人骨形成蛋白2基因克隆及真核表达载体的构建

在大肠杆菌中克隆人骨形成蛋白2基因并获得真核表达载体。由人成骨瘤细胞中提取总RNA，利用逆转录PCR方法扩增获得人骨形成蛋白2基因cDNA；将此基因片段重组到pGEM-T克隆载体中，转化到大肠杆菌DH5α后，蓝白斑筛选阳性克隆，利用限制性酶切、PCR扩增和核苷酸序列分析鉴定重组质粒；将pGEM-T克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体中，用限制性酶切和PCR扩增鉴定重组质粒。结果表明：重组在两种质粒中的基因片段为人骨形成蛋白2基因全编码序列。克隆获得人骨形成蛋白2基因．并得到此基因的真核表达载体，为人骨形成蛋白2的表达打下了基础。     

β-淀粉样蛋白真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建β-淀粉样蛋白真核表达质粒,为进一步开展老年性痴呆DNA疫苗的保护性研究打下基础。方法提取Tg2576转基因鼠基因组DNA,PCR扩增β-淀粉样蛋白(Aβ1-42)基因,用限制性内切酶KpnⅠ/XhoⅠ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3.1酶切,将目的基因定向克隆到pcDNA3.1载体上;对重组质粒进行双酶切初步鉴定后进行序列测定。结果特异扩增出Aβ1-42片段,大小为126bp,片段成功插入pcDNA3.1载体中。经双酶切及序列测定结果表明Aβ1-42目的基因正确重组入pcDNA3.1载体中。结论成功构建Aβ1-42真核表达质粒。     

人α-防御素-1(α-HNP-1)基因真核表达载体的构建及在大鼠骨髓间充质干细胞中的转染表达

目的构建人α-防御素-1(α-HNP-1)基因的真核表达载体,并且转染大鼠骨髓间充质干细胞。方法提取人外周血粒细胞中的总RNA,反转录为cDNA作为模板,采用PCR的方法扩增得到人α-防御素-1(α-HNP-1)的基因片断。将扩增产物连接入pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,蓝白筛选,对PCR及酶切鉴定含有目的片断的克隆进行测序。经测序证实无误后,将获得的pGEM-T-HNP-1重组质粒上的α-HNP-1基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)上,构建HNP-1的真核表达载体pcDNA3.1-HNP-1。将真核表达载体pcDNA3.1-HNP-1用脂质体法转染原代大鼠骨髓间充质干细胞,用免疫组化法检测α-HNP-1的表达。结果获得预期大小为303bp的RT-PCR产物;经PCR、酶切鉴定和DNA测序分析证实重组质粒载体pcDNA3.1-HNP-1构建正确;免疫组化法显示转染细胞呈阳性反应。结论成功构建HNP-1基因的真核表达载体,并且在大鼠骨髓间充质干细胞中能成功表达。     

PML-RARα/pIRES和PML-RARα/pSecTag重组载体的构建和鉴定

目的 构建PML-RARα基因重组表达质粒,为发展PML-RARα基因疫苗提供实验依据. 方法利用RT-PCR方法从急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞中扩增出465 bp 的位于PML-RARα融合基因的框内结构的片段,克隆至真核表达载体pIRES和分泌载体pSecTag后,经酶切和序列分析鉴定重组质粒的构建情况.结果 经酶切鉴定和序列测定表明,PML-RARα目的基因已正确插入真核表达载体中,构成了目的重组载体. 结论成功构建了PML-RARα/pIRES和PML-RARα/pSecTag重组真核表达质粒,可进一步用于PML-RARα基因疫苗的实验研究.     

血管生成素1基因真核表达质粒的构建及测序

目的:构建血管生成素1(Ang1)的真核表达质粒psecTagBk-Ang1。方法:用PCR方法从人心脏文库中扩增Ang1基因全外显子片段, 并定向插入真核表达载体psecTagBk中, 用限制性内切酶酶切和测序鉴定克隆的Ang1基因。结果:扩增出人Ang1cDNA片段, 测序结果显示扩增的Ang1cDNA包括长为1497bp、1494bp的2种剪切体, 分别编码498和497个氨基酸残基。限制性内切酶酶切和DNA测序证实获得正确的重组质粒psecTagBk-Ang1。结论:发现2种共存的Ang1cDNA剪切体, 并成功构建真核表达质粒psecTagBk-Ang1。     

PML-RARα/pIRES和PML-RARα/pSecTag重组载体的构建和鉴定

目的 构建PML-RARα基因重组表达质粒,为发展PML-RARα基因疫苗提供实验依据. 方法利用RT-PCR方法从急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞中扩增出465 bp 的位于PML-RARα融合基因的框内结构的片段,克隆至真核表达载体pIRES和分泌载体pSecTag后,经酶切和序列分析鉴定重组质粒的构建情况.结果 经酶切鉴定和序列测定表明,PML-RARα目的基因已正确插入真核表达载体中,构成了目的重组载体. 结论成功构建了PML-RARα/pIRES和PML-RARα/pSecTag重组真核表达质粒,可进一步用于PML-RARα基因疫苗的实验研究.     

小鼠pdx-1基因真核表达载体的构建及其在胚胎干细胞中的表达

目的： 克隆小鼠pdx-1基因，构建其真核表达载体，并在小鼠胚胎干细胞中表达，为糖尿病的细胞移植治疗奠定基础。方法： PCR扩增小鼠胰腺pdx-1基因 cDNA，酶切后和携带绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1重组，将pdx-1基因 cDNA片段连接到pEGFP-N1载体的多克隆位点，形成重组载体pEGFP/pdx-1，转化大肠杆菌DH5α菌株，构建成pdx-1基因真核表达载体质粒。扩增DH5α后抽提质粒DNA，Hind Ⅲ 和BamHⅠ酶切，电泳，DNA测序鉴定。鉴定正确的质粒DNA用脂质体包裹后转染小鼠胚胎干细胞MESPU13。结果： 从小鼠胰腺cDNA扩增出876 bp的DNA片段并成功重组到pEGFP-N1载体中。经酶切和DNA测序验证，插入载体的DNA片段为pdx-1基因，插入方向正确。重组质粒经脂质体转染胚胎干细胞MESPU13，24 h 后观察到绿色荧光蛋白报告基因和目的基因的pdx-1表达。结论： 小鼠pdx-1基因的克隆和真核表达载体构建获得成功，为进一步研究其功能奠定了基础。     

小鼠γ-干扰素真核表达质粒的构建和鉴定

目的克隆小鼠γ-干扰素(γ-IFN)基因,构建并鉴定小鼠γ-干扰素真核表达质粒.方法从BALB/c小鼠脾脏提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出小鼠γ-干扰素基因, 分别用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切扩增片段和pcDNA3.1(-),定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(-),构建成真核表达质粒pcDNA3.1(-)γ-IFN.转化产物通过PCR扩增筛选,双酶切鉴定;阳性克隆进行序列分析.结果 RT-PCR产物电泳可见一约500bp大小目的片段.PCR和双酶切电泳结果均证实已插入约500bp的γ-IFN基因片段;阳性克隆测序结果表明克隆的小鼠γ-干扰素基因完全正确.结论成功构建了小鼠γ-干扰素真核表达质粒,为进一步气道内实施哮喘小鼠基因治疗打下了坚实基础.     

弓形虫ZS1株抗原基因的扩增及克隆

本文采用PCR技术，自行设计一对寡核酸引物(P1，P2)，从弓形虫ZS2基因组DNA中特异扩增出编码P30抗原的基因片段。扩增的目的片段经纯化后用FxcoRⅠ和HindⅢ双酶切后,克隆到真核表达质粒pcDNA3中，转化人大肠杆菌TG1，用氨苄青霉素和PCR初筛，将PCR扩增阳性的重组子用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定。结果成功地构成建真棱型表达质粒pcDNA-P30，从而为进一步进行重组P30抗原的体外表达创造有利条件。     

小鼠γ—干扰素真核表达质粒的构建和鉴定

目的 克隆小鼠γ-干扰素(γ-IFN)基因，构建并鉴定小鼠γ-干扰素真核表达质粒。方法 从BALB／c小鼠脾脏提取总RNA，用RT—PCR方法扩增出小鼠γ-干扰素基因，分别用EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切扩增片段和pcDNA3.1(-)，定向克隆到真核表达质粒pcDNA3．1(-)，构建成真核表达质粒pcDNA3．1(-)γ-IFN，转化产物通过PCR扩增筛选，双酶切鉴定；阳性克隆进行序列分析。结果 RT—PCR产物电泳可见一约500bp大小目的片段，PCR和双酶切电泳结果均证实已插入约500bp的γ-IFN基因片段；阳性克隆测序结果表明克隆的小鼠γ-干扰素基因完全正确。结论 成功构建了小鼠γ-干扰素真核表达质粒，为进一步气道内实施哮喘小鼠基因治疗打下了坚实基础。     

异亮氨酸拉链修饰的可溶性CD40L在巴斯德毕赤酵母中的表达

为了获得异亮氨酸拉链修饰的可溶性CD40L（IZ—sCD40L）在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达。首先用PCR和重叠PCR的方法得到了IZ—sCD40L基因片段。然后构建了巴斯德毕赤酵母表达质粒pPICZaA—IZ—sCD40L．核酸测序分析表明IZ—sCD40L的基因片段正确克隆到pPICZaA质粒中。将其线性化后。电转化到巴斯德毕赤酵母GS115中，PCR筛选阳性重组菌株，经表型鉴定后，用甲醇进行诱导表达。经SDS—PAGE和Western blot印迹杂交结果证实了表达产物为重组IZ—sCD40L的融合蛋白。     

构建分泌型HBsAg单链抗体在毕赤酵母菌中的表达研究

为了从巴氏毕赤酵母中获得分泌表达的非融合人源抗HBsAg单链抗体 (HBscFv ) ,设计引物从pGEM HBscFv上扩增HBscFv,亚克隆至P pastoris表达载体pPICZαA中 ,然后转化P pastorisGS115、KM71,菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定转化子 ,甲醇诱导目的蛋白表达并对其性质进行鉴定。结果发现 ,3%～ 5 %的转化子具有 2 0 0 0mg/LZeocin抗性 ;转化子诱导后 ,可以合成并分泌相对分子质量为 32 0 0 0的HBscFv ,表达量占酵母培养上清中总蛋白的 2 2 % ;酵母表达产物可被针对大肠杆菌来源HBscFv的单克隆抗体特异性识别 ,并具有结合HBsAg活性。     

人组织因子途径抑制因子在毕赤酵母中高拷贝表达

目的 构建高拷贝表达重组人组织因子途径抑制因子的毕赤酵母并对蛋白表达条件进行初步优化,为相关研究奠定基础.方法 将PCR扩增得到的TFPI cDNA片段与表达质粒pPIC9K连接构建重组质粒rhTFPI-pPIC9K,采用PCR方法及DNA测序对其进行鉴定.将重组质粒转化酵母细胞GS115,利用G418抗性实验筛选含有...     

重组人角质细胞生长因子在毕赤酵母中的表达、纯化及活性测定

目的:利用巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)重组表达人角质细胞生长因子(humankeratinocytegrowthfactor,hKGF),为实现规模化生产重组hKGF奠定基础。方法:根据已报道的hKGF成熟肽序列,人工合成由毕赤酵母偏好密码子组成的编码hKGF的DNA片段后连接到分泌型表达质粒pPICZαA中,获得重组表达质粒并转化毕赤酵母X-33中进行表达。优化发酵条件,并利用5L生物反应器进行中试发酵。发酵上清通过超滤及层析方法分离纯化重组蛋白,并利用MMT法检测其对恒河猴肺上皮细胞的促增殖活性。结果:在20℃,甲醇诱导60h后,获得分子量约为28kD的目的蛋白,表达量约占菌体上清总蛋白的14.1%。发酵液经肝素亲和层析和SephardexG-25分子筛分离获得纯度为95.0%以上的重组蛋白,得率为12mg/L。该重组hKGF具有糖基化修饰,能显著促进恒河猴肺上皮细胞增殖,其ED₅₀约为57μg/L。结论:利用毕赤酵母成功表达出糖基化修饰及具促恒河猴肺上皮细胞增殖活性的重组hKGF。     

人Delta-like1ext-Fc融合蛋白毕赤酵母表达载体的构建及表达

目的:构建人Delta-like1ext-Fc融合蛋白毕赤酵母表达载体PIC-hDll1ext -Fc,并在毕赤酵母GS115中表达.方法:以pEF-BOSneo-hdll1ext-Fc为模板PCR扩增人Delta-like1胞外段.通过DNA重组构建毕赤酵母表达载体PIC-hDll1ext.-Fc.用MD平板筛选重组子,G418筛选高拷贝转化子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE、Western blot分析表达蛋白.结果:hDll1基因的胞外段被有效地扩增.序列分析表明,所构建的含hDll1ext-Fc融合基因的质粒与设计相同,融合蛋白hDll1extFc得到正确表达.结论:成功地扩增了人Delta-likel胞外段,构建了hDll1ext-Fc融合基因的毕赤酵母表达载体PIC-hDll1extFc,并在毕赤酵母中正确表达,为进一步研究奠定了实验基础.     

重组人sCR1真核表达载体的构建、表达及其生物学活性

目的:采用酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体(sCR1),研究重组人sCR1融合蛋白的体外生物学活性.方法:从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPICgk中,构建含人sCR1的重组质粒(pPIC9ksCR1),经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中,将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定,经甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Westernblot鉴定,通过Ni2 -NTA agarose亲和层析纯化后进行生物学活性鉴定.结果:获得毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k-sCRI,经G418筛选及PCR鉴定得到高拷贝整合的重组酵母细胞株,经甲醇诱导含pPIC9k-sCR1的酵母SMD1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白.此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr,约31 1300的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆抗体(mAb)识别.经Ni2 -NTA agarose亲和层析纯化后得到较纯的sCR1融合蛋白及较高的生物学活性.结论:人sCR1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性.     

乙型肝炎病毒S基因密码子最佳化及在毕赤酵母中的高效表达

目的 制备适合酵母表达的乙型肝炎病毒S基因,在毕赤酵母中高效表达重组乙型肝炎病毒S蛋白.方法 选用酵母偏爱的同义密码子替换野生型S基因的酵母稀有密码子,采取基因搭桥法及递归式聚合酶链反应,制备合成基因,捕入酵母表达载体pPICZB.携带有合成S基因的重组质粒转化毕赤酵母菌株KM71 H,经甲醇诱导表达乙型肝炎病毒S蛋白.结果 酶切电泳及DNA测序证实合成的S基因正确克隆到表达载体中;聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹显示优化后的乙型肝炎病毒S基因在毕赤酵母中的重组蛋白表达量远高于野生型基因.结论 密码子优化的S基因能明显提高重组S蛋白在毕赤酵母表达系统中的表达量.     

人血管内皮生长因子在毕赤酵母菌中的表达和鉴定

目的 研究人血管内皮生长因子（ｈＶＥＧＦ１６５）基因在Ｐｉｃｈｉａ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母中的表达,获得高效表达的具有生物学活性的重组ＶＥＧＦ１６５。方法 采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ｈＶＥＧＦ１６５基因,经ＤＮＡ序列分析后,插入含ＡＯＸ１启动子和α分泌信号肽序列的Ｐｉｃｈｉａ．ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母载体中,构建重组表达质粒ｐＰＩＣ９Ｋ／ｈＶＥＧＦ１６５,转化酵母宿主菌ＫＭ７１,筛选多拷贝整合转化子,摇瓶培养,１％甲醇诱导表达。结果 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示,诱导４ｄ的培养上清中ｈＶＥＧＦ１６５表达量达上清总蛋白的３０％以上。ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ实验表明,表达产物具有良好的抗原性和特异性。生物学活性检测证实其具有刺激ＨＵＶＥＣ增殖的功能。结论 在Ｐｉｃｈｉａ．ｐａｓｔｏｒｉｓ表达系统中实现了ｈＶＥ