防御素基因原核表达载体构建及表达

目的：为了获得人防御素多肽，实验构建了防御素基因原核表达载体并使其在大肠杆菌中表达。方法：采用从pUC18载体上回收HNP-1外源基因片段，使其与载体pET30b连接，获得pET30b-HNP-1重组质粒，并在大肠杆菌BL-21(DEB)株中表达。结果：发现人防御素融合蛋白得到表达。结论：人防御素基因(HNP-1)可在大肠杆菌BL21(DE3)株中表达，目的蛋白在菌体内以包涵体形式存在。     

人β防御素4基因原核表达载体的构建及其表达

人β防御素4（Humanpdefensin4，HBB4）是一种具有广谱抗微生物活性的抗菌肽。在人体先天免疫尤其上皮及黏膜防御中起重要作用。本研究用重叠延伸PCR扩增合成HBD4cDNA全长，并克隆人pMD18-T载体，用PCR法扩增HBIM成熟肽mamreHBD4，mHB4）编码序列并克隆入表达载体pGEX-4T-2中，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG）诱导下，表达HBD4与谷胱甘肽S转移酶（glutathione S-transferase，GST）的融合多肽。用酶切鉴定、核酸测序、十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳等进行鉴定。结果表明：我们成功合成了HBD4全长编码基因，构建了克隆载体pMD18-T／HBIN和原核表达载体pGEX-4T-2／mHBD4，并在大肠杆菌中成功表达融合蛋白GST—HBD4。     

人α-防御素-1(α-HNP-1)基因乳腺定位表达载体的构建及表达

目的:将人α-防御素-1(α-HNP-1)基因与山羊β-乳球蛋白(Beta-Lac-toglobulin,BLG)基因5’调控区序列融合,构建α-HNP-1基因的乳腺定位表达载体并对其进行检测。方法:用PCR方法获得α-HNP-1基因片断并克隆于pMD18-T载体,经DNA测序证实α-HNP-1基因序列无误后,再将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),构建pcDNA3.1-HNP-1重组质粒。用PCR方法扩增出BLG基因5’区调控序列并克隆到pcD-NA3.1-HNP-1中,构建乳腺定位表达载体pcDNA3.1-BLG-HNP-1,该载体经脂质体包裹后,经乳腺导管注入妊娠中后期大鼠乳腺中进行表达。结果:经酶切鉴定和DNA测序分析证实重组质粒载体pcDNA3.1-BLG-HNP-1构建正确,经ELISA检测,大鼠乳汁中有α-HNP-1表达,其48h表达量为27.67ng/ml,72h表达量为49.00ng/ml。结论:成功构建了α-HNP-1基因乳腺定位表达载体并最终在乳腺获得一定量表达,说明乳腺导管注入法是一种较理想的评价乳腺特异表达载体的可行性方法。     

人防御素-α克隆表达纯化及生物活性初步检测

防御素（Defensin）是一类阳离子大环形多肽,在人体多种器官和组织广泛存在,起着重要的屏障防御作用,对G＋/-菌、真菌及病毒都有杀灭作用.临床观察表明,测定血浆及各种体液中防御素的改变有助于某些炎症性疾患的诊断,如脓毒症、细菌感染及早产等.此外,提纯或重组防御素作为“超级抗生素”来取代传统的抗生素已成为药学界的研究热点.本研究拟在大肠杆菌中表达人防御素-α,建立稳定表达的工程菌和纯化、复性技术途径,获得活性蛋白,为进一步研究提供材料.     

人α-防御素-1(α-HNP-1)基因真核表达载体的构建及在大鼠骨髓间充质干细胞中的转染表达

目的构建人α-防御素-1(α-HNP-1)基因的真核表达载体,并且转染大鼠骨髓间充质干细胞。方法提取人外周血粒细胞中的总RNA,反转录为cDNA作为模板,采用PCR的方法扩增得到人α-防御素-1(α-HNP-1)的基因片断。将扩增产物连接入pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,蓝白筛选,对PCR及酶切鉴定含有目的片断的克隆进行测序。经测序证实无误后,将获得的pGEM-T-HNP-1重组质粒上的α-HNP-1基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)上,构建HNP-1的真核表达载体pcDNA3.1-HNP-1。将真核表达载体pcDNA3.1-HNP-1用脂质体法转染原代大鼠骨髓间充质干细胞,用免疫组化法检测α-HNP-1的表达。结果获得预期大小为303bp的RT-PCR产物;经PCR、酶切鉴定和DNA测序分析证实重组质粒载体pcDNA3.1-HNP-1构建正确;免疫组化法显示转染细胞呈阳性反应。结论成功构建HNP-1基因的真核表达载体,并且在大鼠骨髓间充质干细胞中能成功表达。     

人小肠黏膜防御素5 mRNA的表达特点及意义

目的 检测人小肠黏膜防御素5基因(Alpha defensin 5，DEFA5)的表达，为从分子水平上探讨小肠黏膜抗菌防御机制提供实验依据。方法 从2例新鲜尸体和2例右半结肠癌患者的回肠部位取小肠黏膜提取总RNA，通过RT-PCR扩增出DEFA5的两个外显子序列，比较其个体间的差异；沿小肠轴间隔30cm取新鲜尸体小肠黏膜提取总RNA，仍通过RT-PCR扩增编码HD-5的阅读框序列，比较HD-5沿肠轴的表达趋势。结果 DEFA5在个体间的表达是一致的，通过RT-PCR获得的外显子序列大小为451bp，且碱基序列与GenBank中的DEFA5标准序列相一致；通过PCR获得的编码HD-5的阅读框序列为303bp，其中，酶切位点12bp，保护性碱基6bp，终止子3bp，编码HD-5的序列282bp(94AA)；沿着空肠到回肠的肠轴方向，DEFA5在空回肠黏膜均有表达，至回肠末端最强，并有逐渐增强的趋势。结论 DEFA5基因的表达在个体问是保守的，而且沿着空肠到回肠的肠轴方向在mRNA水平的表达有逐渐增加的趋势，提示HD-5作为天然免疫物质在小肠黏膜屏障功能的维护中起着十分重要的作用。此外，本实验获得的HD-5阅读框序列为进一步重组表达HD-5奠定了基础。     

女性生殖道人Beta-防御素基因的表达

目的 :检测人 β 防御素 (HBDs)基因在女性生殖道各段组织及妊娠相关组织的表达 ,探讨内源性抗菌肽在女性生殖道粘膜天然抵抗致病微生物侵袭机制中的作用。方法 :采用逆转录多聚酶链反应法 (RT PCR)检测正常女性生殖道各段组织及怀孕妇女生殖相关组织中HBD 1、HBD 2的表达情况 ,以 β actin为阳性对照。结果 :细胞株ME 1 80表达HBD 1mRNA ,而不表达HBD 2mRNA ;正常女性阴道、子宫颈、子宫内膜、输卵管、卵巢等 5个组织中均发现有HBD 1mRNA的表达 ,除阴道、卵巢外其余组织也有HBD 2mRNA的表达 ;绒毛膜、绒毛、羊膜、胎…     

人β-防御素的研究进展

β-防御素是一类富含精氨酸,而且具有特殊结构的小分子阳离子多肽,是过去几十年里寻找新型抗生素的重要发现之一.对人类基因组序列的分析表明,人染色编码体的基因含有多达一百多种的β-防御素,它们是连接固有免疫和适应性免疫的重要因子.β-防御素不但对多种细菌、真菌、病毒等具有直接的杀伤作用,而且还与肿瘤发生、组织修复以及生殖成熟等生理过程密切相关.     

日本血吸虫卵壳蛋白基因的克隆及真核表达载体的构建

血吸虫卵壳蛋白基因是探讨血吸虫病免疫预防的重要靶标。本研究根据已发表的多个血吸虫卵壳蛋白基因的核苷酸序列,设计合成了特异引物,体外扩增和克隆了编码日本血吸虫中国大陆株卵壳蛋白基因SjESG的cDNA,测序结果表明与已发表的卵壳蛋白基因序列有较高同源性。为进一步研究该基因的功能,将其克隆入pcDNA3中,成功构建了真核表达载体,为SjESGDNA疫苗的研究打下了基础。     

人β-防御素-2基因5′-端转录调控区DNA片段的克隆及序列初步分析

人 β-防御素 (hBD)主要由上皮细胞生成 ,包括hBD - 1、hBD - 2等亚类 ,是皮肤、粘膜免疫的重要分子。其中hBD - 2是富含半胱氨酸阳离子的由 4 1个氨基酸组成的低分子抗菌肽。通常hBD - 2在健康组织中为低水平表达 ,但当皮肤、肺、气道组织有病菌入侵时可诱导hBD - 2的大量表达。对牛气道防御素 (TAP)受LPS刺激诱导表达的转录机制的研究表明NF -κB和NF -IL6共同调控TAP基因的转录。本研究将人 β -防御素 - 2基因上游序列输入Matinspector软件 ,应用Matinspector软件于转录因子数据库 (http ://tansfac gbf de/TRANSFAC)中…     

人类白细胞抗原-G5慢病毒表达载体构建与病毒包装

目的:构建人类白细胞抗原G5(HLA-G5)的表达载体,并进行慢病毒包装,为进一步研究HLA-G5功能提供基础工具。方法:人工合成HLA-G5全长序列经测序正确后,定向接入真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP,转化入大肠杆菌,酶切鉴定并测序正确后进行慢病毒包装和滴度测定。结果:经琼脂糖凝胶电泳鉴定、PCR鉴定及测序,HLA-G5表达质粒质量合格,序列比对与设计序列符合率100%,HLA-G5慢病毒滴度测定为7.06×108。结论:成功地构建了HLA-G5表达载体并完成了慢病毒包装,为今后的研究工作提供了基础工具。     

结核分枝杆菌Ag85B基因的克隆及真核表达载体的构建

目的 构建以结核分枝杆菌分泌蛋白Ａｇ８５Ｂ基因为基础的核酸疫苗。方法 采用聚合酶链反应从结核杆菌Ｈ３７Ｒａ株基因组中,扩增出蛋白Ａｇ８５Ｂ的成熟蛋白的编码基因,用限制性内切酶消化后,插入克隆载体ｐＵＣ１９中。经酶切鉴定与序列测定证实后,以亚克隆法构建于真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的相应酶切位点。结果 结核分枝杆菌Ｈ３７Ｒａ株Ａｇ８５Ｂ成熟蛋白的编码基因经序列测定证实,与Ｅｒｄｍａｎ株完全一致;用Ｅｃｏ     

人SYNOVIOLIN基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建携EGFP的人SYNOVIOLIN基因真核表达载体。方法：应用基因重组技术,根据人SYNOVIOLIN基因序列和表达载体pIRES2-EGFP质粒上的多克隆位点设计引物,对含有SYNOVIOLIN基因的质粒pCDNA3-syno扩增,得到约1900 bp的目的片段,进行T-A克隆。SalⅠ/BamHⅠ双酶切测序正确的重组质粒,回收SYNOVIOLIN cDNA片段,将其亚克隆于pIRES2-EGFP载体的多克隆位点内得到质粒pIRES2-EGFP-syno。脂质体法转染HEK293细胞, 用激光共聚焦显微镜和Western blot检测EGFP和SYNOVIOLIN在HEK293细胞的表达。结果：PCR,酶切及测序结果表明pIRES2-EGFP-syno真核表达载体构建成功,激光共聚焦显微镜和Western blot显示EGFP和SYNOVIOLIN蛋白在HEK293细胞中成功表达。结论：成功构建pIRES2-EGFP-syno真核表达载体并在HEK293细胞表达,为抗肌腱粘连的　SYNOVIOLIN基因治疗研究奠定基础。     

人生长激素基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建人生长激素的真核细胞表达载体,测定并分析目的 基因序列.方法 用PCR方法扩增出人生长激素基因,连接至T克隆载体,然后分别亚克隆至真核细胞表达载体pCDNA3.1、pCEP4中.使用DNA ssist软件分析序列.结果 所构建真核表达载体的酶切鉴定、PCR鉴定、测序鉴定均正确.结论 成功构建出多个人生长激素基因真核细胞表达载体,验证了基因序列的正确性,为下一步基因治疗研究打下基础.     

Construction of eukaryotic expression vector of TSLC1 gene

Introduction

To construct a eukaryotic expression vector of the tumour suppressor in lung cancer 1 (TSLC1) gene, so as to explore the mechanisms of tumour suppression of the gene theoretically.

Material and methods

The open reading frame (ORF) of TSLC1 gene was amplified with RT-PCR from normal human foreskin acrobystia, and cloned to pMD19-T simple vector (TA Clone method). The resultant plasmid was transformed into Escherichia coli JM109 for amplification. The TA Clone recombinant was digested by double restriction enzyme (Bgl II/EcoR I) and analysed with agarose gel electrophoresis. The positive one was sequenced. The inserted DNA fragment was recovered, and then it was mounted into the eukaryotic expression vector pIRES2-EGFP, transformed into E. coli JM109 for amplification. A positive recombinant plasmid named pIRES2-EGFP-TSLC1 was confirmed by Bgl II/EcoR I double-enzyme digestion analysis.

Results

RT-PCR amplified the ORF of the TSLC1 gene. It was approximately 1400 base pairs. The obtained DNA was confirmed a high degree of homology with the sequence of TSLC1 cDNA sequence ({"type":"entrez-nucleotide","attrs":{"text":"AY358334","term_id":"37181792"}}AY358334) stored at GenBank.

Conclusions

Construction of a TSLC1 eukaryotic expression vector was successful, and it has established a solid foundation for further study.     

胰岛-脑1基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的 构建并鉴定表达胰岛-脑1(Islet-Brain 1,IB1)基因的真核细胞表达质粒.方法 从人胰岛细胞瘤提取总RNA,根据IB1 cDNA文库的序列利用RT-PCR扩增IB1基因.将此基因插人带有绿荧光的真核表达载体pEGFP-N1的EcoR1/KpnI酶切位点区域,携带IB1基因的真核表达质粒转染到胰岛细胞系(RINm5F),最后通过G418筛选获得稳定的携带IB1基因的胰岛细胞系.利用倒置相差荧光显微镜、流式细胞仪、Western blot鉴定的质粒及转染的细胞系.结果 RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析为840 bp的分子(IB1 AA1-280),测序分析证明与Genbank IB1 cDNA具有相同的序列.用EcoR I和Kpn I消化可见两条条带,Western blot分析证明IB1基因在RINm5F细胞表达.结论 成功构建了pEGFP-N1-IB1真核表达载体,转染到胰岛细胞系并稳定表达.     

人源性抗HFRS病毒抗体基因真核表达载体的构建及鉴定

构建人源性抗ＨＦＲＳ病毒基因工程抗体基因的表达载体,为其进一步在真核细胞中表达奠定基础。方法：经多次克隆将人源性抗ＨＦＲＳ病毒抗体可变区基因与启动子,增强子、前导肽序列和剪接供体信号等真有达元件及人抗体恒定区基因和抗生素选标记基因相连接。     

小鼠α烯醇化酶基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建小鼠α烯醇化酶（En01）基因的真核表达载体。方法以健康小鼠肾脏组织细胞的eDNA为模板,采用聚合酶链式反应（PCR）扩增Enol基因编码区的全部序列,克隆至真核细胞表达载体pCDNA3．1^＋中,测序鉴定目的基因用阳离子脂质体转染的方法转染中国仓鼠卵巢CHO细胞。结果PCR扩增的特异性片段长度为1304bp,以此构建重组质粒pCDNA3．1^＋-Enol,测序结果与Gen．bank中的鼠源Enol基因eDNA序列一致。转染中国仓鼠卵巢细胞后可检测到Enol蛋白的表达。结论构建的真核表达载体pCDNA3．1^＋-Enol可在真核细胞内正确表达,这为进一步的疫苗研究奠定了基础。     

Construction and identification of a human liver specific microRNA eukaryotic expression vector

MiR-122 is one of the non-coding RNAs which showed its effects on the lipo-metablism, virus infection and HCC forming through regulation of liver gene expression. Its eukaryotic expression vector was constructed by using pSuper which was widely applied in the siRNA expression. The precursor of human miR-122 gene was amplified by polymerase chain reaction （PCR） from the human genomic DNA. The positive clones were screened by PCR and restriction enzyme digestion. The new expression vector of miR-122 was named pHsa-m122. PHsa-m122 and its controls were transfected to HepG2 cells. The miR-122 expression activity was evaluated by GFP122i sensor reporter plasmid through fluorescence detection and Western blot. It was shown that the fluorescence intensity of GFP122si and pHsa-m122 co-transfection group was weaker than that of the controls, so the functional activity of expressed miR-122 was detected. When HepG2 cells were co-transfected with HBV1.3 and pHsa-m122 plasmids, the results showed miR-122 may down-regulate the gene expression of HBV. The human liver specific microRNA eukaryotic expression vector of miR-122 was constructed successfully, which may facilitate further study of its function in the development of liver virus infection diseases and HCC. Cellular ＆ Molecular Immunology.