RNA干扰对雄激素合成关键酶17α-羟化酶/17,20裂解酶作用的实验研究

目的:探讨细胞色素P45017α-羟化酶/17,20裂解酶(CYP17)小干扰RNA(siRNA)对CYP17基因表达和多囊卵巢综合征(PCOS)卵泡膜细胞雄激素合成的抑制效果。方法:合成4条靶向CYP17基因的特异性siRNA和非特异性siRNA。将0.4μg携带报告基因增强型绿色荧光蛋白和CYP17基因的质粒和siRNA共转染入HeLa细胞,荧光显微镜观察及流式细胞术检测绿色荧光蛋白的表达反映对CYP17表达的影响,筛选抑制效果最佳的siRNA。卵泡膜细胞取自PCOS患者和非PCOS妇女各5例,将筛选出的最佳CYP17siRNA以最佳浓度转染人卵泡膜细胞,荧光定量实时逆转录多聚酶链反应检测CYP17mRNA的表达,并且检测培养液中CYP17作用产物雄烯二酮和前体孕酮水平。结果:siRNA1221处理后,HeLa细胞中外源性CYP17的表达显著降低,抑制率达50﹪,卵泡膜细胞中CYP17mRNA水平和雄烯二酮产生降低,但与对照组比较,统计学上无显著差异。结论:RNA干扰技术可能提供一种PCOS高雄激素基因治疗的新方法。     

RNA干扰对雄激素合成关键酶17α-羟化酶/17,20裂解酶作用的实验研究

目的:探讨细胞色素P450 17α-羟化酶/17,20裂解酶(CYP17)小干扰RNA (siRNA)对CYP17基因表达和多囊卵巢综合征(PCOS)卵泡膜细胞雄激素合成的抑制效果.方法:合成4条靶向CYP17基因的特异性siRNA和非特异性siRNA.将0.4μg携带报告基因增强型绿色荧光蛋白和CYP17基因的质粒和siRNA共转染入HeLa细胞,荧光显微镜观察及流式细胞术检测绿色荧光蛋白的表达反映对CYP17表达的影响,筛选抑制效果最佳的siRNA.卵泡膜细胞取自PCOS患者和非PCOS妇女各5例,将筛选出的最佳CYP17 siRNA以最佳浓度转染人卵泡膜细胞,荧光定量实时逆转录多聚酶链反应检测CYP17 mRNA的表达,并且检测培养液中CYP17作用产物雄烯二酮和前体孕酮水平.结果:siRNA 1221处理后,HeLa细胞中外源性CYP17的表达显著降低,抑制率达50%,卵泡膜细胞中CYP17 mRNA水平和雄烯二酮产生降低,但与对照组比较,统计学上无显著差异.结论:RNA干扰技术可能提供一种PCOS高雄激素基因治疗的新方法.     

多囊卵巢综合征卵泡膜细胞功能的研究

多囊卵巢综合征(PCOS)是女性最常见的内分泌疾病之一,影响了6%-10%的育龄期妇女。PCOS卵巢的特性是卵泡内膜过度增生。而卵泡膜细胞是PCOS患者雄激素合成过多的原始来源之一。PCOS的卵泡膜细胞中CYP11A1、CYP17、StAR、3β-HSD表达增加。PCOS卵巢雄激素过多的发病机制中存在MAPK信号通路的改变,胰岛素能调控PCOS卵泡膜细胞甾体激素的合成。因此,对于PCOS卵泡膜细胞功能的研究将有助于此疾病的病因学和治疗学的发展。     

丙戊酸钠对卵泡内膜细胞雄激素分泌及相关甾体合成酶改变的影响

目的:研究丙戊酸钠(VPA)对卵泡内膜细胞睾酮生成以及细胞色素P45017α羟化酶(CYP17)、胆固醇侧链裂解酶(P450scc)和类固醇激素急性调节蛋白(StAR)mRNA的影响。方法:采用猪的卵泡内膜细胞进行体外原代培养,并给予不同浓度的VPA(0mg/L、50mg/L、100mg/L和250mg/L)处理,48h后收集培养液,采用ELISA法检测细胞睾酮的分泌,采用荧光实时RT-PCR(TaqMan.assay)方法检测卵泡内膜细胞中CYP17、P450scc和StARmRNA表达。结果:VPA刺激了卵泡内膜细胞睾酮的分泌(P<0.05),且CYP17(P<0.01)、P450scc(P<0.01)和StAR(P<0.01)mRNA表达增加。结论:VPA可直接作用于卵泡内膜细胞,改变CYP17、P450scc和StARmRNA表达,引起雄激素的分泌变化。临床上长期服用VPA的癫痫妇女出现类似于PCOS患者的生殖内分泌功能紊乱,可能与该药物本身作用有密切联系。     

RNA干扰抑制ABCG2表达对子痫前期滋养细胞分泌hCG的影响

目的:应用RNA干扰技术,使胎盘滋养细胞ATP结合匣式转运子G2(ABCG2)基因表达沉默,检测干扰前后ABCG2的表达及人绒毛膜促性腺激素β亚单位(β-hCG)水平变化,研究ABCG2的表达对子痫前期滋养细胞分泌β-hCG功能的影响。方法:通过小干扰RNA(siRNA)预测工具确定3个ABCG2基因的siRNA靶位点,合成3对互补的短发夹RNA(shRNA)序列转化质粒,选取干扰有效的质粒包装慢病毒后感染原代培养正常及子痫前期胎盘滋养细胞,应用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)及蛋白质印迹(Western blotting)检测干扰前、后滋养细胞ABCG2 mRNA及蛋白的表达水平,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测干扰前、后不同分化状态细胞上清液中的β-hCG水平。结果:有效的RNA干扰后滋养细胞ABCG2 mRNA及蛋白的表达明显降低,无论干扰前、后子痫前期滋养细胞hCG分泌都高于正常,干扰后滋养细胞分泌hCG水平降低。结论:siRNA可有效干扰滋养细胞ABCG2基因的表达,ABCG2基因表达沉默后胎盘滋养细胞hCG分泌下降,推测子痫前期ABCG2表达升高可通过促进滋养细胞分泌hCG抑制子痫前期的发展。     

细胞色素P450 19基因与性激素依赖性疾病

芳香化酶P450(P450arom)是雌激素合成过程中,雄烯二酮和睾酮分别转化为雌酮和雌二醇的限速酶,存在于全身多种组织中,如卵巢、脂肪、肾上腺。细胞色素P45019基因(CYP19基因)是P450arom的编码基因,其组织特异性表达决定了P450arom在各组织中发挥不同的生理或病理作用。CYP19基因功能亢进导致其产物P450arom增多,与许多雌激素依赖性疾病如子宫内膜癌、子宫内膜异位症和乳腺癌的发生发展有关;CYP19基因功能不足,引起上游底物即雄激素堆积,该现象可在多囊卵巢综合征(PCOS)中观察到。综述CYP19基因的结构特性、调节机制及其与雌激素依赖性疾病和PCOS的关系,同时展望此类疾病的基础研究和临床治疗。     

siRNA对宫颈癌细胞系 HPV16 E6基因的作用

目的 构建并筛选出最有效的HIV16 E6基因特异的小干扰RNA(amall interfering RNA，siRNA)表达载体，观察其对宫颈癌细胞中HIV16 E6基因表达的长期影响，探讨E6基因在宫颈癌发生过程中的分子作用机制，为临床HIV感染及宫颈癌治疗探索新方法。方法 构建Hairpin siRNA质粒，稳定转染宫颈癌SiHa细胞，鉴定转染细胞中的质粒DNA，通过Real-Time RT-PCR检测细胞中HPV16 E6mRNA表达，采用Westem-blot检测p53、p21等蛋白的变化。MTT法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)检测SiHa细胞转染siRNA后细胞增殖曲线。结果 HIV16 E6A hairpin siRNA表达载体转染人宫颈癌SiHa细胞，可以在细胞内长期表达siRNA，有效抑制细胞内HIV16 E6基因的表达。E6A siRNA能抑制细胞生长，作用持续达4个月以上。结论 利用siRNA表达载体抑制整合在细胞中的外源HIV E6病毒癌基因可能是治疗HIV感染和宫颈癌的一种新的理想方法。     

小分子干扰RNA诱导卵巢上皮性癌细胞凋亡的实验研究

表皮生长因子受体2（HER-2）是HER-2原癌基因编码的一种酪氨酸蛋白激酶，研究表明，过度表达的HER-2基因通过激活瑚等信号分子，导致细胞过度增殖和恶性变，抑制细胞凋亡，与肿瘤的恶性程度和转移能力密切相关。已有研究证明，30％的卵巢上皮性癌（卵巢癌）存在HER．2基因的高表达。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是生物进化过程中保留的一种防御机制，可以介导互补基因的靶向性降解。本研究拟应用RNAi技术，合成针对HER-2基因的特异性小分子干扰RNA（small interference RNA，siRNA），转染卵巢癌细胞株SKOV3细胞，探索siRNA诱导卵巢癌细胞凋亡的机制。     

小干扰RNA抑制多药耐药基因表达并逆转耐药

目的探讨小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）影响卵巢癌耐药细胞株MDRl基因的表达并逆转其多药耐药的功能。方法2004年10月至2005年6月于山东省立医院中心实验室采用浓度梯度诱导法建立人卵巢癌阿霉素耐药细胞株OVCAR／AR。根据MDRl基因的编码区域设计了2个含19个碱基的MDR1基因特异性siRNA，脂质体介导下转染OVCAR／AR细胞。RT—PCR分析MDR1 mRNA的表达；流式细胞术（FCM）检测P-糖蛋白（P-gp）的表达；MTT法检测OVCAR／AR细胞的多药耐药性。结果MDR1特异性siRNA转染后，OVCAR／AR细胞MDR1 mRNA和P-gp的表达减少，分别以转染后48h和72h下降最著；转染mdr1a和mdr1b siRNA可不同程度地逆转OVCAR／AR细胞对阿霉素、泰素的耐药性，但对非P-gp介导耐药的顺铂无影响。结论阿霉素所致的卵巢癌细胞多药耐药与MDR1基因过度表达有关，体外实验中应用MDR1特异性siRNA能部分逆转OVCAR／AR细胞的多药耐药。     

多囊卵巢综合征与CYP_(17)基因多态性的关联性研究

目的：探讨多受卵巢综合征（PCOS）及其高雄激素血症与CYP(17)基因多态性的关联性。方法；用多聚酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法检测56例PCOS患者（实验组）及30例正常妇女（对照组）CYP(17)基因的多态性，该基因翻译起始点-34bp处因存在单一碱基的变异（C取代T）产生A1（无变异）及A2（有变异）两个等位基因，经PCR扩增后，用限制性内切酶（MspA1I）消化后电泳检测和比较。结果：PCOS组A1和A2等位基因频率分别为45．5％和54．5％，与对照组差异无显著性；有高雄激素血症的PCOS组A2等位基因出现频率（33／43）显著高于无高雄激素血症者（6／13）（P＜0．05）。结论：CYP(17)基因多态性不是PCOS的主要致病因素，但其A2等位基因的存在可能会改变该基因的表达，对PCOS高雄激素血症的形成起重要的辅助作用。     

HPV16 E7 siRNA表达载体对宫颈癌CaSki细胞增殖及成瘤性的影响

目的:通过载体介导的RNA干扰技术干扰E7癌基因的表达,探讨HPV16E7小干扰RNA(siRNA)表达载体对宫颈癌CaSki细胞增殖及成瘤性的影响,以及成为宫颈癌基因治疗新策略的可行性。方法:利用脂质体将HPV16E7特异性siRNA表达载体、空载体转染CaSki细胞,分别命名为CaSki-S、CaSki-P。通过荧光定量RT-PCR及流式细胞仪检测CaSki、CaSki-S、CaSki-P3种细胞E7mRNA和蛋白的变化,通过流式细胞仪及MTT法检测3种细胞的细胞周期及生长曲线变化,并检测3种细胞在裸鼠体内成瘤性及生长活性的差异。结果:荧光定量RT-PCR及流式细胞仪检测显示,CaSki-S细胞E7基因mRNA和蛋白的表达明显低于CaSki细胞,抑制率分别为92.86%、84.21%。MTT法检测显示,CaSki-S细胞生长明显慢于CaSki细胞。流式细胞仪检测细胞周期显示,CaSki-S细胞与未转染组CaSki细胞比较,G1期细胞比例明显增加,S期细胞比例则明显减少。裸鼠体内成瘤性及生长活性显示CaSki-S细胞显著低于CaSki细胞。而CaSki-P细胞无论是在E7mRNA和蛋白的表达,还是在肿瘤细胞生长、细胞周期的改变及成瘤性方面都与CaSki细胞无明显差异。结论:HPV16E7siRNA表达载体能有效地抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达,部分逆转其恶性表型。因此它有望成为宫颈癌基因治疗的新策略之一。     

RNAi沉默STAT3基因对人宫颈癌SiHa细胞定植和侵袭的影响

目的：探讨信号转导因子与转录激活因子3（STAT3）短发夹RNA（shRNA）真核表达载体对宫颈癌SiHa细胞定植和侵袭能力的影响。方法：针对人STAT 3的基因设计并合成编码小干扰RNA（siRNA）的寡核苷酸,克隆入pSilencer2.1-U6-neo质粒中,构建STAT 3基因shRNA真核表达质粒,脂质体法将重组质粒转染人宫颈癌SiHa细胞。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质印迹（Western blot）法分别检测STAT 3基因的mRNA及蛋白表达水平;软琼脂克隆形成实验和体外侵袭实验检测SiHa细胞的定植和侵袭能力。结果：构建的STAT 3基因shRNA真核表达载体成功地转染人宫颈癌SiHa细胞,细胞STAT3蛋白及mRNA表达均下降（P ＜0.05）;SiHa细胞在软琼脂中形成的克隆数和穿透Matrigel膜的细胞数均明显减少（P ＜0.05）。结论：STAT 3基因shRNA真核表达载体通过下调STAT 3基因表达,抑制宫颈癌细胞的定植和侵袭能力。     

siRNA抑制卵巢癌SKOV3细胞EPAS1表达及细胞增殖的体外研究

目的:探讨RNA干扰对卵巢癌SKOV3细胞中缺氧诱导因子2(EPAS1)表达及细胞增殖的抑制作用。方法:合成靶向EPAS1的小干扰RNA(siRNA)并进行转染。实验分为实验组、阳性对照组、阴性对照组及空白对照组。采用RT-PCR和western blotting检测各组细胞EPAS1 mRNA和蛋白表达水平,通过MTT法检测各组细胞增殖情况。结果:应用EPAS1-siRNA转染卵巢癌SKOV3细胞后,实验组的EPAS1mRNA和蛋白表达水平明显降低,细胞增殖明显受限,与其他三组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组基因沉默效率为63.9%,蛋白抑制率为48.1%,细胞增殖抑制率为56.9%。结论:靶向EPAS1基因的siRNA可以抑制卵巢癌SKOV3细胞中EPAS1的表达,从而抑制SKOV3细胞在体外的增殖。     

HPV16 E6小干扰RNA与宫颈癌细胞中E6 p53 p21关系的研究

目的 探讨HPV16E6小干扰RNA（siRNA）与宫颈癌CaSki细胞中E6、p53、p21之间的关系。方法 2004年9月至2005年3月于四川大学华西第二医院,应用化学合成针对HPV16E6的siRNA借脂质体转染CaSki细胞,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和流式细胞术检测E6siRNA转染前后细胞中HPV16E6、p53、p21mRNA及其蛋白表达的变化。结果 转染24h,E6mRNA的表达显著低于空白组（P〈0.05）。各时间点p53、p21mRNA的表达差异无显著性意义（P〉0.05）。转染48h,E6蛋白表达明显下调,p53、p21蛋白表达相应升高。结论 HPV16E6siRNA能特异、高效地沉默宫颈癌细胞E6mRNA的表达,减少对野生型p53的降解,恢复p53蛋白的功能活性。RNA干扰（RNAi）技术可为HPV感染相关性疾病提供一种新的特异性基因治疗方法。     

RNA干扰技术抑制切除修复交叉互补基因1对卵巢上皮性癌细胞顺铂敏感性的影响

目的探讨RNA干扰技术抑制切除修复交叉互补基因(ERCC)1对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞顺铂敏感性的影响。方法体外设计、合成针对ERCC1的小分子干扰RNA(siRNA),并转染卵巢癌细胞ES2,应用RT PCR、蛋白印迹法(westernblot)和免疫组化链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶(SP)连接法检测转染siRNA后ES2细胞ERCC1基因和蛋白的表达变化,应用四甲基偶氮唑蓝比色法检测干扰ERCC1后ES2细胞对顺铂敏感性的变化。结果转染针对ERCC1的siRNA后24、48、72h,ES2细胞ERCC1基因和蛋白的表达水平下降;转染ERCC1siRNA后,ES2细胞对顺铂的半数抑制量从(10.475±1.713)μg/ml提高到(0.194±0.021)μg/ml,ES2细胞对顺铂的敏感性增加了53.88倍。结论RNA干扰技术抑制ERCC1能增加卵巢癌细胞ES2对顺铂的敏感性。     

RNA干扰技术抑制HLX1基因表达对滋养细胞生物学性能的影响

目的:研究小分子干扰RNA(siRNA)技术抑制人类同源异型盒基因HLX1的表达对胎盘滋养细胞株HTR-8/SVneo细胞生物学性能的影响。方法:常规体外培养HTR-8/SVneo细胞,设实验组(转染HLX1基因的特异性siRNA)、阴性对照组(转染阴性对照siRNA)及空白对照组(除不含siRNA片段,余试剂与另两组相同)3组分别进行瞬时转染。用流式细胞术测定siRNA转染效率,应用实时定量PCR技术和蛋白印迹法测定转染后各组HTR-8/SVneo细胞中HLX1 mRNA和蛋白的表达;应用MTT比色实验、Matrigel侵袭实验分别检测转染后各组细胞的增殖能力与侵袭能力的变化。结果:(1)转染24h后测得siRNA转染效率达(86.3±2.6)%。(2)转染48h后HLX1 mRNA的表达水平下调(77.0±1.2)%(P<0.01),转染72h后HLX1蛋白的表达水平下调(82.6±1.2)%(P<0.01),与HLX1 mRNA的表达水平下调相一致。(3)转染HLX1 siRNA 24h后,HTR-8/SVneo细胞的增殖活性已受到抑制,转染72h后细胞增殖抑制最显著,抑制率达到(58.1±4.4)%(P<0.01)。(4)转染HLX1 siRNA后,HTR-8/SVneo细胞侵袭Matrigel基质胶的能力受到显著抑制,其穿膜细胞数为(29±3)个,与空白对照组(穿膜细胞数为[53±8]个)相比,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:HLX1基因表达水平的下降可以显著抑制滋养细胞的增殖活性与侵袭能力;HLX1基因表达异常可能通过影响滋养细胞增殖、侵袭等过程参与IFGR、子痫前期等疾病的发生。     

RNA干扰技术及在妇科肿瘤研究中的应用

RNA干扰(RNAi)是生物体内由具有同源性的双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)引发的序列特异的转录后基因沉默机制。RNAi主要通过体外合成的dsRNA导入细胞或在细胞内产生的dsRNA被核酸酶Dicer切割成21～25nt的小干扰RNA(siRNA)，由siRNA介导识别并靶向切割同源mRNA分子而实现。该技术能够快速、高效、特异地抑制靶基因的表达。RNAi技术为肿瘤的研究和治疗开辟了一条新的通路。就该项技术及在妇科肿瘤研究中的应用做一综述。     

RNA干扰技术及在妇科肿瘤研究中的应用

RNA干扰(RNAi)是生物体内由具有同源性的双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)引发的序列特异的转录后基因沉默机制.RNAi主要通过体外合成的dsRNA导入细胞或在细胞内产生的dsRNA被核酸酶Dicer切割成21～25nt的小干扰RNA(siRNA),由siRNA介导识别并靶向切割同源mRNA分子而实现.该技术能够快速、高效、特异地抑制靶基因的表达.RNAi技术为肿瘤的研究和治疗开辟了一条新的通路.就该项技术及在妇科肿瘤研究中的应用做一综述.     

Rab25 siRNA抑制人卵巢癌细胞粘附侵袭的实验研究

目的通过RNA干涉抑制Rab25在人卵第上皮性癌的过表达，观察Rab25基因沉默对卵巢癌A2780细胞的生物学效应，探讨Rab25基因沉默对卵巢癌侵袭及转移能力的影响。方法根据基因库上的Rab25mRNA序列，构建针对Rab25的siRNA重组质粒，稳定转染A2780细胞，通过RT-PCR检测Rab25的表达，利用粘附实验和transwell小室实验检测其对细胞的粘附力及侵袭能力的影响。结果成功构建Rab25的siRNA重组质粒，稳定转染靶细胞后可显著降低Rab25的表达，并且与对照相比，Rab25siRNA可显著影响卵巢癌细胞的侵袭粘附能力（P〈0．01）。结论成功构建Rab25siRNA显著抑制肿瘤细胞的侵袭粘附能力，对Rab25的研究有望为卵巢癌的基因治疗开辟新途径。     

细胞色素P450 181在妇科肿瘤研究进展

细胞色素P450181（CYP1B1）是一种重要的P450系氧化代谢酶，广泛存在于肝外组织，参与代谢一些外源性化合物及前致癌物，同时还是17β-雌二醇代谢的关键酶。CYP1B1基因多态性与多种肿瘤（如乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌）易感性相关。研究还发现CY1B1在多种肿瘤组织中高表达，而在相应正常组织无表达，这为抗肿瘤药物及免疫治疗提供了新的靶点。综述CYP1B1基因及其多态性、调节机制、代谢特异性、组织特异性表达及其在妇科肿瘤中的研究现状。