碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌外排泵表达研究

目的了解临床分离的碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌多药外排泵及膜孔蛋白表达情况。方法用SYBR Green I实时定量RT-PCR法检测多药外排泵MexAB-OprM，MexCD-OprJ，MexEF-OprN，MexXY-OprM及膜孔蛋白O-prD的mRNA表达水平。结果在40株碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌中，13株有耐药泵基因表达异常；12株oprD表达异常。结论外排泵和膜孔蛋白的表达异常是钢绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药的重要原因，探索耐药机制对新药研制及控制医院内感染的播散是十分重要的。     

碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌外膜孔蛋白OprD2的研究

目的 研究铜绿假单胞菌外膜孔蛋白OprD2与碳青霉烯类抗生素耐药的关系.方法 琼脂稀释法测定14种抗菌药物对铜绿假单胞菌的MIC.PCR扩增oprD2编码基因并进行序列分析.十二烷基磺酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌外膜蛋白OprD2的变化,比较敏感株和耐药株外膜蛋白的差异,统计分析采用均数t检验.结果 141株耐碳青霉烯类抗生素铜绿假单胞菌对亚胺培南和美罗培南药敏试验结果显示具3种模式,以亚胺培南和美罗培南同时耐药(IMPRMEMR)为主,占66.7%;亚胺培南耐药和美罗培南敏感(IMPRMEMS)占32.6%;亚胺培南敏感和美罗培南耐药(IMPSMEMR)仅占0.7%.PCR扩增141株耐药株oprD2编码基因结果136株耐药株oprD2编码基因发生显著变异,变异位点呈现多样性.其中34株细菌的oprD2编码基因存在大片段缺失,6株的oprD2编码基因中有插入片段,96株有小片段缺失或不同位置的多个点突变.另4株产金属酶菌株及1株亚胺培南敏感(美罗培南耐药)株的oprD2编码基因未发现异常.对其中16株碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌进行SDS-PAGE分析,结果显示10株IPMRMEMR和5株IPMRMEMS铜绿假单胞菌外膜蛋白均存在分子量46 000 u处的OprD2蛋白减少,而1株IMPSMEMR株OprD2蛋白带未见异常.结论 oprD2编码基因的缺失或突变可能是导致外膜蛋白OprD2缺失或减少的分子基础,并是铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素尤其是亚胺培南耐药的主要机制之一.     

碳青霉烯类抗生素诱导铜绿假单胞菌外膜蛋白及外排系统突变的机制研究

摘要：目的：探讨临床分离的因外膜蛋白突变导致的铜绿假单胞菌（Pa）碳青霉烯类耐药机制是否与药物诱导相关。 方法：在M-H平板上用亚胺培南（IPM）和美罗培南（MEM）药敏纸片分别诱导3株Pa（Pa标、Pa1和Pa2）。琼脂稀释法测定诱导前后Pa对IPM、MEM、头孢他啶和头孢吡肟4种药物的最低抑菌浓度（MIC）。改良三维试验检测诱导后产碳青霉烯酶变化。SDS-PAGE观察Pa外膜蛋白OprD的改变。PCR扩增oprD基因并进行序列分析。实时荧光定量PCR检测Pa外排系统表达情况。并对诱导耐药菌株进行稳定性分析。 结果：诱导第5天出现对IPM和MEM耐药（MIC≥8 μg/mL）,且MEM诱导株对2种药物敏感性降低速度明显快于IPM诱导株。诱导株未检出耐药酶,外膜蛋白OprD出现缺失或者减少。oprD基因测序发现Pa标(I)、Pa标(M)和Pa1（M）分别在831（TGG→TGA）、1 017（TGG→TGA）和1 014（TGG→TAG）有碱基突变产生终止密码子,Pa2（I）在1 206处有新的碱基插入导致移码突变。外排基因以MexA过度表达为主,同时伴有其他外排系统的过度表达。稳定性分析发现5株诱导株的耐药表型稳定,另1株外排系统表达量呈现持续升高,导致MIC值的右移。 结论：在碳青霉烯类药物环境中,外膜蛋白OprD表达减少和基因的突变以及外排系统的过度表达是引起诱导株对IPM和MEM耐药的主要原因。此型耐药株不仅耐药表型稳定,甚至可能由于某种机制导致脱离药物后MIC值仍持续升高。     

铜绿假单胞菌碳青霉烯耐药的机制研究

目的分析159株临床分离的非重复碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌对抗菌药物的耐药性,探究体外联合药敏试验对碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌表现不同作用的机制。方法收集来自不同患者的铜绿假单胞菌159株,亚胺培南及美罗培南耐药。采用三维水解试验检测β-内酰胺酶、聚合酶链式反应(PCR)等方法检测多重耐药菌可能存在的耐药机制。结果 159株临床分离的非重复碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌,通过三维实验检测,其中15株产MBL、13株产AmpC酶。体外联合药物敏感试验,加入MC-207,110后约38%的菌株对碳青霉烯类抗生素的MIC下降4个梯度。检测试验菌株,21株携带IMP基因,18株携带ampC基因;检测OprD2通道蛋白,159株中约有48%的菌株OprD2丢失。结论北京友谊医院碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因不是IMP、AmpC水解酶;碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药的重要原因可能是外排泵及外膜孔道蛋白。     

多重耐药铜绿假单胞菌外排泵基因表达与耐药表型和耐药程度的关系

目的建立实时荧光定量PCR法检测多重耐药铜绿假单胞菌(Pa)的外排泵基因表达量,探讨不同类型外排泵基因表达与耐药表型和耐药程度的关系。方法收集临床分离的多重耐药Pa共80株,分析其耐药表型;用实时荧光定量PCR检测不同类型外排泵基因的表达量,用外排泵抑制剂CCCP及PAβN进行外排泵基因筛查,并比较其结果。结果 64株(80%)检出了不同类型外排泵基因,包括单独表达MexA 30株(37.5%),MexC 12株(15.0%),MexX 8株(10.0%),同时表达MexA和MexC者10株(12.5%),同时表达MexA和MexX者4株(5.0%)。外排泵抑制剂筛查试验总阳性率分别为CCCP抑制法73.8%,PAβN抑制法72.5%。MexA的表达主要增强对美罗培南、三代头孢菌素、氟喹诺酮类、大环内酯类的耐药,且随表达量的增加而增强。MexC型主要增强对氨基糖苷类、氟喹诺酮类、三代头孢菌素、哌拉西林/他唑巴坦类的耐药性,且随表达量的增加而增强。MexX型外排泵的表达主要增强对氨基糖苷类、大环内酯类、氟喹诺酮类和氨曲南的耐药性。MexA和MexC型同时表达与MexA型一致,并增强了对氟喹诺酮类的耐药。MexA和MexX型同时表达与MexA型一致,并增强了对庆大霉素的耐药而降低了对氟喹诺酮类的耐药性。结论 Pa的外排泵基因的表达量与特定种类的药物耐药程度有关,外排泵基因的高表达参与并加剧了Pa的耐药性。     

碳青霉烯耐药的铜绿假单胞菌的耐药性研究

目的分析159株临床分离的非重复碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌对抗菌药物的耐药性;为临床合理联合应用抗菌药物治疗碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌感染提供实验室证据。方法收集2010年5月至2011年5月,首都医科大学附属北京友谊医院临床检验中心细菌室分离的来自不同患者的铜绿假单胞菌159株。测定单药的最低抑菌浓度(MIC),测定联合用药的MIC,计算部分抑菌指数(FIC),判断药物组合的效应。结果 159株临床分离的非重复碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌,单药MIC显示铜绿假单胞菌对于美国临床实验室标准化委员会2010推荐和临床常用抗菌药物敏感率低,呈现多重耐药表型。不同药物组合对于碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌的作用也有很大差异。全部菌株在亚胺培南单药耐药的情况下,亚胺培南+妥布霉素表现出53.3%的相加作用,美罗培南+妥布霉素的相加作用与此类似,接近50%。结论碳青霉烯耐药的铜绿假单胞菌通常情况下也会对头孢菌素类、β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂、氨基糖甙类、氟喹诺酮类等产生多重耐药性。对于碳青霉烯耐药的铜绿假单胞菌,三代头孢菌素联合氨基糖甙类体外实验表现出较高比率的协同作用。     

铜绿假单胞菌药物外排泵研究进展

感染性疾病目前仍然是威胁全球人类健康的第二大杀手，发达国家的第三大杀手。欧美和中国的多项病原菌流行病学监测资料中，铜绿假单胞菌（P—seudomonas aeruginosa，PA）均高居榜首，尤其是获得性免疫缺陷综合征（AIDS）等严重免疫缺陷性患者，一旦感染PA往往是致命性的。此外，PA也是囊性纤维化患者最重要的死亡原因。资料表明，PA的耐药状况十分严重，美国1998～2002年间多重耐药PA增加了32％。铜绿假单胞菌常对多种常用抗生素耐药，所涉及耐药机制复杂，包括：外膜低渗透、抗生素修饰酶的生成（如β-内酰胺酶）、外膜孔蛋白缺失、生物膜形成、青霉素结合蛋白改变和主动外排泵系统。对PA耐药机制的研究有助于抗生素的合理应用。近年来多药外排泵被认为是导致PA多重耐药的重要原因。     

铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药表型与外排泵表达水平的关系

目的 了解铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,Pa)临床菌株外排泵抑制剂对碳青霉烯类抗生素活性的影响;探索铜绿假单胞菌对亚胺培南(IMP)和美罗培南(MEP)的耐药性与其外排泵表达水平关系.方法 对IMP耐药的Pa采用琼脂对倍稀释法进行外排泵抑制剂carbanyl cyanide m-chlorophenylhydrazone(CCCP,107株)与Pile-Arg-β-naphthylamide(PAβN,71株)的抑制试验,观察IMP和MEP的MIC变化;对32株对IMP和MEP不同耐药表型的Pa,采用实时荧光定量PCR法检测3种外排泵基因(mexA、mexD、mexF)的表达量.结果 联合外排泵抑制剂后,IMP、MEP耐药率与之前相比差异均无统计学意义,其中IMP联合CCCP、PApN前后耐药率X2值分别为0.338和0.086,P＞0.05;MEP联合CCCP、PABN前后耐药率X2值分别为1.065和1.458,P＞0.05.MIC值没有变化的菌株占50%以上;仅8株P且的MIC值降至原MIC值的1/4.在27株碳青霉烯类耐药Pa株中,24株(88.9%)存在外排泵高表达;其中3种外排泵(MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexEF-OprN)均高表达的菌株数量最多,13株,占54.2%.MexAB-OprM和MexCD-OprJ同时高表达以及MexAB-OprM和MexEF-OprN同时高表达菌株分别有3株,各占12.5%.仅MexEF-OprN高表达及仅MexAB-OprM高表达的菌株分别为2株,各占8.3%;未见仅MexCD-OprJ高表达者.3种外排泵基因mexA、mexD、mexF在对IMP及MEP均敏感的菌株中表达水平分别为0.48±0.48、0.48±0.53和0.30±0.41,与碳青霉烯类耐药组之间差异均有统计学意义(P＜0.05),碳青霉烯类耐药组的表达水平高于对IMP及MEP均敏感组的表达水平.MexA的表达水平在IMP、MEP均耐药组和IMP耐药、MEP敏感组间差别有统计学意义,前者高于后者.结论 当外排泵抑制剂CCCP和PAβN浓度分别为5μg/ml和20μg/ml时,对碳青霉烯类抗Pa活性影响较小,不能明显增强其对耐药菌的抗菌活性.MexAB-OprM的高表达与MEP耐药性有关,而MexCD-OprJ和MexEF-OprN的高表达与IMP耐药性有关,与MEP耐药性的关系尚有待进一步研究.     

铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制——耐药株外膜蛋白OprD_2缺失

目的;研究铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制。方法:以亚胺培南为代表,应用十二烷酸磺酸钠－聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)外膜蛋白图谱、凝胶分光光度扫描分析方法,分别研究临床分离的铜绿假单胞菌亚胺培南耐药株和亚胺培南敏感株。结果:耐药组OprD2相对含量显著低于敏感组。结论:OprD2的缺失是铜绿假单胞菌对以亚胺培南为代表碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。     

对碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌耐药机制及耐药性的研究

目的了解目前儿科临床分离对碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌外膜孔蛋白OprD2缺失和金属β内酰胺酶（MBI．）产生的情况，及具有不同耐药机制菌株的耐药特点。方法收集2004年1月--2006年12月从我院住院患儿中分离出的75株对碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌。用PCR方法进行oprD2基因、金属酶IMP、VIM、SPMT和GIM基因检测。用琼脂稀释法进行药敏试验，按照2006年CLSI推荐标准判断结果。使用WHONET5．3和SPSS13．0软件进行数据分析。结果检测75株对碳青霉烯类抗生素耐药的铜绿假单胞菌中外膜孔蛋白OprD2缺失者50株，占66．7％；产金属酶的46株．占61、3％，其中IMP阳性38株（82．6％），VIM阳性8株（17．4％）。外膜孔蛋白OprD2缺失同时产金属酶的34株，占45．3％，其对口内酰胺类抗生素的耐药率、MIC50和MIC90均高于其他菌株。结论目前从儿科临床分离对碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌外膜孔蛋白OprD2缺失和产生金属酶都十分严重，菌株的耐药性也很高，并且产MBI．菌株存在IMP和VIM2种基因型。     

产AmpC酶铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药机制的研究

目的研究产AmpC酶的铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的分子机制。方法2003-2007年从临床标本中分离到铜绿假单胞菌220株，采用三维试验筛选产8内酰胺酶（包括AmpC酶）的铜绿假单胞菌，应用多重PCR检测产AmpC酶的铜绿假单胞菌质粒携带的AmpC耐药基因，应用荧光定量RT—PCR的方法检测染色体AmpC酶基因和oprD2基因的表达情况。结果共检出40株产口内酰胺酶的菌株，其中产AmpC酶、ESBLs、金属酶（MBL）和未知酶型铜绿假单胞菌的构成比分别是62．5％（25／40）、20％（8／40）、7．5％（3／40）和10％（4／40）。25株产AmpC酶菌株均有不同程度AmpC酶基因表达量升高，其中，仅1株细菌携带DHA质粒型AmpC酶基因，12株菌oprD2基因表达量减低，这些菌株均对亚胺培南耐药，13株菌oprD2基因表达量正常，其中仅5株菌对亚胺培南耐药；7株菌（占产AmpC酶菌株的28％，不产金属酶）的酶粗提物能微弱水解IPM，这7株菌AmpC酶基因的表达量均有明显升高，其中5株菌同时伴有oprD2基因表达量降低。结论铜绿假单胞菌产生的AmpC酶可做弱水解亚胺培南，且其水解亚胺培南可能与AmpC酶产生量有一定关系；产AmpC酶铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的原因可能是细菌AmpC酶表达量增加和oprD2表达量减低两者共同作用的结果。     

Comparative in vivo efficacy of meropenem, imipenem, and cefepime against Pseudomonas aeruginosa expressing MexA-MexB-OprM efflux pumps

To identify the optimal pharmacodynamic exposures of meropenem, imipenem, and cefepime, and the emergence of resistance in vivo for Pseudomonas aeruginosa overexpressing MexA-MexB-OprM efflux pumps, we used the murine thigh model. Mice were challenged with P. aeruginosa isolates: PAO1 (K767 wild type), K767+ (MexA-MexB-OprM efflux mutant), and DeltaK767 (knockout strain). Efficacy (Delta log colony-forming unit [CFU]) was determined at various exposures of %T > MIC at both standard (10(5) CFU/thigh) and high (10(7) CFU/thigh) inoculums. At 10(5) CFU/thigh, meropenem and imipenem produced a maximal activity against PAO1 (-2.82, -1.88) and K767+ (-2.24, -2.68) at 40%T > MIC; cefepime at 70%T > MIC produced a comparable kill (-2.74 and -2.19, respectively). Similar magnitudes of kill were observed at the 10(7) inocula. Except for DeltaK767 with cefepime, no development of resistance emerged at various %T > MIC. All agents exhibited reduced activity against DeltaK767. DeltaK767 cefepime-resistant strains were isolated up to 100%T > MIC. The overexpression of MexA-MexB-OprM efflux pumps did not result in the loss of efficacy of the antibiotics tested regardless of the amount of bacterial inocula; however, their presence also did not lead to increased selection for resistance. The effects of efflux mechanisms on beta-lactam agents in vivo warrant further research.     

耐碳青霉烯铜绿假单胞菌耐药表型及基因型分析

目的 了解深圳福田人民医院铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制,为临床合理使用抗生素提供参考依据.方法 用E-test试剂条检测铜绿假单胞菌对哌拉西林、头孢他啶、亚胺培南、美罗培南、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星7种抗生素的最小抑菌浓度,用三维实验对产AmpC、KPC酶菌株的耐药表型进行确认,金属酶的表型确证实验则采用EDTA双纸片扩散法.用PCR方法检测AmpC、VIM-1、VIM-2、IMP-1、SPM、KPC及OprD 7个基因型,并分析表型和基因型之间的关系,质粒接合实验用来证实耐药基因的传播性.结果 29例铜绿假单胞菌均为多重耐药菌株,且对亚胺培南、美罗培南及庆大霉素耐药率最高,3种药物最小抑菌浓度分别为32、32、256 μg/mL.26株携带有AmpC基因的铜绿假单胞菌仅有5株为持续高表达菌株,18株金属酶阳性菌中有15株与VIM-2基因型检测一致,其余3株VIM-2基因型阴性,并有1株为VIM-2基因型阳性但金属酶阴性.29株中检测出8株携带OprD基因,外膜蛋白缺失率为72%(21/29),其余基因型均阴性.结论 该院铜绿假单胞菌耐碳青霉烯类抗生素的耐药机制主要为产金属酶及外膜蛋白缺失,碳青霉烯类抗生素的不合理使用将加剧该类药物的耐药性.     

耐亚安培南的铜绿假单胞菌OprD2的缺失与金属β-内酰胺酶编码基因的研究

目的了解临床分离的耐亚胺培南铜绿假单胞菌中外膜蛋白OprD2的缺失和金属β-内酰胺酶(MBLs)的基因型,为临床治疗和医院感染提供依据。方法用亚胺培南—EDTA纸片增效法筛选出产MBLs的菌株,并用PCR检测MBLs的基因和OprD2基因。结果 76株耐亚胺培南的铜绿假单胞菌中有16株产MBLs(检出率21.1%),其中VIM-2型13株(检出率17.1%),IMP-1型3株(检出率3.9%),孔蛋白OprD2缺失51株﹙检出率75%﹚。结论临床分离的耐亚胺培南的铜绿假单胞菌大多存在外膜蛋白OprD2的缺失,产生VIM-2型和IMP-1型MBLs菌株在本院有一定的流行,应密切监测其耐药变化。     

铜绿假单胞菌MexAB-OprM、MexXY-OprM主动外排系统的耐药作用

目的探讨MexAB-OprM、MexXY-OprM主动外排系统(外排泵)在多重耐药铜绿假单胞菌耐药机制中的作用。方法选取36株临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌,采用琼脂二倍稀释法,测定环丙沙星对铜绿假单胞菌的MIC及进行泵抑制剂碳酰氰基-对-氯苯腙(CCCP)存在情况下的干预试验;用实时定量RT-PCR测定结构基因mexA、mexX的mRNA表达水平来判断MexAB-OprM、MexXY-OprM外排泵表达情况;用PCR法分别扩增其调控基因mexR、mexZ,并对其产物测序,用Blast软件在GenBank与已知序列比较,研究其过度表达的机制。结果在CCCP作用下,36株铜绿假单胞菌中24株菌对环丙沙星的敏感性(MIC)由20～320 mg/L提高到2.5～40 mg/L,主动外排表型阳性率为66.7%(24/36),15株菌高表达Mex-AB-OprM外排系统(41.7%),21株高表达MexXY-OprM外排系统(58.3%)。15株高表达MexAB-OprM外排系统铜绿假单胞菌同时表达MexXY-OprM外排系统;12株干预试验阴性的铜绿假单胞菌均无mexA、mexX高表达;随机选择mexA、mexX高表达的4株细菌均发生mexR、mexZ基因突变,出现氨基酸替代。结论主动外排系统MexAB-OprM、MexXY-OprM在多重耐药铜绿假单胞菌中过度表达是铜绿假单胞菌多重耐药的机制之一;外排泵MexAB-OprM、MexXY-OprM高表达分别与调控基因mexR、mexZ发生变异有关。     

儿童患者中对碳青霉烯类耐药的绿脓假单胞菌产金属酶基因型研究

目的研究儿童患者中对碳青霉烯类抗生素耐药的绿脓假单胞菌产金属酶的基因型。方法本研究收集了2003年12月至2005年11月我院住院患儿中分离出的对碳青霉烯类抗生素耐药的绿脓假单胞菌59株。使用E试验法检测产金属酶的耐药表型，PCR技术检测编码金属酶的IMP、VIM、SPM和GIM4种基因型。PCR反应产物进行纯化后，使用双脱氧末端终止法进行DNA测序。将得到的拼接序列与GenBank中Blast进行同源分析，确定其基因亚型。结果59株对碳青霉烯类抗生素耐药的绿脓假单胞菌中，纸片法检测金属酶表型结果阳性29株，占49．2％。PCR检测金属酶基因型阳性39株，占66．1％，其中IMP型阳性35株，占89．7％，VIM型阳性4株，占10．3％。未检测出SPM和GIM型金属酶。测序结果显示，IMP型测序结果均为产IMP．1亚型金属酶的绿脓假单胞菌。VIM型测序结果均为产VIM-2亚型金属酶的绿脓假单胞菌。结论儿童患者中对碳青霉烯类抗生素耐药的绿脓假单胞菌，产金属酶率高于成人报道。产生的金属酶同时存在IMP-1和VIM-2两种基因型，其中以IMP-1亚型为主，少部分为VIM-2亚型。产金属酶是儿童患者对碳青霉烯类抗生素耐药的绿脓假单胞菌的重要耐药机制。在儿科进行对碳青霉烯类耐药的绿脓假单胞菌产金属酶的监测十分重要。