人骨肉瘤细胞特异性结合肽的筛选及验证

摘要：目的获得人骨肉瘤细胞MG63特异性结合肽,为骨肉瘤靶向治疗奠定基础。方法应用噬菌体展示技术,以人骨肉瘤细
胞作为靶细胞,293T细胞为差减细胞,筛选获得MG-63细胞特异性结合肽。酶联免疫法进行靶向性验证。应用荧光染色技术
初步探讨短肽细胞受体位置。制作人骨肉瘤模型,尾静脉注射目标噬菌体,免疫组化检测其靶向性。结果经过四轮一步有机
相离心分离方法,获得了与骨肉瘤细胞特异性结合的短肽,并测序获得其中出现次数最多的序列SLTNLSK,靶向验证结果显示
该短肽有较强的特异性。结论应用噬菌体展示技术,获得了与人骨肉瘤细胞特异性结合的短肽,序列为SLTNLSK,并验证了
其靶向性。可以作为骨肉瘤靶向治疗的导向性化合物。
     

骨肉瘤细胞特异性结合短肽的筛选

目的获得与骨肉瘤细胞株os-732特异结合的短肽,作为骨肉瘤靶向治疗的先导化合物。方法以骨肉瘤细胞os-732为靶细胞,成骨细胞为吸附细胞对噬菌体12肽库进行差减筛选,用细胞ELISA、免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果经三轮筛选,从随机挑选的20个噬菌体克隆中得到9个能特异性与骨肉瘤细胞os-732结合,而不与正常成骨细胞结合的阳性克隆。但其氨基酸序列无同源性。结论得到多个序列不同的特异性结合骨肉瘤的噬菌体克隆,提示骨肉瘤细胞表面结构复杂,具多个骨肉瘤抗原表位。本实验获得的短肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性,为针对不同位点的靶向药物设计提供了实验依据。     

骨肉瘤细胞特异性结合短肽的筛选

目的：获得与骨肉瘤细胞株os-732特异结合的短肽，作为骨肉瘤靶向治疗的先导化合物。方法：以骨肉瘤细胞os-732为靶细胞，成骨细胞为吸附细胞对噬菌体12肽库进行差减筛选，用细胞ELISA、免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果：经三轮筛选，从随机挑选的20个噬菌体克隆中得到9个特异性与骨肉瘤细胞os-732结合，而不与正常成骨细胞结合的阳性克隆。但其氨基酸序列无同源性。结论：得到多个序列不同的特异性结合骨肉瘤的噬菌体克隆，提示骨肉瘤细胞表面结构复杂，具多个骨肉瘤抗原表位。本实验获得的短肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性，为针对不同位点的靶向药物设计提供了实验依据。     

噬菌体展示肽库筛选大肠癌细胞特异性结合肽的实验研究

目的 筛选人源大肠癌LoVo细胞株特异结合的短肽,作为大肠癌靶向治疗的载体.方法 以大肠癌LoVo细胞株作为靶细胞,人正常结肠黏膜上皮细胞为吸附细胞对噬菌体展示环七肽库进行差减筛选,采用细胞ELISA与免疫荧光检测鉴定噬菌体阳性克隆并测序.结果 对噬菌体展示环七肽库进行3轮筛选后,从随机挑取的20个噬菌体克隆中获得5个能与大肠癌LoVo细胞特异结合,而不与人正常结肠黏膜上皮细胞结合的阳性克隆,其氨基酸序列含有保守序列RPMP.结论 利用噬菌体展示肽库技术,可以成功筛选到大肠癌细胞的特异性结合肽,可能成为大肠癌靶向治疗的载体.     

噬菌体随机肽库中B型钠尿肽结合肽的筛选及鉴定

目的 利用噬菌体随机肽库筛选特异性靶向人肝癌细胞的短肽,为肝癌的靶向治疗提供理论依据.方法 以人肝癌细胞HepG2为靶细胞,对噬菌体随机十二肽库进行3轮筛选.建立Hep62荷瘤裸鼠实验动物模型,并在裸鼠体内对经过体外3轮筛选的肽库再进行1轮筛选.随机挑取30个阳性噬菌体克隆进行序列测定及同源性分析.通过免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色鉴定噬菌体展示肽的特异性.结果 经过3轮体外筛选和1轮动物体内筛选.噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集,随机挑选克隆测序结果表明十二肽VRKRSECLGAHD出现次数最多,免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色进一步证明该噬菌体能特异结合于肝癌细胞.结论 筛选得到的短肽能够特异性与肝癌细胞结合,为进一步研制用于治疗肝癌的高靶向性药物奠定实验基础.     

噬菌体随机肽库筛选肝癌细胞特异性结合肽的实验研究

目的 利用噬菌体随机肽库筛选特异性靶向人肝癌细胞的短肽,为肝癌的靶向治疗提供理论依据.方法 以人肝癌细胞HepG2为靶细胞,对噬菌体随机十二肽库进行3轮筛选.建立Hep62荷瘤裸鼠实验动物模型,并在裸鼠体内对经过体外3轮筛选的肽库再进行1轮筛选.随机挑取30个阳性噬菌体克隆进行序列测定及同源性分析.通过免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色鉴定噬菌体展示肽的特异性.结果 经过3轮体外筛选和1轮动物体内筛选.噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集,随机挑选克隆测序结果表明十二肽VRKRSECLGAHD出现次数最多,免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色进一步证明该噬菌体能特异结合于肝癌细胞.结论 筛选得到的短肽能够特异性与肝癌细胞结合,为进一步研制用于治疗肝癌的高靶向性药物奠定实验基础.     

噬菌体随机肽库对肝癌细胞特异性结合短肽的筛选及鉴定

目的:通过噬菌体随机肽库,筛选人肝癌细胞结合短肽,并对其与肝癌细胞的特异结合能力进行生物学鉴定.方法:以L-02为阴性消减细胞,HepG2为靶细胞,对噬菌体随机七肽库进行4轮消减筛选.并随机挑取26个阳性噬菌体克隆进行序列测定及同源性分析.以ELISA法鉴定噬菌体与HepG2细胞的结合活性.通过免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色鉴定H3噬菌体克隆与肝癌细胞结合的特异性.人工合成短肽HBP3,利用免疫荧光技术观察其与肝癌细胞的结合特异性.结果:4轮筛选使噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集.所挑取的26个阳性噬菌斑,经测序得到各噬菌体单克隆的多肽插入序列,最终产生5条氨基酸序列.经BLAST分析发现,在蛋白质数据库中未发现与这些短肽序列具有较好同源性的蛋白质分子.ELISA分析鉴定显示,5个阳性克隆在HepG2和L-02细胞上有差异性结合,其中H3噬菌体克隆对两种细胞的结合差异性最大.免疫细胞化学染色及免疫组织化学染色均显示,H3噬菌体克隆对肝癌细胞的结合靶向性明显高于对照细胞.免疫荧光显色证实,FITC-HBP3能特异性地结合于肝癌细胞的胞膜及核周胞质.结论:H3噬菌体克隆所呈现的七肽HBP3能与靶细胞高亲合性结合,为进一步研制用于治疗肝癌的高靶向性药物奠定实验基础.     

卵巢癌细胞表面特异性结合肽的筛选及鉴定

目的利用噬菌体展示技术筛选卵巢癌细胞HO-8910表面特异性结合肽。方法利用噬菌体展示技术筛选卵巢癌细胞株HO-8910,经过3轮生物淘洗,随机挑选21个噬菌体单克隆进行ELISA试验,挑选亲和力高的17个噬菌体进行DNA序列测定,随后利用噬菌体结合实验、免疫细胞染色、免疫荧光染色、竞争抑制等实验鉴定阳性噬菌体的特异性。结果展示短肽MRMTIIN的噬菌体克隆对HO-8910细胞株有较高的亲和力和特异性。结论噬菌体展示技术筛选的短肽MRMTIIN可为上皮性卵巢癌的早期诊断提供新的思路。     

应用激光显微分离技术在骨肉瘤组织原位筛选噬菌体肽库

目的将激光显微分离(laser capture microdissection, LCM) 技术应用于噬菌体表面呈现肽库的筛选过程,建立一种可以直接在天然组织中筛选肽库的方法。方法将新鲜人骨肉瘤组织块在噬菌体肽库溶液振荡孵育后制成组织冰冻切片,免疫组化染色检测噬菌体在组织中的浸润扩散。改进常规LCM切片处理方法,以冻干法替代酒精/二甲苯法脱水,以期在LCM操作过程中提高切片上噬菌体的存活率。LCM法分离摄取骨肉瘤切片上的肿瘤靶细胞,转染回收这些细胞上特异结合的噬菌体。滴定法检测所筛选的噬菌体对特异性细胞的亲和力。结果利用LCM技术,可以由肿瘤冰冻切片上收集到足够的与特异性噬菌体短肽,应用于噬菌体表面呈现肽库筛选。经过3轮筛选后所获得的噬菌体与人骨肉瘤组织的特异性亲和力提高16倍。结论本研究首次将LCM技术应用于噬菌体表面呈现肽库的筛选,可以使我们直接在新鲜人肿瘤组织中筛选与特定细胞群甚至单个细胞亲合的短肽;同时又避免了天然组织中其他杂质细胞的污染,为研制细胞特异性导向载体提供了一个新的途径。     

应用激光显微分离技术在骨肉瘤组织原位筛选噬菌体肽库

目的：将激光显微分离（laser capture microdissection，LCM）技术应用于噬菌体表面呈现肽库的筛选过程，建立一种可以直接在天然组织中筛选肽库的方法。方法：将新鲜人骨肉瘤组织块在噬菌体肽库溶液振荡孵育后制成组织冰冻切片，免疫组化染色检测噬菌体在组织中的浸润扩散。改进常规LCM切片处理方法，以冻干法替代酒精/二甲苯法脱水，以期在LCM操作过程中提高切片上噬菌体的存活率。LCM法分离摄取骨肉瘤切片上的肿瘤靶细胞，转染回收这些细胞上特异结合的噬菌体。滴定法检测所筛选的噬菌体对特异性细胞的亲和力。结果：利用LCM技术，可以由肿瘤冰冻切片上收集到足够的与特异性噬菌体短肽，应用于噬菌体表面呈现肽库筛选。经过3轮筛选后所获得的噬菌体与人骨肉瘤组织的特异性亲和力提高16倍。结论：本研究首次将LCM技术应用于噬菌体表面呈现肽库的筛选，可以使我们直接在新鲜人肿瘤组织中筛选与特定细胞群甚至单个细胞亲合的短肽；同时又避免了天然组织中其他杂质细胞的污染，为研制细胞特异性导向载体提供了一个新的途径。     

从噬菌体展示肽库中筛选 PreS1抗原的结合肽

目的:从噬菌体随机七肽库中筛选能与PreS1抗原特异性结合的多肽。方法:利用噬菌体展示技术,以PreS1抗原为靶分子,从随机七肽库中进行生物亲和筛选,ELISA鉴定阳性克隆。结果:对肽库进行3 轮筛选后,通过ELISA和竞争抑制ELISA,获得了特异性的结合肽,测序结果显示噬菌体上的短肽有共同序列。结论:利用噬菌体展示技术成功筛选到了PreS1抗原的结合肽,为乙肝的治疗和诊断探索新的途径。     

靶向肿瘤干细胞标记CD133特异性结合肽的筛选和初步鉴定

摘要：目的筛选可与人肿瘤干细胞表面标记物CD133特异性结合的短肽并进行初步鉴定。方法首先合成人肿瘤干细胞
表面标记物CD133 细胞外片段的生物素化蛋白,以此为靶,利用噬菌体肽库技术,高通量液相淘选CD133 的特异性短
肽。应用夹心EL ISA选择出结合较强的克隆。提取DNA测序,通过竞争性阻断实验验证其特异性,根据噬菌体基因序
列推导出多肽序列。通过免疫荧光技术初步验证合成多肽和人大肠癌细胞的结合情况。结果4 轮液相筛选后,与
CD133特异性结合的噬菌体得到有效富集,第4轮与第1轮相比,富集了388倍。经ELISA 鉴定的20个噬菌体单克隆中,
有13个与CD133有较高亲和力,具有阳性意义。经比对得到11条完全一致的氨基酸序列TISWPPR,2条完全一致的氨
基酸序列STTKLAL,竞争性阻断ELISA实验表明第一条特异性较强。结论成功利用噬菌体肽库技术,淘选出1条可和
人CD133特异性结合的高亲和力短肽,为后续CD133的研究奠定了基础,表明从噬菌体肽库中液相淘选生物素化小分子
的高亲和力多肽的方法切实可行。     

应用噬菌体随机十二肽库筛选hFGF 7相关模拟肽

目的应用噬菌体随机十二肽库生物淘选具有刺激表皮细胞增殖作用的人成纤维细胞生长因子 7(hFGF 7)噬菌体模拟肽。方法以hFGF 7单克隆抗体为靶,进行4轮生物淘选噬菌体随机十二肽库;随机挑取单克隆噬菌体,应用ELISA方法检测单克隆噬菌体的结合力,对结合力较好的单克隆噬菌体提取噬菌体DNA,进行测序,并行序列分析。结果经过4轮生物淘选,特异性噬菌体模拟肽获得了富集,ELISA检测结果显示获得的一些噬菌体模拟肽具有较好的结合力,测序获得11个与促进细胞分裂、增殖或抑制细胞增殖有关的碱基序列。结论从噬菌体随机十二肽库中可淘选到与hFGF 7相关的噬菌体模拟肽,其中部分噬菌体模拟肽可能会促进表皮细胞增殖,期望将来可应用于促进创面愈合。     

噬菌体肽库在筛选及鉴定高转移性肝癌特异性结合肽中的应用及其意义

目的：探讨噬菌体环七肽库在筛选与肝癌高转移细胞株HCCLM3特异高效结合的短肽中的应用,为进一步探索肝癌转移的分子机制和寻找肝癌转移标志物奠定基础。方法：以人肝癌高转移细胞株HCCLM3为靶细胞、人肝癌低转移细胞株SMMC7721为吸附细胞对噬菌体环七肽库进行4轮差减筛选,采用ELISA方法进一步筛选出与HCCLM3细胞高度亲和的阳性克隆（即实验组A450nm值高于对照组3倍以上）,并利用免疫细胞化学方法鉴定噬菌体阳性克隆的特异性并测序。结果：经过4轮陶筛后,噬菌体在筛选靶细胞上出现明显富集,且逐轮提高（P<0.05）;利用ELISA法对筛选后随机挑取的20个噬菌体克隆进行初步鉴定,得到6个能与肝癌细胞HCCLM3亲和度较高的阳性克隆（C4、C6、C7、C10、C11和C17）;通过免疫细胞化学染色鉴定阳性克隆靶向肝癌细胞HCCLM3的特异性,与对照组比较,C7噬菌体对高转移潜能肿瘤细胞具有较高特异性（P<0.05）;测序显示6个阳性克隆氨基酸序列无同源性。结论：利用噬菌体环七肽库筛选得到与人肝癌高转移细胞株HCCLM3具有较高亲和力的多肽。     

靶向趋化因子受体5短肽的筛选及活性初步分析

目的筛选人趋化因子受体5(CCR5)的亲和短肽。方法采用噬菌体十二肽库对稳定表达CCR5的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(CHO/CCR5)进行筛选,得到30个阳性克隆,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)分析,发现其中17个克隆含有AFDWTFVPSLIL基序。结果含有该序列的噬菌体和合成肽AFDWTFVPSLIL能阻止单克隆抗体2D7与CHO/CCR5细胞的结合;并能竞争性地抑制RANTES对CHO/CCR5细胞的结合。结论小分子肽AFDWTFVPSLIL能特异性地结合CCR5,并有可能成为CCR5的拮抗剂。     

肺癌血清中特异性结合多肽的筛选

目的以肺癌血清从噬菌体展示肽库中筛选出能够用于血清学筛查和肺癌病理分型的多肽。方法利用M13噬菌体随机12肽展示肽库对24例临床确诊肺癌患者的血清和24例体检者的血清进行4轮吸附-洗脱的筛选。挑取筛选后的噬菌体单克隆,皆以血清和细胞株进行试验,选出特异性及确诊率较高的单克隆。目标单克隆通过DNA测序确定其所表达的多肽序列,进而人工合成带FITC标记的多肽,以肺癌细胞、正常肺细胞和肺癌组织切片进行荧光成像检测。结果随机挑取30个经过4轮筛选的噬菌体单克隆,通过血清和细胞株的试验,筛选出6个特异性和确诊率较高的单克隆,其中单克隆ZZ-8肺癌血清确诊率达到41.6%,且鳞癌的比例较高。ZZ-8经DNA测序分析,确定其表达的多肽序列为:APTPSTQMNLLP。FITC标记的多肽在细胞和组织切片的荧光成像检测中,均显示良好的特异性。结论人工合成的多肽ZZ-8能够为研发肺癌诊断试剂奠定基础。     

Application of laser capture microdissection in screening phage-display peptide library from osteosarcoma tissues]

OBJECTIVE: To establish a novel approach by using laser capture microdissection (LCM) for phage-display peptide library screening and direct recovery of the peptides specifically bound to the cells from fresh human tissue. METHODS: Fresh human osteosarcoma (OS) tissue specimens obtained from biopsy were incubated in phage peptide library solution, followed by shaking at 4 degrees celsius and subsequent preparation of frozen sections. Immunohistochemistry was employed to examine the infiltration of the phage in the tissues. After modification to improve the viability of the phage during the operation, LCM was used to isolate the targeted tumor cells that specifically bound the phage peptides. The phage was then recovered by transfecting the host bacteria, and the specificity of the selected phage was assessed by calculating the recovered phage transfection unit on different tissue sections. RESULTS: Enough phages that specifically bound to tumor cells were recovered from the sections. After three rounds of screening, the eluted phage showed up to 16-fold selectivity for OS tissue. CONCLUSION: Application of LCM makes it possible to screen phage display peptide library directly from fresh human tissue. Specific cell-binding peptides can be selected directly from fresh human tumor cells in their native tissue environment at the single cell level.     

噬菌体肽库在筛选及鉴定高转移性肝癌特异性结合肽中的应用及其意义

目的:探讨噬菌体环七肽库在筛选与肝癌高转移细胞株HCCLM3特异高效结合的短肽中的应用,为进一步探索肝癌转移的分子机制和寻找肝癌转移标志物奠定基础。方法:以人肝癌高转移细胞株HCCLM3为靶细胞、人肝癌低转移细胞株SMMC7721为吸附细胞对噬菌体环七肽库进行4轮差减筛选,采用ELISA方法进一步筛选出与HCCLM3细胞高度亲和的阳性克隆(即实验组A450nm值高于对照组3倍以上),并利用免疫细胞化学方法鉴定噬菌体阳性克隆的特异性并测序。结果:经过4轮陶筛后,噬菌体在筛选靶细胞上出现明显富集,且逐轮提高(P<0.05);利用ELISA法对筛选后随机挑取的20个噬菌体克隆进行初步鉴定,得到6个能与肝癌细胞HCCLM3亲和度较高的阳性克隆(C4、C6、C7、C10、C11和C17);通过免疫细胞化学染色鉴定阳性克隆靶向肝癌细胞HCCLM3的特异性,与对照组比较,C7噬菌体对高转移潜能肿瘤细胞具有较高特异性(P<0.05);测序显示6个阳性克隆氨基酸序列无同源性。结论:利用噬菌体环七肽库筛选得到与人肝癌高转移细胞株HCCLM3具有较高亲和力的多肽。