西尼罗河病毒前膜蛋白- E蛋白结构域Ⅲ融合蛋白特异性单克隆抗体的制备以及应用分析

制备了针对西尼罗河病毒preM/EⅢ融合蛋白特异性单克隆抗体,并分析了其在临床检测中的应用价值。方法 采用原核表达系统表达西尼罗河病毒preM/E融合蛋白,作为抗原,免疫BALB/c小鼠,按常规单克隆抗体技术将免疫后小鼠脾细胞与SP2/0 细胞融合,采用有限稀释法筛选能稳定分泌抗preM/EⅢ单抗的杂交瘤细胞株。接种杂交瘤细胞于小鼠腹腔,抽取腹水纯化单克隆抗体。采用间接ELISA和Western blot对抗体特异性和效价进行分析,并对临床样本进行检测。结果 获得了1株能稳定分泌preM/EⅢ蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为ME1。纯化后抗体效价为10-6,其亚类为IgG1。ME1单抗均能与西尼罗病毒preM/EⅢ蛋白以及西尼罗病毒发生特异性反应,而与日本脑炎病毒(JEV)、圣路易斯脑炎病毒(SLEV)、黄热病毒(YFV)和登革热病毒(DENV)无交叉反应。临床诊断准确率为97.78%。结论 ME1单克隆抗体具有较高的特异性,临床诊断准确性较高,具有临床应用价值。     

西尼罗河病毒遗传学易感性的确定

西尼罗河病毒的神秘之处就在于因它所产生的严重症状只在相对较小比例的人群(即被感染人群)中出现,也就是说,仅有20％的患者可出现发热症状。目前,法国一个研究小组提出可利用遗传学特性来确定西尼罗河病毒的易感性。     

警惕西尼罗河病毒的蔓延

西尼罗河病毒(West Nile virus,WNV)为单链RNA病毒,属虫媒病毒黄病毒科的黄病毒,1937年因首次在非洲乌干达的西尼罗河地区被发现而得名。鸟类、马、蚊子均可受到WNV感染,鸟类与蚊子是WNV的主要宿主。     

基因免疫制备抗SARS病毒N蛋白单克隆抗体

目的通过基因免疫方法,制备抗SAILS病毒N蛋白的单克隆抗体并对单抗进行初步鉴定。方法将含有N蛋白的编码基因的真核重组质粒pSecTagB／N免疫BALB／c小鼠,然后取鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,用原核表达的SARS病毒N蛋白筛选阳性克隆。然后通过免疫印迹法进一步证明抗体对N蛋白的特异性,用ELISA方法检测抗体对灭活SARS全病毒的免疫反应。结果筛选得到10株抗N蛋白的单克隆抗体,ELISA和免疫印迹结果表明这些抗体特异性针对N蛋白上的抗原决定簇,且有7株抗体对SARS灭活病毒有阳性反应。结论所得的单克隆抗体特异针对N蛋白。     

人乳头瘤病毒16型E7蛋白单克隆抗体的研制

目的 为研究HPV16 E7蛋白在肿瘤早期预报中的作用及研制治疗性疫苗,特制备HPV16 E7的单克隆抗体.方法 将构建成的PGEX4T-1-HPV16 E7的质粒转化BL21细菌,在IPTG诱导下,稳定表达GST-HPV16E7融合蛋白,免疫Balb/c小鼠,收集免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,用ELISA双筛,直至检测所有孔均为E7阳性而GST阴性为止,扩大培养、建株、冻存并制备腹水、单克隆抗体.结果 成功制备出HPV16 E7的单克隆抗体,可在多种肿瘤组织细胞核中染色.结论 该抗体是HPV16 E7蛋白特异性的McAb.     

DEN2重组E蛋白单克隆抗体的制备及其生物学活性

[目的]研制登革病毒E蛋白特异性单克隆抗体,鉴定其各种生物学特性.[方法]用纯化的Pichia pastoris酵母表达的DEN2重组E蛋白作为抗原,免疫Balb/c小鼠,采用传统的细胞融合、有限稀释法克隆化杂交瘤细胞,制备稳定分泌McAbs的细胞株.采用硫酸铵沉淀法纯化腹水中的McAbs,用ELISA、IFA、Western Blot和空斑减数中和实验等鉴定McAbs的各种生物学活性.[结果]用ELISA、IFA检测证实5株杂交瘤细胞产生的McAbs与DEN2重组E蛋白和DEN全病毒均有较高的亲和力;Western Blot分析发现其中3株杂交瘤细胞(3G3,6G11,4E3)分泌的McAbs能与其相对分子质量Mr=(66～69)×103的DEN2重组E蛋白结合.空斑减数中和实验证实所获得的单克隆抗体具有中和登革病毒感染C6/36细胞的作用.[结论]成功地制备了5株抗登革病毒E蛋白特异性的McAbs,为进一步研究E蛋白的结构和功能及临床诊断试剂盒研发打下了基础.     

丙型肝炎病毒E2蛋白的高效表达及其临床应用

目的：在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃｖｉｒｕｓ,ＨＣＶ）Ｅ２ 包膜蛋白,并对其进行初步纯化。用纯化的包膜蛋白检测ＨＣＶＲＮＡ 阳性血清中Ｅ２ 抗体,研究其检测Ｅ２ 抗体的敏感性和特异性。方法：将ＨＣＶＥ２ 蛋白基因克隆到原核表达载体中,并转化大肠杆菌。用ＩＰＴＧ 诱导细菌表达Ｅ２ 蛋白,经离子交换层析纯化蛋白。用纯化的包膜蛋白包被微孔板,经ＥＬＩＳＡ方法检测ＨＣＶＲＮＡ阳性血清中的Ｅ２ 抗体。结果：在大肠杆菌表达了相对分子质量为４５ ０００ 的可溶性Ｅ２ 蛋白,占细菌总蛋白量的２１％ ,纯化后,蛋白纯度为８５％ 。用其检测ＨＣＶ 患者血清１７１ 例,Ｅ２ 抗体的检出率为６３％ 。在Ｅ２ 抗体阳性的血清中,部分为抗ＨＣＶ 阴性。结论：Ｅ２ 蛋白的表达及初步纯化的成功,可能用于临床检测。各基因型ＨＣＶＥ２ 包膜蛋白的抗体之间有交叉反应,在目前的抗ＨＣＶ 诊断试剂中加入可溶性、非融合Ｅ２ 包膜蛋白,可以改善抗ＨＣＶ 诊断试剂的特异性和敏感性。     

EB病毒GST-Rta150融合蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备EB病毒GST—Rta150融合蛋白的单克隆抗体并鉴定其特性．方法取经GST-Rta150融合蛋白免疫小鼠的脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞常规融合,依次进行阳性杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆,接种杂交瘤细胞至小鼠腹腔,收集腹水并纯化。制备的单克隆抗体以琼脂双向扩散法鉴定抗体类及亚类．间接ELISA法测定抗体的效价,Western-blot检测抗体的特异性。结果获得一株稳定分泌抗GST-Rta150融合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A9,细胞培养上清效价为10^-3,腹水效价为10^-5,纯化的抗体效价为10^-6．经鉴定GST-Rta150融合蛋白单克隆抗体的亚类为IgGl。Western-blot结果显示此单克隆抗体能特异结合GST-Rta150融合蛋白．将杂交瘤细胞株在液氮中冻存3个月后复苏,其分泌的单克隆抗体效价不变。结论通过上述方法制备出来的单克隆抗体特异性强,稳定性好,为研究EB病毒立即早期基因产物Rta蛋白以及EB病毒相关疾病的诊断和治疗奠定了基础。     

人血管生成素相关蛋白2单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备人血管生成素相关蛋白2(angiopoietin-related protein 2,ARP2)的单克隆抗体.方法:用RT-PCR方法获取人脾脏组织ARP2基因序列,构建pET32a-ARP2,经电穿孔导入大肠杆菌诱导表达,获得可溶蛋白样品和包涵体蛋白样品,回收、纯化蛋白,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术建立产生ARP2抗杂交瘤细胞株,Western印迹鉴定.结果:获得融合蛋白的相对分子质量为570 000,与理论计算值相符,纯化后蛋白浓度＞90%,杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1:104,腹水抗体效价为1:107～1:108,抗体亚型为IgG2a类,Western印迹示目的蛋白相对分子质量为570 000,免疫组化显示该抗体能特异结合人ARP2.结论:制备的抗ARP2单克隆抗体可用于ARP2蛋白鉴定.     

分泌抗B型流感病毒抗体杂交瘤细胞的制备及鉴定

目的 制备抗B型流感病毒的单克隆抗体，用以建立特异、灵敏、简便的B型流感金标试纸检测方法。方法 将B型流感病毒为完全抗原免疫BALB/c小鼠，得到的脾细胞与SP2／0细胞融合，获得稳定分泌抗流感B单抗的杂交瘤细胞株，对抗体进行鉴定。结果 用杂交瘤技术，得到了3株可稳定分泌抗流感B单抗的杂交瘤细胞株，能分泌高滴度的针对B型流感病毒的特异单抗。结论 所获抗B型流感病毒杂交瘤细胞株单克隆抗体，为金标法快速诊断B型流感感染奠定了基础。     

重组人内抑素单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗重组人内抑素(ES)单克隆抗体(McAb)并进行鉴定。方法利用重组人ES为抗原,免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤技术将免疫小鼠的脾细胞与同源小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,间接ELISA法对细胞培养上清进行筛检,对能稳定分泌抗重组人ES的细胞株,进行扩大培养。体内诱生法制备腹水并对其初步鉴定。结果获得3B4、1D10、1G5、2D10,4株能稳定分泌抗重组人ESMcAb的杂交瘤细胞株,并对3B4和1D10两株给予鉴定,其免疫亚型为IgG2a、IgG3。腹水ELISA效价为10-6、10-5。通过蛋白免疫印迹法和免疫组化证明抗体有特异性和敏感性。结论成功制备分泌抗重组人ES的杂交瘤细胞株,为研究人ES的表达及相关领域奠定了基础。     

抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的制备及其鉴定

目的制备抗呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）的单克隆抗体，并对其特性进行系统地鉴定。方法以活的ＲＳＶＬｏｎｇ株滴鼻（ＴＣＩＤ５０为１×１０－６，取１００ＴＣＩＤ５００１２５ｍｌ进行）加ＲＳＶ感染Ｈｅｐ２细胞（ＣＰＥ达～）腹腔注射免疫Ｂａｌｂ／ｃ鼠，用细胞融合技术制备能稳定分泌抗ＲＳＶ的单克隆抗体细胞株。结果细胞融合一次成功，融合率为９６％，抗ＲＳＶ抗体阳性孔率为６５％。鉴定１株杂交瘤细胞Ｆ３株，染色体数为９８条，抗体亚类属ＩｇＧ１，对ＲＳＶ抗原特异；在无补体存在的情况下其腹水抗体中和效价为１∶１２８，且具融合抑制活性，腹水融合抑制效价为１∶６４。结论Ｆ３株单克隆抗体为抗ＲＳＶＦ蛋白的ＭｃＡｂ。     

抗ANXA2单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备ANXA2特异性单克隆抗体(McAb),为研究ANXA2的生物学功能和检测该蛋白提供有力的抗体工具。方法用经IPTG诱导表达的基因重组PGEX-4T-1-ANXA2抗原免疫BALB/c小鼠,利用常规杂交瘤技术和间接ELISA法筛选抗ANXA2杂交瘤细胞,用ELISA法鉴定所得单抗腹水的效价及Western blot鉴定McAb特异性。单抗纯化和Eu3+标记后,分别包被聚苯乙烯板及作为铕标单抗,利用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)筛选出检测ANXA2蛋白的最佳配伍单抗。结果经细胞融合、筛选、克隆化,获得了16株可分泌高效价单抗的杂交瘤细胞,间接ELISA显示16株McAb与空载体PGEX-4T-1均未发生交叉反应,抗体特异性良好,16株抗体腹水效价为1∶8 000~1∶256 000,培养上清效价为1∶256~1∶512,纯化的腹水单抗经配对试验,2D6和9H9-Eu3+配对最佳。结论获得16株能稳定分泌高特异性抗ANXA2的杂交瘤细胞,能用于后续研究。     

人巨细胞病毒单克隆抗体的制备及其体外中和活性鉴定

目的制备具有中和人巨细胞病毒(HCMV)感染作用的单克隆抗体并对其进行生物学活性鉴定.方法用HCMV抗原免疫Balb/c小鼠5、6次后,取致敏的脾脏B淋巴细胞和HGPRT-SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合,在HAT选择培养基中培养2周,间接ELISA法筛选克隆.挑取分泌抗体的杂交瘤株,再用间接ELISA进行鉴定,最终获得抗HCMV的阳性杂交瘤细胞株,用Ouchterlony法鉴定McAb的亚类.小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞,取腹水经盐析法提纯IgG.Lowry法测定蛋白质浓度,在第6代HF细胞株及原代培养新生乳鼠脑神经细胞上进行微量中和实验.结果获得了4株杂交瘤细胞株,制备的F9McAbs盐析后蛋白质浓度为11.2 g/L,血清学试验证明该McAbs能和HCMV抗原进行特异性结合,制备的IgG具有高度特异性.且体外实验已证实,该McAb具有中和抗体的性质.结论通过杂交瘤技术制备的HCMV单克隆抗体能在体外中和HCMV致病变效应,为该McAb作为抗人巨细胞病毒治疗药物的研发奠定了基础.     

抗人肺表面活性物质相关蛋白A单克隆抗体的制备及其特性的鉴定

目的制备抗人肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)单克隆抗体并对其特性进行鉴定。方法以自行制备的SP-A蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠,建立分泌抗人SP-A单抗的杂交瘤细胞株,诱发小鼠产生单抗腹水,用(NH4)2SO4盐析纯化腹水,用间接ELISA法测定单抗效价,用Western blotting测定抗体特异性。结果建立了3株能持续分泌抗SP-A单抗的杂交瘤细胞株,其中2B6杂交瘤细胞株抗体效价最高,其染色体数目均大于100条。间接ELISA法测定腹水和细胞培养上清效价,分别为1∶50 000和1∶10 000。用Western blotting在SP-A蛋白泳道上相对分子质量31 000左右位置出现明显的一条染色条带。结论自行制备的抗人SP-A单抗,其具有特异性强、效价高的特点。     

Ⅰ型登革病毒NS1蛋白特异性血清型单克隆抗体的制备及鉴定

目的研制Ⅰ型登革病毒(DEN1)非结构蛋白1(NS1)蛋白特异性单克隆抗体,鉴定其特异性。方法以具有良好免疫原性的DEN1重组NS1蛋白、DEN1全病毒及两者混合免疫共3种免疫方案,分别免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,杂交瘤细胞经间接ELISA法双筛I、FA和Western Blot进行mAbs的类型及亚类、特异性等鉴定。结果采用3种免疫方案免疫Balb/c小鼠,获得9株抗NS1蛋白的mAb,其亚类测定一株为IgG2a,另外8株为IgG1。这些mAbs与DEN1重组NS1蛋白和DEN1全病毒均结合,而且特异性好,仅1株杂交瘤分泌的单抗和其余3型DEN有交叉反应。结论成功获得了特异性针对DEN病毒NS1蛋白的特异性血清型mAb,将为进一步研究NS1蛋白的结构和功能及临床诊断试剂研发奠定基础。     

晚期氧化蛋白产物抗体的制备和鉴定

目的 制备和鉴定抗人晚期氧化蛋白产物(AOPPs)单克隆抗体(McAb).方法 用次氯酸(HOCl)和纯化的人血白蛋白(HSA)孵育获得AOPPs-HSA,取凝胶层析纯化后的第1峰免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗AOPPs-HSA的McAb,用间接ELISA、Western blot鉴定其特异性及亚类.结果 成功筛选出3株稳定分泌抗AOPPs,1株既抗HSA又抗AOPP的McAb杂交瘤细胞株,其分泌抗体亚类3株为IgGl,1株为IgG2b,间接ELISA和Western blot证明制备的抗体可以特异地和天然或体外制备的AOPPs结合.结论 获得抗人AOPPs-HSA的McAb细胞株4株,为进一步研究AOPPs生物学活性及其相关疾病的诊断和预后奠定基础.     

Ⅲ型登革病毒NS1单克隆抗体的制备及鉴定

目的 研制Ⅲ型登革病毒(DV3)非结构蛋白1(NS1)单克隆抗体,鉴定其血清型特异性.方法 以具有良好抗原性的重组DV3-NS1蛋白与DV3交替免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选阳性的杂交瘤细胞,并结合免疫荧光(IFA)和Weatern Blot对抗体的特异性进行鉴定.结果 经交替免疫法免疫Balb/c小鼠,共获得14株抗DV3-NS1单抗,其亚类测定1株为IgG2a,余为lgG1.其中3株特异性结合DV3及DV3-NS1蛋白,4株能同时结合4型登革病毒NS1蛋白,其余7株与其他3型登革病毒NS1蛋白存在交叉反应.结论 成功获得了针对DV3-NS1的特异性单抗及交叉性单抗,将为进一步研究登革病毒NS1蛋白的结构与功能及临床诊断试剂的研发奠定基础.