神经节苷脂促进周围神经再生的实验

目的:观察神经节苷脂对冷冻处理后的异体周围神经移植再生的影响。方法:实验于2001-06/2003-12在广西医科大学中心实验室完成。选取健康成年新西兰大白兔36只,取4只作为供体,切取双侧坐骨神经,制成10mm神经段,深低温冷冻储存2周备用。其余32只作为受体,随机分为神经节苷脂组与正常对照组,16只/组,将兔左侧坐骨神经造成10mm长缺损,用复温后的同种异体神经进行移植桥接。神经节苷脂组每天每只局部注射质量浓度为1g/L的神经节苷脂溶液1mL,连续14d;正常对照组不做任何处理。两组分别于术后2,4,8,12周随机取4只进行电生理检查、组织学观察、超微结构观察、肌肉湿重测定以及形态学定量分析。结果:作为受体的32只兔全部进入结果分析,中途无脱落。①两组兔术后大体观察比较:正常对照组均有足底及足趾溃疡,神经节苷脂组有6只发生足跟溃疡。两组动物左后肢均无力,行走不稳。②两组兔术后不同时期电生理检测结果比较:与正常对照组传导速度、电位波幅比较,术后2,4,8周神经节苷脂组基本无变化(P>0.05),术后12周明显升高[(28.62±2.42),(21.78±2.43)m/s;(5.48±0.36),(4.67±0.53)mV;P均<0.05]。③两组兔术后不同时期组织学观察结果比较:术后2周,正常对照组有髓神经纤维髓鞘崩解,许旺细胞增生不明显;神经节苷脂组崩解反应较正常对照组慢,许旺细胞增生明显。术后4周,正常对照组许旺细胞增生活性低,有髓神经纤维密度低;神经节苷脂组许旺细胞增生活跃,有髓神经纤维密度较大;术后12周,正常对照组有髓神经纤维数量少,神经束膜间毛细血管增生明显,神经纤维瘢痕化明显;神经节苷脂组有髓神经纤维数量较多,有少许神经纤维瘢痕化,神经束膜间毛细血管清晰。④两组兔术后12周超微结构观察比较:正常对照组可见结缔组织无定形结构中夹杂少量变性神经纤维,轴突电子密度低且有空泡,许旺细胞细胞器及有髓轴突稀少,部分再生轴突及髓鞘发生wallerian变性脱髓;神经节苷脂组可见大量神经纤维髓鞘增厚和)旺氏细胞细胞器更丰富,轴突电子密度深且均匀,许旺细胞外有完整基膜包绕,变性神经纤维少。⑤两组兔术后不同时期肌肉湿重Guadros指数的测定:术后4,8,12周,神经节苷脂组均明显高于正常对照组(P均<0.05),表明正常对照组肌萎缩较重。⑥两组兔术后不同时期再生神经纤维各项指标测定结果比较:与正常对照组有髓神经数目、纤维直径、髓鞘厚度及轴突直径比较,术后2,4,8周神经节苷脂组基本无变化(P>0.05),术后12周均明显高于正常对照组[(2183.6±184.3),(1520.2±124.3)个/400倍视野;(16.45±1.86),(10.08±1.62)μm;(6.48±0.72),(4.72±0.56)μm;(4.40±0.42),(3.04±0.34)μm;P均<0.05]。结论:再生神经能够顺利地通过移植体进入远端,使再生神经传导速度、有髓神经纤维数目、肌湿重等指标明显升高,证明兔同种异体神经经冷冻处理后桥接神经缺损可引导神经纤维再生,且外源性神经节苷脂可促进异体移植周围神经的再生。     

许旺细胞与脱细胞神经移植物共培养在周围神经损伤修复中的作用

目的：观察体外分离、培养、纯化的许旺细胞对脱细胞神经移植物修复神经损伤舯促进作用，为临床应用组织工程化神经修复周围神经缺损提供实验依据。 方法：实验于2004-04／2005-04在中国医科大学组织工程实验室完成。纳入普通级雄性Wistar大鼠24只，体质量180-220g。随机分为实验组、空白对照组、自体移植对照组共3组，每组8只。分笼饲养。另纳入5-8d龄spmgue-Dawley乳鼠40只，取其双侧坐骨神经与臂丛神经。实验组大鼠右后腿用种植许旺细胞的ARSN桥接人为造成的神经缺损。空白对照组大鼠右后腿用单纯ARSN桥接人为造成的神经缺损。酶反复消化法与差速贴壁法分离和培养许旺细胞；许旺细胞与10mm长的脱细胞神经移植物共培养后，应用外科手术移植到大鼠坐骨神经缺损处，自体移植对照组大鼠右后腿用单纯切断的神经上下颠倒原位桥接人为造成的神经缺损。13周取材通过透射电镜和扫描电镜观察神经纤维的再生情况。 结果：Wistar大鼠24只全部进入结果分析，没有脱失。①实验组较空白对照组的再生有髓神经纤维均匀，轴索略粗，髓鞘厚度有差别，部分神经纤维髓鞘还未形成板层结构，许旺细胞包绕神经纤维，轴索内微丝微管结构较清晰，无髓神经纤维直径较小，不均匀分布在有髓神经纤维之间，由一层纤维结缔包裹形成纤维束，实验组较自体移植对照组的髓鞘略薄，自体移植组再生神经纤维均较粗，许旺细胞包裹轴突形成排列规则、电子密度较高的髓鞘，髓鞘厚薄基本相同。②实验组可见大量许旺细胞呈双极梭形，并且首尾相连排列成链状或网状特征性分布。许旺细胞还可在神经纤维上的胶原丝上附着。③实验组有髓神经纤维数、髓鞘厚度、G率（有髓纤维总面积／神经干总面积）接近自体移植对照组，差异无显著性意义[（5344&;#177;592），（5514&;#177;373）；（3．13&;#177;0．16），（3．19&;#177;0．25）μm；（48．43&;#177;3．62）％，（57．11&;#177;2．28）％；P〉0．05]；与空白对照组比较差异有显著性意义[（5344&;#177;592），（3191&;#177;236）；（3．13&;#177;0．16），（1．28&;#177;0．33）μm；（48．43&;#177;3．62）％，（31．05&;#177;4．19）％；P〈0.05]。 结论：与许旺细胞共培养的脱细胞神经移植物可加快宿主轴索再生，促进神经损伤修复，是临床修复神经缺损的可行办法。     

副神经移位修复第5颈椎神经根和臂丛神经上干的可行性

目的：应用小间隙的方法行副神经移位修复C5、臂丛神经上干，以了解副神经移位后的效果及节省动力神经源的可行性。方法：实验于2004-09／12在吉林省外科研究所实验室进行，取40只雄性Wistar大鼠，随机分成两组，每组20只：A组：自体颈静脉桥接行副神经小间隙（2mm）移位于C5神经根，B组：自体颈静脉桥接行副神经小间隙（2mm）吻合于臂丛神经上干，两组均是左侧为正常侧，右侧为实验侧。术中测量副神经、C5神经根和臂丛神经上干的直径；术后12周行电生理学观察两组大鼠肱二头肌、三角肌肌电图波幅和潜伏期；神经组织学和图像观察再生神经纤维数目、轴突直径和髓鞘厚度；透射电镜观察再生神经纤维形态。结果：两组40只大鼠均进入结果分析。①神经直径：副神经主干为（0．45&;#177;0．05）mm，C5神经根为（0．66&;#177;0．11）mm，臂丛神经上干为（1．16＋0．14）mm。②肌电图波幅和潜伏期：术后12周A组肱二头肌、三角肌实验侧和正常侧比较无差异（P〉0．05）；B组肱二头肌实验侧和正常侧比较无差异，三角肌实验侧较正常侧潜伏期长，波幅低（P〈0．05）。③再生神经纤维数目：术后12周A组实验侧和正常侧比较无差异（P〉005），B组实验侧明显少于正常侧[（99.60&;#177;22.61），（134．40&;#177;30．62）个，t=8.26, P〈0．01]。④轴突直径：术后12周A组实验侧和正常侧比较无差异（P〉0．05），B组实验侧明显小于正常侧[（1．38&;#177;0．40），（2．88&;#177;0．62）μm，t=19．35, P〈0．01]。⑤髓鞘厚度：术后12周A组实验侧和正常侧无差异（P〉0.05），B组实验侧明显小于正常侧[（0．92&;#177;0．22），（1．75&;#177;0．61）μm，t=5．98, P〈0．01]。⑥再生神经纤维形态：A组再生的有髓神经纤维数多，有髓神经纤维髓鞘厚度厚，神经束膜结构完整。B组有髓神经纤维数目明显少，束膜结构不完整，有髓神经纤维鞘可见板层样分离。结论：①应用副神经移位可以修复C5神经根损伤，由于副神经直径相当于C5神经根直径的68％，可以节省动力神经源。②而副神经移位修复臂丛神经上干因两者直径差异明显，副神经只相当于臂丛神经上干直径的39％而不能修复上干。     

周围神经端侧吻合后侧支发芽过程中睫状神经营养因子和S-100蛋白的表达

目的：观察与许旺细胞关系密切的睫状神经营养因子和S-100蛋白在周围神经端侧吻合后神经再生过程中的表达。 方法：实验于2002-10／2004-05在上海海军医学研究所完成。选取3月龄SD大鼠16只，随机分为吻合近端组、吻合远端组，8只／组。右侧为吻合组，左侧为正常对照组，于术后1，2，4，8周从吻合近端组及吻合远端组各取1只，共8只。全部大鼠右侧自腓神经切断，胫神经外膜开窗，腓神经远端行外膜端侧吻合于胫神经开窗处。吻合近端组与吻合远端组分别切取吻合近端、远端神经，制备纵切片标本，睫状神经营养因子和S-100蛋白采用免疫组织化学反应并结合计算机进行反应强度的半定量分析。阳性反应染色强的部位透光弱，其灰度值就低，反之灰度值高。 结果：实验纳入大鼠16只，均进入结果分析。①各组术后不同时间睫状神经营养因子免疫反应灰度值的比较：与正常对照组比较，吻合近端组术后1，2，4，8周均基本相近（P〉0．05）；吻合远端组术后1，2，4周均明显升高（117．83&;#177;10．44，155．57&;#177;10．76，186．42&;#177;5．23．142．83&;#177;6．99，P均〈0．01），8周时降至正常水平（P〉0．05）。②各组术后不同时间S-100蛋白的表达：术后1，2，4，8周与正常对照组比较．吻合近端组均无明显差异（P〉0．05）；吻合远端组均呈下降趋势（98．80&;#177;3．43，37．21&;#177;11．44．56．01&;#177;5．77。65．13&;#177;12．36．68．17＋9．35．P〈0．01或0．05）。 结论：在端侧吻合中，由于供体神经轴突的完整性，无法得到近端的因子调节，侧支发芽主要依赖于远端许旺细胞和靶器官。吻合远端睫状神经营养因子呈先下降后上升的趋势，而S-100蛋白呈上升趋势．两者均随神经的修复逐步上调，表明睫状神经营养因子与神经轴突的再生密切相关。提示许旺细胞在端侧吻合轴突侧支发芽中有着必不可少的作用。     

靶肌肉注射环磷酸腺苷对周围神经再生的作用

目的：观察靶肌肉注射外源性环磷酸腺苷对大鼠坐骨神经再生的治疗作用。 方法：实验于2004-10／2005-03在华中科技大学同济医学院协和医院骨科实验室完成。选择健康雄性Wistar大鼠48只。制备大鼠左侧坐骨神经挤压伤模型。实验动物随机数字表法分为3组，每组16只，高剂量组：腓肠肌内注射0．2mL环磷酸腺苷1mg。低剂量组：腓肠肌内注射注射0．2mL环磷酸腺苷0．1mg。对照组：腓肠肌内注射0．2mL生理盐水。术后每日给药1次，共4周。术后4，8周时检测左侧小腿三头肌湿质量。术后8周时检测坐骨神经运动神经传导速度、小腿三头肌复合肌肉动作电位波幅、潜伏期及形态学观察神经再生情况。 结果：纳入动物48只，均进入结果分析。①术后4，8周时高剂量组和低剂量组大鼠左小腿三头肌湿质量显著高于对照组[术后4周分别为（1．70&;#177;0．58），（1．26&;#177;0．71），（0．91&;#177;0．24）g；术后8周分别为（2．26&;#177;0．62），（1．65&;#177;0．16），（1．24&;#177;0．37）g]，且高剂量组明显高于低剂量组，差异有显著性意义（P〈0．01）。②术后8周高剂量组和低剂量组坐骨神经运动神经传导速度、小腿三头肌复合肌肉动作电位波幅、潜伏期及有髓神经纤维计数、髓鞘厚度、轴突直径均高于对照组[运动神经传导速度分别为（33．54&;#177;2．65），（26．96&;#177;4．12），（19．83&;#177;2．74）m／s；复合肌肉动作电位波幅分别为（2．435&;#177;1．257），（1．867&;#177;0．566），（1．218&;#177;0．647）mV；复合肌肉动作电位潜伏期分别为（2．946&;#177;0．658），（4．537&;#177;0．932），（5．825&;#177;1．043）ms；有髓神经纤维计数分别为（1693&;#177;201），（1357&;#177;185），（876&;#177;124）个；髓鞘厚度分别为（1．149&;#177;0．138），（0．924&;#177;0．086），（0．633&;#177;0．105）min；轴突直径分别为（1．045&;#177;0．150），（0．794&;#177;0．095），（0．512&;#177;0．138）μm]，且高剂量组显著高于低剂量组，差异有显著性意义（P〈0．01）。 结论：靶肌肉注射环磷酸腺苷可促进周围神再生，高剂量环磷酸腺苷对神经再生具有更好的促进作用。     

周围神经放射线照射后原位再植再生功能与组织学的恢复

目的：观察大鼠体外坐骨神经节段经放射线照射后原位再植再生功能与组织学影响。方法：实验于2004—05／09在哈尔滨医科大学附属肿瘤医院动物实验中心完成，选择清洁级5月龄雌性大白鼠26只，其中2只编号为1、2号。余24只随机分为3组，对照组，单纯手术组和4500cGy照射组，每组8只。制备模型，单纯手术组切取右腿坐骨神经中段10min后原位再植；4500cGy照射组坐骨神经节段离体以4500cGy高能射线一次照射后原位再植。1号鼠神经节段同单纯手术组处理，2号鼠同自体神经移植4500cGy照射组处理，完毕后即行标本固定，光镜、电镜观察。对照组鼠不给以干预处理，各组大鼠术后饲养12周进行一般情况观察及大鼠坐骨神经功能测定、胫前肌定量分析与组织学评价。结果：纳入实验大鼠26只，无动物死亡，均进入结果观测与分析。①术后12周单纯手术组和4500cGy照射组的坐骨神经功能指数显著低于对照组正常对照值[（-33．41&;#177;2．99），（-11．23&;#177;2．38），q=22．62，P〈0．05]；[（-34．63&;#177;2．91），（-11．23&;#177;2．38），q=23．87，P〈0．05]。神经纤维数量多于对照组正常值[（192．50&;#177;21．00），（203．00&;#177;16．94），（174．13&;#177;10．18）&;#215;10^2根／mm]。②组织学变化的光镜观察结果：1号鼠神经结构完整，神经纤维排列规则，髓鞘无肿胀；2号鼠4500cGy高能X射线照射后，神经纤维轻度空泡样变，轴索见境界尚清，髓鞘轻度肿胀，无髓鞘脱失。术后12周末对照组为正常神经组织；单纯手术组神经束毛细血管增生不明显，髓鞘无明显肿胀。4500cGy照射组神经纤维粗细基本一致，排列尚规则，少量炎性细胞浸润和纤维组织增生。③坐骨神经的组织学变化的电镜观察结果：1号鼠髓鞘多呈椭圆形，明暗相间板层结构清晰可见，轴索结构完整，神经膜细胞内见丰富的线粒体、粗面内质网等结构。2号鼠可见髓鞘板层结构轻度空泡样变，细胞核基本完好。术后12周末对照组神经呈椭圆形，髓鞘壁薄厚一致，板层结构致密，轴浆内富含神经微丝和微管，许旺细胞核少见；单纯手术组和4500cGy照射组均可见神经轴突发育良好，呈近似椭圆形，髓鞘壁薄，许旺细胞核多见，轴索内见线粒体。结论：经4500cGy高能射线一次照射大自鼠坐骨神经体外节段原位再植。神经干再生结构与功能恢复完全，可最大限度保存神经干再生能力。实验条件下，体外放射灭活处理法作为神经保存的方法是可行的。     

神经生长因子对胎兔许旺细胞培养的影响

目的：应用神经生长因子培养胎兔许旺细胞，观察许旺细胞生长的情况。方法：实验于2002-02／2004-05在河北医科大学第三临床医学院中心实验室和细胞培养室完成。怀孕28d的新西兰白兔，剖腹取出胎兔，取胎兔坐骨神经，剥干净外膜，用植块加差速贴壁联合法培养胎兔许旺细胞，纯化传代后的胎兔许旺细胞分成2组培养，一组加含神经生长因子的培养液，即实验组，另一组加常规培养液，即对照组。细胞传代后24h在每个培养皿中随机选取3个视野。开始初次细胞计数，以后在统一视野每天进行许旺细胞计数。增殖指数=各次观察细胞数／初次观察细胞数。结果：实验用剖腹取出胎兔8只，坐骨神经16根。60个观察视野，均进入结果分析。①在第6天见细胞从胎兔神经组织块周围爬出。②第8天细胞沿组织块向外生长，可见大量梭形的胎兔许旺细胞；第14天植块周围细胞长势最好。③有两种细胞，一种为细胞形态梭形，有突起，多为双极，偶尔可见3个细长突起，胞核呈椭圆形，胞体周围有光晕，即生长晕，为许旺细胞。偶尔可见另一种细胞，胞体大，呈扁平状，外形不规则，突起短而多，细胞核较浅，核仁明显，有2-3个核仁，为成纤维细胞。④根据许旺细胞特有的特征性形态以及细胞免疫组化染色可证实为许旺细胞。⑤实验组许旺细胞的分裂增殖速度明显比对照组加快[传代培养后第3天：（1．41&;#177;0．12），（1．05&;#177;0．10）；第4天：（1．85&;#177;0．26），（1．21&;#177;0．22）；第5天：（2．36&;#177;0．43），（1．23&;#177;0．32）；第6天：（3．52&;#177;0．11），（1．94&;#177;0．33）；第7天：（6．25&;#177;0．38），（3．14&;#177;0．27）。P〈0．0011。结论：用神经生长因子可促进胎兔许旺细胞生长分裂，能够获得大量的胎兔许旺细胞，满足组织工程对许旺细胞的需求；此外胎兔许旺细胞作为组织工程的种子细胞也可以减轻免疫排斥反应的发生。     

面神经端侧与端端吻合的修复效果比较：肌电图评估

目的：比较面神经端侧吻合和端端吻合的效果，探索修复面神经缺损的新方法。方法：实验于2004-04／08在咸宁学院医学院神经组化研究室进行。取日本成年大耳白兔14只，随机分为术后1，3个月组两组各7只。所有兔右侧面区切断面神经上颊支，其远心端吻合到外膜开窗的下颊支侧壁，行端侧神经吻合；左侧面区也切断面神经上颊支，断端间行端端神经吻合。分别于术后1和3个月时做肌电图诱发电位检测神经功能恢复情况，并取材作组织学检测评估其神经再生情况。结果：12只兔进入结果分析。①诱发电位潜伏期：术后3个月组左侧和右侧均短于术后1个月[（1．93&;#177;0．11），（2．68&;#177;0．35）ms；（2．35&;#177;0．07），（4．65&;#177;0．78）ms，P〈0．05]。②波幅：术后3个月组左侧和右侧均高于术后1个月[（9．95&;#177;1．27），（7．12&;#177;1．16）mV；（5．41&;#177;1．40），（1．99&;#177;0．41）mV，P〈0．051。③神经传导速度：术后3个月组左侧和右侧均快于术后1个月[（40．93&;#177;6．19），（29．56&;#177;4．16）m／s；（34．27&;#177;7．23）（20．86&;#177;5．21）m／s，P〈0．051。④再生神经纤维的直径：术后1，3个月组兔左侧均大于右侧[（3．78&;#177;0．52），（2．33&;#177;0．28）μm；（6．25&;#177;0．69），（4．06&;#177;0．73）μm，P〈0．05]。⑤再生神经纤维：术后l，3个月组兔左侧均多于右侧[（637．05&;#177;94．06），（216．33&;#177;35．20）根；（1442．33&;#177;86．34）。（605．83&;#177;143．58）根，P〈0．051。结论：正常神经能发出侧芽通过端侧吻合长入缺损面神经的远残端、使失神经支配面肌再神经化，面神经端侧吻合的效果比端端吻合的效果差，但行端侧吻合修复面神经缺损仍具有一定的临床应用价值。     

兔坐骨神经电损伤后许旺细胞的增殖变化

目的：观察成年兔坐骨神经受到75V电压损伤后受损区域许旺细胞的变化。方法：实验于2004-10／2005-01在解放军第四军医大学唐都医院中心实验室完成。选择中国本兔12只，随机分2组：损伤组9只，正常对照组3只，损伤组观察点为损伤后第3天，第7天，第10天，每个时间点3只。建立兔坐骨神经电损伤实验模型，应用双酶消化法分离受损区域神经许旺细胞，应用细胞计数和同位素^3H掺入胸腺嘧啶核苷观察许旺细胞的增殖变化情况。结果：12只中国本兔均进入结果分析。与正常对照组的细胞数（1．0&;#177;0．15）&;#215;10^4个／mL比较，成年兔在受到损伤后第3天细胞逐渐增多，为（3．2&;#177;0．85）&;#215;10^4个／mL，第7天明显增殖，达到（12&;#177;2．40）&;#215;10^4个／mL，第10天增殖情况较前下降，为（5．4&;#177;0．70）&;#215;10^4个／mL。相应的^3H掺人实验结果表现出同样的变化特征。结论：许旺细胞在神经的溃变和再生过程中，大量增殖，在第7天左右达到其生长和增殖的高峰，而后呈下降趋势。证明许旺细胞在受到一定程度的电压损伤后，依然具有分裂增殖的能力，而它的增殖是受损神经结构和功能恢复的基础。     

神经节苷脂对鼠脑缺血后细胞间黏附分子1及其mRNA表达的影响

目的：探讨神经节苷脂对缺血脑组织中介导炎症病理过程的细胞间黏附分子1及其mRNA表达的影响。方法：实验于2003-08／2004—10在南京脑科医院神经病学研究所进行。取Wistar大鼠60只将大鼠随机分为假手术组、缺血组、再灌注组、缺血＋神经节苷脂组、再灌注＋神经节苷脂组5组，每组12只。①造模：除假手术组外，4组大鼠应用线栓法建立大脑中动脉栓塞／再灌注模型，假手术者栓塞大脑中动脉。缺血时间为缺血90min，再灌注时间为缺血90min再灌24h。②给药：各组于缺血前30min和缺血后即刻经腹腔注射给药，神经节苷脂组给予神经节苷脂组水溶液（30mg／kg），其他各组给予生理盐水1mL。③观察指标：应用反转录-聚合酶链反应及免疫组织化学的方法，观察各组大鼠脑细胞间黏附分子1（面密度表示）及其mRNA[用相对吸光度值（细胞间黏附分子1mRNA平均吸光度值／内参平均吸光度值）来表示]的表达。结果：经补充后60只大鼠进入结果分析。①脑组织细胞间黏附分子1的面密度：在假手术组鼠脑组织呈低表达；再灌注组高于假手术组和再灌注＋神经节苷脂组（0．142&;#177;0．031，0．020&;#177;0．011，0．078&;#177;017,t=44373．154，P〈0．01）。②脑组织细胞间黏附分子1mRNA的相对吸光度值：在假手术组呈低表达；再灌注组高于假手术组和再灌注＋神经节苷脂组（1．364&;#177;0．028，0．266&;#177;0．041．0．791&;#177;0．038．t=2．804．3．542,P〈0．01）。结论：神经节苷脂能显著下调细胞间黏附分子1及其mRNA的表达，减轻脑缺血后炎性病理损害，具有明显的缺血后脑保护作用。