115株临床菌株;结果:人、牛型标准菌株在PNB12B10μg/ml生长抑制。8株非结核标准菌株抑菌浓度PNB>500μg/ml。以PNB100μg/ml12B为界限,115株临床菌株PNB与NAP方法平行对照实验,鉴定结果:结核菌群符合率97.8％,非结核菌群符合率95.8％,总符合率97.4％(P>O.05)。其中18株用PNB法间隔一个月重复实验,两次结果一致。结果显示,PNB12B菌群鉴定方法可以做为一种准确、经济的菌型初筛实用方法。     

福建省畲族人群结核分支杆菌IS6110DNA指纹图谱特征分析

目的分析福建省畲族人群和汉族人群结核病患者分支杆菌DNA指纹特征,探讨畲族人群结核病的分子流行病学特征。方法采用基于IS6110的PCR分型方法,对我省10个畲族乡镇调查点分离的50例畲族人群结核菌株和50例汉族人群结核菌株进行检测,用Gel-Pro analyzer4.0软件和NTSYSpc2.10e软件对DNA指纹图谱进行聚类分析。结果100株结核分支杆菌共分为4个主要类型,其中Ⅰ型(北京基因型)59株占59%,Ⅱ型38株占38%,Ⅲ型2株占2%,IV型为1株占1%。汉族病例菌株指纹为Ⅰ、Ⅱ型,以I型为主,占80%,畲族为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型,以II型为主,占56%;经χ2分析,两族病例菌株指纹的型别分布差异有显著统计学意义(P<0.01)。Ⅱ型菌株耐药率(47.4%,18/38)与Ⅰ型菌株耐药率(20.3%,12/59)差异也有显著统计学意义(P<0.05)。结论畲、汉两族主要基因型不同,汉族人群以北京基因型(Ⅰ型)流行为主,而畲族人群则以非北京基因型(Ⅱ型)为主,该型菌耐药率明显高于Ⅰ型,提示与畲族人群结核病高疫情相关,有待于进一步研究。     

分支杆菌鉴定方法的比较研究

比较了微菌落法、多重聚合酶链反应 (ＰＣＲ)法和传统法用于分支杆菌临床分离物菌种鉴定的效果 ,现报告如下。材料与方法 :试验菌株 :(1)标准菌株 :结核分支杆菌Ｈ37ＲＶ、牛分支杆菌、鸟分支杆菌、胞内分支杆菌、堪萨斯分支杆菌、瘰疬分支杆菌、偶然分支杆菌和耻垢分支杆菌标准株 ,均购自北京结核病胸部肿瘤研究所。 (2 )临床分离株 :来自我院结核病住院患者的痰、胸液和脑脊液。传统分型鉴定试验 :(1)培养鉴定试验 :按常规制备对硝基苯甲酸 (ＰＮＢ)和噻吩 2 羧酸肼 (ＴＣＨ)培养基 ,取试验菌株菌悬液 (10 -2 /ｍｌ) 0 1ｍｌ接种 ,37℃…     

江苏省67株结核分支杆菌MLVA分型分析

目的初步探讨江苏省结核分支杆菌的数目可变串联重复序列(VNTR)的分布特征。方法采用多位点串联重复序列(MLVA)分型方法,对从江苏省病人分离的结核分支杆菌的VNTR进行PCR扩增,2%琼脂糖凝胶电泳,通过BioNumerics3.0软件分析其VNTR的多态性和聚类分析。结果共选取了15个VNTR位点,对67株结核分支杆菌进行了检测分析,结果显示明显的基因多态性,可分8个基因型(Ⅰ～Ⅶ型),其中较多的一型菌株占32.6%,其他型别菌株数量较接近,没有特别明显的优势型别。结论江苏省结核分支杆菌具有明显的多态性,MLVA分型技术具有稳定、简单、可重复的优点,可用于结核分支杆菌的流行病学调查。     

IS6110-PCR分型方法用于安徽、湖南、江苏三省结核病分子流行病学的初步研究

目的了解安徽、湖南、江苏省结核分支杆菌的基因型状况及其分子流行病学规律。方法以结核分枝杆菌插入序列IS6110序列为模板,设计一对特异外向引物,建立一种结核分枝杆菌的快速分子生物学分型方法——IS6110PCR分型方法,进行三省结核病分子流行病学研究。结果根据IS6110PCR指纹图谱,191株安徽、湖南和江苏三省的结核分枝杆菌菌株可被分成6个主要的基因型(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ和Ⅵ),江苏省的主要基因型为I和V型,安徽省的主要基因型为III型,湖南省的主要基因型为I和II型,V型菌株全部为江苏省菌株,IV型菌株全部为湖南省菌株。结论三省之间结核分支杆菌的基因型存在明显的差异,各自存在着独立的流行菌型,其真实原因有待进一步研究。     

2株胞内分枝杆菌临床分离株的鉴定

目的联合应用多种分子生物学技术进行分枝杆菌菌种鉴定。方法从经PNB、TCH鉴别培养基鉴定为结核分枝杆菌的临床分离菌株285株中选取6株,其中包括oxyR-ahpC基因间隔区检测时PCR产物分子量异常的2株和另外随机选择的PCR产物分子量正常者4株,采用H37Rv、鸟分枝杆菌95001和胞内分支杆菌95002做对照,PCR扩增oxyR-ahpC基因间隔区,对其产物进行测序和网上同源性(H37Rv、U18263、U71061)比对。同时,采用多位点PCR扩增和hsp65 PCR-限制性酶切片段长度多态性分析,从而判定分枝杆菌菌种类型。结果经PNB、TCH鉴别培养基鉴定初步判定为结核分枝杆菌的285株临床分离株中2株临床菌株oxyR-ahpC基因间隔区PCR产物大小约为1 000bp,DNA序列与胞内分枝杆菌同源性极高,达99%,而与同片段序列结核分枝杆菌H37Rv的差异大,同源性为84%。多位点PCR指纹显示为非分枝结核杆菌,hsp65 PCR-RLFP/RFLP指纹与95002一致。结论2株oxyR-ahpC基因间隔区PCR产物分子量异常的经PNB、TCH鉴别培养基鉴定为结核分枝杆菌的临床分离株确定为胞内分枝杆菌。多种分子生物学技术联合应用能够快速、简便、更准确地鉴定分枝杆菌菌种。     

应用多重聚合酶链反应技术快速鉴定牛分支杆菌卡介苗株

目的 建立快速鉴定牛分支杆菌卡介苗(BCG)菌株的方法。方法 依据最近研究发现的牛分支杆菌BCG菌株不存在命名为缺失区1(deleted region 1，RD1)的基因区，而其他牛分支杆菌菌株和其他结核分支杆菌复合群(MTC)菌种(结核分支杆菌、非洲分支杆菌和田鼠分支杆菌)存在RD1基因区的遗传学信息，应用多重聚合酶链反应(PCR)检测RD1基因区存在与否，以鉴别BCG菌株与其他牛分支杆菌菌株及其他MTC菌种。结果 所试5株BCG疫苗生产用标准菌株和近期国内发生的1例小儿BCG接种后全身播散性感染致死病例的2株BCG分离菌株，均缺失RD1基因区；其他牛分支杆菌菌株，包括3株牛分支杆菌标准菌株、5株分别从结核病牛或鹿分离的牛分支杆菌菌株，1株从结核病患痰标本分离的牛分支杆菌菌株，以及其他MTC菌种，包括结核分支杆菌H37Rv和H37Ra标准菌株、48株从结核病患痰标本分离的结核分支杆菌菌株、3株非洲分支杆菌标准菌株，均存在RD1区。结论子多重PCR技术用于牛分支杆菌BCG菌株的鉴定简便、快速、特异，适于在临床实验室应用。     

2017—2019年福建省结核分枝杆菌分离株基因型特征及其耐药性分析

目的:了解福建省结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)基因型的分布特征和流行情况，同时分析MTB基因型与其耐药的关系。方法:选取2017—2019年福建省结核病耐药监测点的477株MTB临床分离株作为研究对象。采用对硝基苯甲酸(PNB)/噻吩-2-羧酸肼(TCH)生长实验法进行菌种初步鉴定，并采用传统固体比例法对9种抗结核药物[异烟肼(isoniazid, INH)、利福平(rifampin, RFP)、链霉素(streptomycin, Sm)、乙胺丁醇(ethambutol, EMB)、卡那霉素(kanamycin, Km)、氧氟沙星(ofloxacin, Ofx)、卷曲霉素(capreomycin, Cm)、丙硫异烟胺(prothionamide, Pto)、对氨基水杨酸(para-aminosalicylic acid, PAS)]进行药物敏感性试验(简称“药敏试验”)。应用熔解曲线法间隔区寡核苷酸分型(McSpoligotyping)技术对菌株进行基因分型。结果:477株MTB菌株中北京基因型有245株，占51.4%;T家族有44株(含2...     

坦桑尼亚人颈淋巴结炎中分离出牛型分支杆菌:相关原因是什么?

背景:坦桑尼亚北部和南部适于畜牧的社区。 设计:观察性研究。 目的:确定这些地区乡村结核病诊所结核病病例中牛型分支杆菌感染的情况。 方法:以经临床证实的149例结核病病例作为样本。根据病变部位取适当的标本在含甘油或丙酮酸的两种罗氏培养基上进行培养。共培养分离出4株分支杆菌并进行生化分型。 结果:从所有各类型结核病病人中分离的分支杆菌菌株中,有31株(70.5％)被证明为结核分支杆菌,7株(15.9％)为牛型分支杆菌,6株(13.6％)为其他分支杆菌。肺外结核中牛型分支杆菌的分离率(28.6％)显著高于肺结核(4.3％)(P<0.05)。 结论:根据这些发现,应将牛型分支杆菌视为坦桑尼亚乡村居民可能的致病原。需进一步在该社区中牲畜和牲畜饲养人之间建立一个动物传染人的传染链。     

游泳池肉芽肿皮损中分离出海分支杆菌的报告

目的　报告一例从游泳池肉芽肿患者皮肤组织标本中分离出一株海分支杆菌。方法 标本的分离培养采用碱处理后接种酸L—J培基,置28℃和37℃两种条件下培养;药物敏感性测定采用绝对浓度法;菌种鉴定采用形态学观察、鉴别培基(PNB、TCH、5%NaCl、葡萄糖琼脂、麦康盖琼脂)的鉴别及细胞生物化学反应的方法进行鉴定。结果 该菌株在28℃中的生长明显优于37℃培养;并对INH、SM耐药,对RFP、EM敏感;经光照后可产生明显的黄色色素,耐热触酶(+),硝酸还原(-)。结论 根据鉴定结果,确定其为海分支杆菌。     

河南省363株非结核分枝杆菌分离鉴定及耐药分析

目的 了解河南省结核病患者中非结核分枝杆菌(NTM)分布情况及其耐药性,为其临床诊治提供支持。方法采用传统PNB/TCH生长试验对分枝杆菌培养阳性标本初步鉴定。用探针熔解曲线法和PCR产物测序鉴定NTM菌种,采用比例法检测分离菌株的抗结核药物敏感性。结果 从PNB/TCH生长试验结果阳性的404株菌株中,鉴定出NTM菌株363株,其中357株为单一感染,6株为混合感染。363株菌株中,胞内分枝杆菌273株(74.93%),堪萨斯分枝杆菌34株(9.37%),脓肿分枝杆菌21株(5.79%),鸟分枝杆菌11株(3.03%),其他25株(6.89%)。其中南阳、洛阳、平顶山、濮阳、开封、许昌、郑州、周口和驻马店等地市胞内分枝杆菌比例都高于50%;安阳、鹤壁和商丘等地市堪萨斯分枝杆菌比例较高。河南省NTM总分离率为3.93%。18个地市中鹤壁市NTM分离率最高为11.20%,其次为南阳10.23%;分离率最低的为周口1.11%,其次为商丘1.21%,差异有统计学意义(χ²=135.604,P<0.001)。结论 河南省NTM分离以胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、脓肿...     

大理地区13株疑似非结核分枝杆菌临床分离株的鉴定

目的对云南大理地区13株疑似非结核分枝杆菌(Non-Tuberculous mycobacteria,NTM)进行鉴定,了解其菌种构成。方法大理州疾控中心提供的疑似非结核分枝杆菌13株,经罗氏培养基(L-J)、噻吩-2-羧酸肼(TCH)和对硝基苯甲酸(PNB)鉴别培养基初步鉴别培养确定为NTM后分别通过16S rRNA、hsp65和rpoB基因片段测序进行菌种鉴定。结果 13株疑似NTM临床分离株经16S rRNA、rpoB和hsp65基因DNA测序分析鉴定为NTM 11株(84.62%),束村氏菌1株(7.69%),戈登氏菌1株(7.69%)。11株NTM中鸟分枝杆菌(M.avium)9株,脓肿分支杆菌(M.abcessus)2株。结论经抗酸染色筛查、L-J和PNB/TCH培养基初步鉴定为NTM的临床分离株通过3种不同基因测序分析鉴定为NTM、束村氏菌和戈登氏菌,以NTM中的鸟分枝杆菌占多数。     

IS6110-限制性片段长度多态性DNA分型在结核分子流行病学研究中的应用

目的 建立宁夏、北京和上海等地结核分支杆菌发离株IS6110－RFLP DNA指纹图谱，观察其流行病学特征。方法 提取结核分支杆菌基因组DNA，经限制性内切酶PvuⅡ切割、琼脂糖凝胶电泳和Southern转印后，用荧光标记的IS6110DNA序列中245bp探针杂交，以核酸化学发光试剂盒探测荧光信号，比较各菌株指 IS6110拷贝数和带型，分析不同地理区域流行菌株的特点。结果 103例结核患的临床分离株，经245bp探针杂交后的指纹图谱显示大部分菌株含8－21个IS6110拷贝，在宁夏和北京地区流行的结核分支杆菌带型具有共同特点，并有成簇分布的现象，在上海分离株中发现1株零拷贝株和1株单拷贝株。结论 IS6110－RFLP DNA分型方法可用于我国流行的结核分支杆菌分子流行病学研究；宁夏分离株与北京分离株在基因上亲缘关系较相近。     

RD105缺失基因检测法及VNTR技术用于河南省结核分支杆菌基因分型分析及其耐药相关性研究

目的了解河南省结核分支杆菌＂北京家族＂基因型的分布、多位点可变串联重复序列（VNTR）基因型特征及其与耐药的相关性。方法应用VNTR技术、RD105缺失检测法分析结核分支杆菌的基因型,聚类分析采用B ionumberics5.0软件分析。结果 154株结核分支杆菌临床分离株中,人型结核分支杆菌137株,非结核分支杆菌14株,结核分支杆菌复合群3株;RD105缺失基因检测法检测结核分支杆菌菌株137株,＂北京家族＂基因121株（88.3%）;7位点VNTR检测结果显示明显的基因多态性。经基因聚类分析,可分为3个基因群（Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群）,其中Ⅰ群为主要流行群,占90.5%（124/137）,含114个基因型。耐多药率为6.6%（9/137）。结论河南省结核分支杆菌以＂北京家族＂基因型为主要流行株,应引起重视;＂北京家族＂基因型与耐药无明显相关性。     

结核菌和非典型分枝杆菌的初步鉴别方法及其实验条件的比较

在结核病防治的基层单位进行全面的菌型鉴定工作是有困难的,但可用一些较简便方法将非典型分枝杆菌筛选出来集中送至中心实验室或有条件的单位再进一步分型。根据目前情况,除快速生长与菌落产生色素的一些菌株外,非典型分枝杆菌的初筛主要靠以下三种简便、安全的方法:PNB培基上的生长,28℃培养时生长和耐热触酶试验。本文对此三种方法的实验条件进行观察,同时总结620株菌型鉴定结果。     

第四次全国结核病流行病学调查分支杆菌菌种鉴定及分析

目的 通过对第四次全国结核病流行病学抽查调查分离出的菌株进行分支杆菌菌种鉴定，进一步了解全国的分支杆菌菌种的构成和分布及其受检查者的治疗情况。方法 依照《结核病细菌学检验规程》（中国防痨协会，1995）和《Public health Mycobecteriology,a guide for the level Ⅲ Iaboratory》（U.S.Department of Health and Human Service/Public Health Service/Centers of Disease Control)对所有待测菌株进行生化试验鉴定。结果 第四次全国结核病流行病学抽样调查分离出的441株菌结核分支杆菌占11．1％（49／441）。数据提示第四次全国结核病流行病非结核分支杆菌分离率高于，90年。分离出非结核分支杆菌的受检中有30．6％（15／49）接受过抗结核治疗。结论 研究数据显示我国非结核分支杆菌分离率呈上升趋势。建立准确，快速的鉴定方法，关注体质弱者是必要的。     

PCR法鉴定结核分枝杆菌复合群亚种的研究

结核分枝杆菌复合群中各菌型致病性和药物敏感性不尽相同,在临床治疗前需要进行菌种鉴定,目前临床使用的生化方法耗时长,给治疗带来不便,本研究采用PCR法可快速鉴定结核分枝杆菌复合群亚种,具有快速、准确的优点,现将研究结果报道如下。1材料和方法1.1材料1.1.1菌株人结核分枝杆菌标准株(H37Rv,CMCC(B)95053)和牛结核分枝杆菌标准株(CMCC(B)93006),非洲分枝杆菌标准株(M.africanum,CMCC(B)95049)购自国家菌种保存中心。19株牛结核分枝杆菌分离株(M.bovis),PNB培养生长试验阴性,TCH培养生长试验为阴性;20株人结核分枝杆菌分离株(M.tb) 更多还原     

结核分枝杆菌对对硝基苯甲酸耐药性的研究

目的 观察和分析MTB对对硝基苯甲酸(PNB)的耐受情况,为实验室鉴定分枝杆菌菌种提供依据.方法 菌株来源为广州市胸科医院门诊和住院患者,从1449株分枝杆菌中确定MTB菌株1114株,对PNB培养基上生长的分枝杆菌,采用MPB64单克隆抗体试剂或进行传统生化试验,以区分MTB和非结核分枝杆菌群(NTM).实验组菌株58株为在PNB培养基上生长的分枝杆菌,但经传统生化试验义疑似MTB,经传统生化试验证实为MTB菌株后,再进行PNB最小抑菌浓度(MIC)试验,以观察其对PNB的耐受性;对照组菌株10株为在PNB鉴别培养基上不生长,经传统生化试验证实为MTB菌株;另选择H37Rv标准株和鸟分枝杆菌标准株及5株临床NTM分离株进行PNB药物的MIC值检测.两组间比较采用成组t值检验.结果 MTB菌株对PNB的耐药率为5.21%(58/1114),实验组菌株PNB的MIC值为1.0～1.5 g/L,而对照组PNB的MIC值为0.25～0.5 g/L,H37Rv标准株PNB的MIC值为0.25g/L,鸟分枝杆菌标准株和5株NTM临床分离株PNB的MIC则＞2.0g/L,实验组与其他各组比较,差异均有统计学意义(t值为4.87～6.68,均P＜0.01).结论 在采用PNB培养基进行分枝杆菌菌群初筛时,如出现菌株对PNB耐药,但菌落形态呈米黄色、粗糙呈菜花样 等,以及对一线抗结核药物敏感等符合MTB的特征时,必须进行传统的生化试验,或使用MPB64单克隆抗体试验进行菌型鉴定,或利用MTB对温度较为敏感的特点及药敏结果进行判断,以免将MTB误判为NTM导致误诊.

Abstract：

Objective To investigate the resistance of Mycobacterium tuberculosis ( MTB ) to p-nitrobenzoic acid ( PNB ), in order to provide the scientific basis for reliable identification of laboratory strains of mycobacterium. Methods Strains of mycobacterium grown in PNB media were identified with additional traditional biochemical tests, according to the standard protocols of laboratory diagnostics for tuberculosis by the Chinese Antituberculosis Association. For mycobacteria grown in the PNB media but highly suspected as MTB by traditional biochemical tests, MPB64 monoclonal antibody was used for the differentiation between MTB and non-tuberculosis mycobacteria group ( NTM ). Minimal inhibitory concentrations ( MIC ) of PNB was further determined for culture-confirmed MTB, 10 strains of clinically isolated MTB ( control ), H37 Rv standard strain, mycobacterium avium standard strain, and 5 strains of clinically isolated NTM. Results A total of 1114 strains of MTB were confirmed, among which 58 PNB manifested resistance. The rate of resistance was 5.21% ( 58/1114 ), with an MIC ranging for 1. 0 - 1.5g/L. The MICs of control MTB and H37 Rv standard strain were 0. 25 - 0. 5 g/L and 0. 25 g/L, respectively.Both mycobacterium avium standard strain and clinically isolated NTM showed an MIC of ＞ 2. 0 g/L.Differences between groups were statistically significant ( t = 4. 87, 5.09, 6. 68, respectively, P ＜ 0. 01 ).Conclusion In order to avoid laboratory misdiagnosis, for primary screening with NTB with PNB culture,the presence of MTB characteristics, including cream-colored broccoli-like colony morphologies, as well as clinical response to first-line anti-tuberculosis medications, despite PNB tolerance, warrants further investigations of traditional biochemical tests, differentiation with MPB64 monoclonal antibodies, or simply by the use of temperature manipulation or drug-sensitivity test results.     

采用16SrRNA序列分析方法鉴定第四次全国结核病流调的非结核分支杆菌

目的 从核苷酸序列水平建立一种非结核分支杆菌的鉴定方法，以用于其流行病学调查。方法 对第四次全国结核病流行病学抽样调查获得的49株非结核分支杆菌，采用16SrRNA基因片段序列分析的方法进行鉴定，结果 五株标准菌株的测序结果与其命名完全相符。49株流调非结核分支杆菌中．41株可明确鉴定，4株不能明确鉴定到种，4株扩增失败无法鉴定。所占比例较高的菌种为：不产色分支杆菌(7/41)，土地分支杆菌(6／41)，胞内分支杆菌(5／41)，偶然分支杆菌(4／41)。结论 在基因水平上较客观地了解我国目前可引起可疑肺结核症状的非结核分支杆菌的流行状况。16SrRNA基因片段序例分析鉴定非结核分支杆菌的方法快速、简便、准确并可发现一些新的菌种。