阳离子脂质体及其在体内基因转染中的应用

阳离子脂质体已经成为基因转移使用最广泛的载体之一。本文从阳离子脂质体的理化特性、质粒/阳离子脂质复合体与生物大分子的相互作用、质粒/脂质复合体的基因转移机制等方面,对阳离子脂质体及其在体内基因转染中的应用进行了综述。     

用RT-PCR技术检测hSIM基因的表达

ｈＳＩＭ基因（ｓｉｎｇｌｅ－ｍｉｎｄｅｄｇｅｎｅ）是新近发现的位于人类２１号染色体与胚胎细胞分化有关，并在人一些器官系统形成过程中起重要作用的基因。由于人基因组ｈＳＩＭ基因及ｈＳＩＭ基因ｃＤＮＡ均未克隆，研究ｈＳＩＭ基因表达对阐明该基因功能具有重要意...     

生长激素基因

生长激素基因与人绒毛膜生长催乳素基因密切相关，由５个同源性程度很高的基因共同组成基因簇，位于人第１７号染色体长臂的ｑ２２－２４带上，其中只有生长激素结构基因（ＧＨ－Ｎ）能在垂体中表达，表达产物９０％为有活性的２２ｋＤａ ｈＧＨ，１０％为２０ｋＤａ ｈＧＨ。ＧＨ－Ｎ基因的启动子是５＇端上游的前２８９ｂｐ，它含有ＧＨＦ－１因子。反式作用因子、甲状腺素和糖皮质激素的结合位点，它们控制着ＧＨ－Ｎ基因表达的     

SCL基因在白血病和正常骨髓基质细胞中的表达

目的：初步了解干细胞白血病（SCL）基因在白血病和正常骨髓基质细胞中的表达情况。方法：通过长期体外培养扩增骨髓基质细胞，运用RT－PCR－ELISA检测SCL基因的表达。结果：SCL表达于绝大多数CML、AML、CLL患者骨髓基质细胞中，部分正常骨髓基质细胞也表达SCL基因。结论：SCL可能与白血病和正常的骨髓基质细胞的造血调控作用有关。     

人生长激素基因在小鼠体内的表达及其对血清中细胞因子浓度的影响

目的 :探讨体内高水平的人生长激素 (GH)对机体免疫功能的影响。方法 :构建人GH基因的真核表达质粒pcDNA3 hGH ,直接注射于小鼠的股四头肌中。注射后分别在第 5、15、2 5天分离血清 ,通过ELISA方法检测血清中GH的水平 ,同时检测血清中IL 2、IFN γ和TNF α水平的变化。结果 :所构建的质粒目的基因插入正确 ,转染细胞能分泌高水平的GH。接受质粒的小鼠血清中人GH的浓度与对照组相比较明显提高 ,但IL 2、IFN γ和TNF α的浓度没有显著变化。结论 :体内较高水平的GH对IL 2、IFN γ和TNF α的分泌没有显著影响     

人β2m基因的克隆及表达

β2m是含有99个氨基酸的血清蛋白,也是构成MHC-I类分子的亚单位。最初从肾脏患者的尿液中分离得到[1],其表达异常与多种肿瘤及肝、肾疾病有密切关系。HLA-A2的晶体结构已证实,α3和β2m折叠起来形成Ig样功能区[2],并表明β2m对维持I类分子的天然构型的稳定性及其表达起关键作用[3,4]。MHC-I类分子在免疫系统中占有极其重要的地位,目前已趋向利用基因工程技术构建MHC-I类分子复合物以克服从体内获得的困难[5,6]。本研究成功地构建了其轻链β2m的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达。1 材料和方法1.1 材料E.coli C600…     

人THANK基因真核表达载体的构建及其在人胚肾细胞中的表达

１材料和方法１．１材料　大肠杆菌Ｋ８０２、人胚肾细胞２９３由本室验室保存。细胞转染试剂脂质体Ｃｌｏｎｆｅｃｔｉｎ购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司。ＤＭＥＭ购自ＧＩＢ－ＣＯ公司。Ｇ４１８购自Ｓｉｇｍａ公司。胎牛血清购自杭州四季青公司。鼠抗人ＴＨＡＮＫ单克隆抗体由倪健博士赠送。含有ＴＨＡＮＫ全长ｃＤＮＡ的质粒ｐＭＤ１８－ＴＨＡＮＫ为本实验室构建［］。真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１购自Ｉｎｖｉｏｔｒｏｇｅｎｅ公司。质粒ｐＭＤ１８－Ｔ购自ＴａＫａＲａ公司。ＤＮＡ胶回收试剂盒、细胞ＲＮＡ抽提试剂盒，购自华舜生物工程…     

MAGE—1,—2,—3基因在消化道肿瘤中的表达

ＭＡＧＥｓ（ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｅｎｅｓ）家族位于Ｘ染色体上,由１７个基因成员组成的基因家族。除了睾刃和胎盘外,它们在正常组织中均不表达。但在黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、大肠癌等恶性肿瘤中表达。它们编码的抗原肽可与人类白细胞抗原ＨＬＡ（Ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｅｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ）分子结合,形成抗原复合物,与ＣＴＬ受体结合,被特异性ＣＴＬｓ（ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）细胞所识别,激活特异性ＣＴＬ的杀伤活力。因此ＭＡＧＥｓ基因编码蛋白成为肿瘤免疫治疗的靶抗原。本文采用ＲＴ－ＰＣＲ检测ＭＡＧＥ－１、２、３在消化道肿瘤患者的分布,以分析其在消化道肿瘤中免疫治疗的应用价值。     

小鼠MBL-A基因的克隆和序列分析

目的：克隆小鼠甘露聚糖结合凝集素-A(MBLA)基因的全长编码区cDNA。方法：利用RT-PCR方法，从Balb/c小鼠的肝细胞中，分离出MBL-A基因cDNA片段，克隆入pUC-T载体，测序并进行分析。结果：扩增得到的小鼠MBL-A基因cDNA全长720bp，编码240个氨基酸残基，包含了完整的富含半胱氨酸区、胶原区、颈区和糖识别域。分析表明，与Genbank中发表的序列具有99.9％的同源性。结论：获得小鼠MBL-A基因的克隆，为进一步研究MBL-A分子在体内的生物学功能奠定了一定基础。     

人sCD40L基因的克隆及表达

目的 克隆人sCD40L基因片段，并在原核细胞中表达。方法 用RT－PCR技术，从激活的人外周血淋巴细胞总RNA中，扩增CD40L胞外区cDNA，并克隆至载体pGEM-T。测序验证后，转至载体PQE31中，并在大肠杆菌M15中进行表达，最后通过亲和层析柱得到纯化蛋白。结果 纯化所得的产物经Western blot证实，确为人sCD40L蛋白。结论 应用基因重组法构建了人sCD40L基因片段，并在原核细胞内成功地进行了表达，为今后进一步研究CD40L与凋亡、疾病的发病机制及临床治疗奠定了基础。     

人黑色素瘤抗原MAGE—3基因的克隆与表达

目的 克隆人黑色素瘤特异抗原MAGE-3基因,以制备肿瘤DNA疫苗。方法 用RT-PCR方法制备MAGE-3基因,以哺乳细胞高效表达质粒pCI-neo为载体,构建重组DNA疫苗。重组体用载体上的通用引物为测序引物,鉴定克隆的正确性。再将鉴定过的重组质粒用脂质体法转化293细胞,用免疫印迹法鉴定转化细胞中MAGE-3基因的表达。结果 正确构建了MAGE-3/pCI-neo重组质粒,并且在转化细胞中检测出了MAGE-3的表达。结论 成功地构建了重组MAGE-3/pCI-neo肿瘤核酸疫苗,可以进行下一步的肿瘤动物模型的疫苗接种及疗效观察。     

人THANK cDNA的克隆及其在大肠杆菌中表达

目的克隆THANKcDNA,并在大肠杆菌中进行表达。方法采用RT-PCR技术,从人外周血单个核细胞的总RNA中扩增人THANK全长编码区基因及THANK胞外区编码基因,PCR产物直接克隆于pMD-18T载体中,重组克隆进行DNA测序。将测序证实的THANK胞外区基因亚克隆到原核表达载体pET-11a中。阳性重组子,以1mmol/LIPTG进行诱导表达,以SDS-PAGE分析THANK胞外区的表达。对表达的蛋白作初步纯化处理后,进行生物学活性检测。结果RT-PCR扩增出一个858bp的DNA片段,限制性内切酶图谱分析和测序结果显示,该片段为编码人THANK的cDNA,与公布的人THANK基因序列一致。将胞外区片段克隆入表达载体,转化大肠杆菌表达后发现,与阴性对照相比,在相对分子质量（Mr）26×104处多显示出一条条带。对该蛋白进行初步活性测定显示其可显著地抑制U937细胞的生长。结论本实验成功地克隆了人THANK基因,并将其可溶性胞外区片段在大肠杆菌中进行了表达,表达的重组蛋白可抑制U937细胞的生长。这为进一步进行THANK基因的功能研究及其开发和临床应用奠定了基础。     

人破骨细胞生成抑制因子在真核细胞中的表达

目的 克隆人破骨细胞生成抑制因子（OPG／PCIF）编码区基因并在真核细胞中表达，为进一步研究OPG／OCIF的生理功能及探讨骨质疏松症等疾病的治疗奠定基础。方法 以人骨肉瘤细胞系MG63的mRNA为模板，采用RT－PCR法得到人OPG／OCIF的编码区cDNA，构建真核表达载体并转染成肌细胞，应用核酸杂交及western blot法证实OPG／OCIF在真核细胞中表达。结果 获得人破骨细胞生成抑制因子（OPG／OCIF）编码区全长cDNA，经序列测定证实与文献报道的OPG／OCIF编码区基因的核苷酸序列完全一致。成功构建OPG／OCIF真核表达载体pcDNA3-OPG。重组质粒转染小鼠成肌细胞C2C12，建立稳定转染OPG／OCIF编码区cDNA的细胞系，经核酸杂交及western blot法证实OPG／OCIF在真核细胞中表达。结论 获得人破骨细胞生成抑制因子（OPG／OCIF）编码区全长cDNA并证实在真垓细胞中表达，为OPG／OCIF进一步的功能研究奠定了基础。     

缺血性鼠脑中的IL-6基因表达

IL-6是一多效应的细胞因子,在宿主的防卫和急性炎症反应中起重要的作用[1]。它的表达异常和失调与多种疾病发病有关,如肿瘤、Alzheimer’s病、不同类型的脑损害。为探讨IL-6与缺血性脑损害的关系,我们用PT-PCR方法对缺血性鼠脑不同部位IL-6mRNA表达进行了研究,报道如下:1材料和方法1.1动物模型研制ICR小鼠18只,每组6只,雌雄各半,重45～50g。用线栓法研制成右侧大脑中动脉栓塞模型[2],即25%戊拉坦1000mg/kg,IP麻醉。手术显微镜下,颈部正中切开,分离右颈总动脉,用5～0号进口尼龙线约10～12mm长,头端涂用cilicon,插入颈内动脉抵大脑中…     

胎盘型谷胱甘肽转移酶基因在乳腺癌及腋窝淋巴结组织中的表达

目的：研究胎盘型谷胱甘肽转移酶（GST－π）在乳腺癌及其腋窝淋巴结组织中的表达情况与乳癌发生和临床耐药的相关性。方法：采用免疫组化及RT－PCR法分析临床乳癌标本及腋窝清扫淋巴结组织GST－π蛋白和mRNA的表达。结果：在正常乳腺组织,乳癌组织,HE阳性淋巴结,HE阴性淋巴结中GST－π蛋白阳性表达率分别为0,60％,77％,43％,GST－π mRNA阳性表达率分别为：0,88％,71％,39％,结论：在肿瘤启动和促进阶段GST－π表达增高,是一典型癌前病变标志酶,HE阴性淋巴结中出现GST－π阳性表达,提示预后不好,且在耐药反应性上 淋巴结灵敏性强于乳癌组织,GST－π基因表达的调控可能主要发生在RNA和（或）转录前水平。     

人肺癌组织中单羧酸转运泵基因mRNA表达的变化

本文应用RT－PCR方法扩增了人正常肺组织、肺癌组织中的MCT1、MCT2及β-actin基因mRNA,以人β-actin基因RT－PCR产物作为外参照,通过比较同一样本组中及样本组间MCT1、MCT2相对于β-actin的RT－PCR产物的光密度比值,来分析判断MCT1、MCT2mRNA表达的高低。结果显示,MCT1在人正常肺组织、肺癌组织中的mRNA表达均高于MCT2;MCT1、MCT2基因mRNA在人肺癌组织中的表达明显高于癌旁正常肺组织。推测MCT1可能在肿瘤组织细胞内的pH调节方面发挥重要作用。     

人胚胎型心肌肌钙蛋白T1基因的克隆及表达

目的 构建人胚胎型心肌肌钙蛋白Ｔ１（ｃＴｎＴ１）中表达载体。方法 应用ＰＴ－ＰＣＲ技术，从人胚胎心肌组织中扩增ｃＴｎＴ１基因，连接ｐＥｘＳｅｃＩ高效表达载体进行诱导表达。结果 成功地扩增出ｃＴｎＴ１基因片段（７６４ ｂｐ）并测序证实；构建了表达载体ｐＥｘＳｃｅＩ－ｃＴｎＴ１，并获得表达。结论 获得单一亚型ｃＴｎＴ１的表达，为研究心力衰竭时的胚胎型基因重构与发病机制的关系打下了基础。     

小鼠FasL基因的克隆和在软骨细胞中表达

目的：获得小鼠FasL(mFasL)的cDNA克隆，通过逆转录病毒表达系统pLNCX2在软骨细胞中进行表达，并分析其功能。方法：应用RT—PCR和T-A克隆技术，从激活的小鼠脾脏淋巴细胞总RNA中，扩增mFasL cDNA并克隆到T载体中，再亚克隆到pLNCX2中。转染软骨细胞后，以流式细胞仪检测mFasL蛋白的表达，以单向混合淋巴细胞反应鉴定其活性。结果：成功地克隆了0．855kb的mFasL cDNA，并经测序确证。通过pLNCX2转染软骨细胞，转染率为60．64％。流式细胞仪检测到FasL蛋白的表达，并能显著抑制同种异体的单向混合淋巴细胞反应，刺激指数下调到未转染软骨细胞的11．71％。结论：克隆到的mFasL基因，并能通过pLNCX2有效表达。表达产物具有显著抑制同种异体单向混合淋巴细胞反应的活性。     

免疫—PCR法检测儿童中生长激素水平

目的：建立超灵敏度的免疫－PCR法检测尿中生长激素的水平。方法：在经戊二醛处理的PCR管中完成双抗炎心酶免疫反应，通过PCR扩增加接在抗原－抗体复合物上的DNA分子，琼脂糖电泳及扫描判断结果。结果：处理后的PCR管完全能够进行免疫反应，其灵敏度可达0．1pg/ml左右。琼脂糖电泳及扫描结果表明，30例正常青春发育期前儿童与10例经常规生长激素激发试验诊断为生长激素缺乏（growth hormone-deficient,GHD）的儿童，12h夜尿生长激素（GH）水平有明显差异。结论：此法的敏感度比酶标法高10^3-10^4倍，适于儿童尿中微量GH水平的检测。