核干细胞因子基因沉默的HL-60细胞在裸鼠体内致瘤性变化

目的探讨核干细胞因子(NS)基因沉默的HL-60细胞在裸鼠体内致瘤性变化。方法体外合成两条短发夹状RNA(NS-shRNA),选择其中沉默NS基因作用强的一条,转染HL-60细胞后接种于裸鼠体内,另设阴性对照组和空白对照组。定期观察裸鼠成瘤情况,并取各组裸鼠的肿瘤组织进行病理切片及HE染色,免疫细胞化学染色法测定NS蛋白。结果 NS-shRNA转染HL-60细胞后接种于裸鼠体内长出肿瘤的时间长于对照组(18～19dvs.14～15d),瘤体肿块明显小于两对照组,肿瘤终体积小于两对照组[(1282.6±434.1)mm3vs.(2533.3±683.1)mm3,(2632.5±621.8)mm3],均存在统计学差异(P<0.05);阴性对照组、空白对照组两组间比较无统计学差异(P>0.05)。转染组结缔组织及血管比阴性对照、空白对照两组少,肿瘤组织中细胞排列松散,留有很多间隙;HL-60细胞大小不均一更明显,核碎裂和小核细胞增多,核染色质致密程度不均一,瘤巨细胞减少。结论 NS基因沉默的HL-60细胞的致瘤能力减弱,可能与NS基因沉默后HL-60细胞的生物学性状改变有关。     

沉默核干细胞因子基因对HL-60白血病细胞形态学和细胞化学影响的检测

目的探讨体外沉默白血病细胞核干细胞因子(NS)基因转染后细胞形态学和细胞化学特征改变与细胞生物学行为的关系。方法体外合成NS特异性短发夹状RNA(shRNA)转染HL-60白血病细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹法评价NS基因沉默和NS蛋白合成抑制效果,倒置显微镜观察活体细胞形态,Wright-Giemsa染色观察细胞形态学改变,血液分析仪测定细胞大小、粒度和均一性变化,髓过氧化物酶(MPO)、α-乙酸萘酯酶(α-NAE)和过碘酸-雪夫反应(PAS)测定反映细胞化学特征变化。结果沉默NS基因导致HL-60白血病细胞发生了形态学变化,细胞核和细胞质出现了进一步分化和成熟特征,Wright-Giemsa染色观察到细胞核碎裂现象,血液分析仪发现细胞变得大小不均并有较多核碎裂和无核的细胞碎片存在,细胞内定MPO、α-NAE酶活性和PAS反应增强。结论沉默NS基因表达能促使HL-60细胞进一步分化、成熟,细胞形态学和细胞化学特征发生相应改变,这些形态学变化可以作为研究细胞生物学行为改变的依据之一。     

沉默核干细胞因子基因对HL-60白血病细胞形态学和细胞化学影响的检测

目的探讨体外沉默白血病细胞核干细胞因子（Ns）基因转染后细胞形态学和细胞化学特征改变与细胞生物学行为的关系。方法体外合成Ns特异性短发夹状RNA（shRNA）转染HL-60白血病细胞,逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）和免疫印迹法评价Ns基因沉默和Ns蛋白合成抑制效果,倒置显微镜观察活体细胞形态,Wright—Giemsa染色观察细胞形态学改变,血液分析仪测定细胞大小、粒度和均-性变化,髓过氧化物酶（MPO）、α-乙酸萘酯酶（α—NAE）和过碘酸-雪夫反应（PAS）测定反映细胞化学特征变化。结果沉默Ns基因导致HL-60白血病细胞发生了形态学变化,细胞核和细胞质出现了进-步分化和成熟特征,Wright—Giemsa染色观察到细胞核碎裂现象,血液分析仪发现细胞变得大小不均并有较多核碎裂和无核的细胞碎片存在,细胞内定MPO、α—NAE酶活性和PAS反应增强。结论沉默Ns基因表达能促使HL-60细胞进-步分化、成熟,细胞形态学和细胞化学特征发生相应改变,这些形态学变化可以作为研究细胞生物学行为改变的依据之一。     

HL-60 细胞 Nucleostemin 表达下调对 PI3K / AKT / mTOR 通路相关分子的影响简

本研究旨在探讨白血病细胞中nucleostemin （NS）基因下调对其非依赖p53通路的候选途径PI3 K/A KT/mTOR的相关分子表达的影响.通过重组慢病毒表达载体NS-RNAi-GV248转染至p53缺失型HL-60细胞以干扰NS基因的表达.用Real-time PCR技术评价转染后HL-60细胞NS基因的表达情况并检测干扰前后PI3 K/AKT/mTOR信号通路中相关分子水平表达的变化.结果表明：重组慢病毒载体NS-RNAi-GV248成功感染了HL-60细胞,在荧光显微镜下可见GFP荧光水平较高,大于80％.Real-time PCR结果显示,NS基因mRNA的抑制率在HL-60细胞中为56.5％;干扰NS的表达后PI3K、AKT和GβL基因mRNA表达量分别为0.491±0.084、0.398±0.164、0.472±0.097,下调明显,与空白对照组（分别为1.002±0.171、1.000±0.411、1.001 ±0.206）比较差异有统计学意义（P＜0.05）.结论：在HL-60细胞中PI3K/AKT/mTOR通路相关分子的变化与NS基因的下调呈正相关,两者的关联性为证明PI3 K/AKT/mTOR信号通路可能是NS的一种非依赖p53作用途径提供了依据.     

抑制p53缺失和突变型白血病细胞PPP2R5A表达后细胞生物学变化

目的探讨在p53缺失和突变型白血病细胞内PPP2R5A表达量的下降与细胞生物学变化之间的关系,为寻找核干细胞因子(NS)的非p53依赖性信号转导通路提供依据。方法利用脂质体转染技术将针对PPP2R5A的siRNA转染到p53缺失或突变型的白血病细胞HL-60、THP-1和Raji细胞内,沉默PPP2R5A基因。RT-PCR法和免疫细胞化学法检测siRNA的转染效果并找出最佳转染浓度和时间。倒置显微镜观察转染组和对照组细胞的生长状态并绘制细胞生长曲线。瑞-吉染色观察转染组和对照组细胞的胞核、染色质及形态改变。流式细胞术AnnexinV/PI双染法进行细胞凋亡分析,PIDNA染色法进行细胞周期测定。结果倒置显微镜观察显示转染后细胞生长状态和形态均出现变化,瑞-吉染色显示转染后细胞有凋亡小体形成。细胞凋亡分析和细胞周期测定显示转染组凋亡细胞百分比率增高,G1期和G2/M期细胞百分比上升,而S期细胞百分比减低,表明细胞增殖减弱。结论抑制p53缺失或突变型白血病细胞PPP2R5A基因后细胞的凋亡、分化有一定变化,提示p53缺失或突变型白血病细胞中PPP2R5A在细胞分化、凋亡调控中扮演一定角色,为验证NS非p53途径的信号通路是否与PPP2R5A有关提供了依据。     

c-myc小干扰RNA诱导人髓系白血病细胞系HL-60细胞凋亡

本研究探讨c-myc小干扰RNA对白血病细胞系HL-60诱导凋亡的作用。将体外合成的siRNA转染HL-60细胞,观察形态学变化,应用MTT法绘制细胞生长曲线,用细胞集落培养观察c-mycsiRNA对HL-60细胞增殖的影响;应用DNA片段化分析细胞的凋亡,RT—PCR及Western blot检测c-mycsiRNA作用前后Comyc基因mRNA及蛋白表达水平的变化。结果表明：ComycsiRNA能明显抑制HL-60细胞增殖,半数抑制浓度（IC50）约为150nmol／L;DNA片段化的检出证实C-mycsiRNA能有效诱导HL-60细胞调亡,凋亡率与药物作用时间呈正相关。C-mycsiRNA与HL-60细胞作用后C-myc基因和蛋白的表达水平与作用时间呈负相关。结论：C-mycsiRNA能有效抑制HL-60细胞增殖,降低C-myc基因和蛋白的表达,诱导其凋亡。     

bcl-2小干扰RNA对HL-60/VCR细胞耐药性逆转的研究

为了探讨以bcl-2基因作为靶分子进行白血病多药耐药基因治疗的可行性,构建bcl-2基因的小干扰RNA载体并将其转导入HL-60/VCR细胞,在G418筛选后应用Western blot进行鉴定;MTT法检测细胞转染前后生长速度和药物敏感性的变化;Western blot检测细胞转染前后凋亡相关蛋白Bax和耐药相关蛋白ZNRD1的表达变化.结果表明：成功构建了bcl-2的小干扰RNA载体并转染HL-60/VCR;经蛋白质水平检测证实成功建立了bcl-2低表达的白血病细胞模型;转染后的细胞对长春新碱和阿霉素的敏感性增强,且低表达耐药相关蛋白ZNRD1.结论：bcl-2小干扰RNA真核表达载体能在一定程度上逆转白血病细胞的耐药性.     

抑制IGFBP-2基因的表达对U251细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨 RNA干扰技术沉默胰岛素生长因子结合蛋白2（IGFBP-2）对胶质瘤细胞株 U251增殖、凋亡的影响,为胶质瘤的基因治疗提供一个可选择的靶点和方法。方法构建靶向 IGFBP-2基因的 RNAi表达载体;采用脂质体法将 siRNA转染U251细胞,设非特异的 siRNA阴性对照组和未转染 siRNA的阴性对照组;采用RT-PCR法半定量检测 siRNA对 IGFBP-2基因表达的抑制作用;用 MTT法测定 U251细胞增殖变化;流式细胞术检测 siRNA诱导细胞凋亡作用。结果构建的 RNAi表达载体抑制了 IGFBP-2基因的表达（P＜0．01）;RNA干扰沉默 IGFBP-2基因可抑制 U251细胞增殖,促进细胞凋亡。结论在细胞水平上,构建的靶向 IGFBP-2的 siRNA可明显抑制 IG-FBP-2基因的表达,导致胶质瘤细胞凋亡率明显上升（P＜0．01）,为进一步利用 RNA干扰进行胶质瘤的基因治疗研究奠定基础。     

shRNA干扰NOTCH1基因对套细胞淋巴瘤Akt/mTOR信号通路的影响

本研究旨在探讨RNA干扰沉默NOTCH1基因对套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞株的增殖、凋亡及Akt/m TOR信号通路的影响。针对NOTCH1基因设计短发夹RNA并将其连入p GPU6/GFP/Neo质粒中,构建NOTCH1 shRNA真核表达载体,经脂质体转染入Jeko-1细胞;应用RT-PCR及Western blot鉴定其干扰效果,M TT法绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞凋亡的变化,Western blot检测凋亡相关蛋白BCL-2、BAX、procaspase-3、procaspase-9及Akt/mTOR信号通路相关蛋白Akt、p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K的表达。结果表明：NOTCH1 shRNA转染Jeko-1细胞后,NOTCH1基因的mRNA和蛋白表达均明显下调,有统计学差异（P〈0.05）;转染组增殖率明显低于NegshRNA组和空白组（P〈0.05）,NOTCH1 shRNA转染48 h后,凋亡率为（34.58±3.46）%,而Neg-shRNA组和空白组分别为（2.44±1.35）%、（1.72±0.64）%,有统计学差异（P〈0.05）;凋亡相关蛋白BCL-2、procaspase-3、procaspase-9的表达下调,而BAX表达上调;干扰NOTCH1基因后Akt总蛋白未见明显变化,而p-Akt、p-mTOR、pP70S6K的表达下降。结论：干扰沉默NOTCH1基因可抑制套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞增殖,诱导细胞凋亡,通过去磷酸化抑制Akt/mTOR信号通路可能是其机制之一。     

核干细胞因子RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建核干细胞因子基因RNA干扰（RNA interference,RNAi）慢病毒表达载体并对其在白血病细胞株中的干扰效果进行鉴定,为后期研究奠定基础.方法 针对核干细胞因子基因的序列设计RNAi有效靶点,合成含RNA干扰序列、Loop环、Age I和EcoR I酶切位点,以及终止信号的单链DNA oligo,经退火形成双链DNA,与双酶切线性化的带有GFP荧光标记和嘌呤霉素抗性标记的GV248慢病毒空载体进行连接产生重组慢病毒载体,转化感受态细菌,挑取重组阳性转化子进行菌落PCR反应,并对PCR阳性克隆进行测序.将重组慢病毒载体及其两种辅助包装原件载体质粒pHelper1.0和pHelper2.0共转染293T细胞进行病毒的包装,收集、浓缩病毒液后测定其滴度,并转染HL-60、NB4以及K562等三种人白血病细胞株,倒置荧光显微镜下观察其转染效率,real-time PCR检测核干细胞因子基因的敲减效率.结果 经测序证实正确构建出了核干细胞因子基因的RNAi重组慢病毒载体,包装、浓缩后其滴度为4×108 TU/ml,荧光显微镜下显示其能有效转染进入HL-60、NB4及K562等白血病细胞株中,转染效率均在80％以上;real-time PCR显示转染后核干细胞因子基因mRNA表达水平较阴性对照组显著下降（P＜0.05）,在HL-60、NB4和K562细胞中核干细胞因子基因的抑制效率分别为52.3％、80.5％、62.3％.结论 成功构建出了核干细胞因子基因的RNAi慢病毒载体,其能有效干扰人白血病细胞株HL-60、NB4及K562中的核干细胞因子基因表达.     

siRNA沉默PTTG基因对人胰腺癌细胞PANC-1细胞凋亡的影响

目的研究PTTG基因沉默对胰腺癌细胞凋亡的影响,初步探讨其调控机制。方法利用阳离子脂质体进行基因沉默实验,将PANC-1细胞分为三组（①.未转染PANC-1细胞、②.转染阴性对照siRNA、③转染siRNA-PTTG）,TUNEL染色法检测细胞凋亡;RT-PCR和Western blot技术检测bcl-2,bax基因和蛋白表达;ELISA法检测caspase-3活性。结果组③细胞凋亡明显增多,凋亡率为18.4±2.4%;组①和组②凋亡率分别为7.5±2.0%和6.9±1.1%,差异具有显著性（P〈0.05）;组③bcl-2 mRNA和蛋白表达水平下降,与组①和组②比较差异具有统计学意义（P〈0.05）;组③、组①和组②间bax mRNA和蛋白表达没有具有统计学差异（P〈0.05）;组③caspase-3活性升高,与组①和组②比较差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论 siRNA-PTTG下调PTTG基因表达导致PANC-1细胞凋亡增加,可能与bcl-2表达下调,caspase-3活性升高有关。     

NF-κB在Caski细胞DEK基因沉默中的作用研究

目的研究NF-κB在宫颈癌DEK基因沉默中作用。方法实验分转染psiRNA-hHDEK组、转染psiRNA-hH1neo组及未转染组,采用免疫细胞化学染色和western blot方法,观察三组细胞NF-κB的表达情况。结果 psiRNA-hHDEK转染组CaSki细胞NF-κB蛋白表达明显增加;经显微图像分析测定转染psiRNA-hHDEK组阳性细胞百分率明显高于未转染组[(74.2±8.1)%vs(11.7±2.6)%]和转染psiRNA-hH1neo组[(74.2±8.1)%vs(21.6±3.9)%]。结论 DEK基因沉默后CaSki细胞内NF-κB表达上调,DEK负性调控宫颈癌细胞中NF-κB表达,从而发挥其衰老抑制基因及凋亡抑制基因的作用。     

吉西他滨对HL-60细胞c-myc基因表达的影响及其诱导细胞凋亡作用

本研究探讨吉西他滨对HL-60细胞c-myc基因表达及细胞凋亡的影响及吉西他滨应用于白血病治疗的可行性。体外培养人白血病细胞系HL-60细胞,以不同浓度吉西他滨作用于HL-60细胞,用RT-PCR方法检测细胞c-myc mRNA表达的变化;以Western blot方法检测细胞C-MYC蛋白表达水平;原位酶标记法(TUNEL法)检测细胞凋亡情况。结果表明,1.0μg/ml吉西他滨作用于HL-60细胞12、24、36、48小时后,不同程度地抑制HL-60细胞c-myc mRNA的表达,并具有时间依赖性,其最适作用时间为24小时,与阿糖胞苷(Ara-C)组及空白对照组比较,抑制作用差异有统计学意义(p0.05)。1.0μg/ml吉西他滨作用于HL-60细胞24、48、72小时后,C-MYC蛋白表达水平明显下降,于48小时抑制作用最明显,抑制率为94.16%,方差分析显示,各时间点吉西他滨组与空白对照组和Ara-C组比较,差异均有统计学意义(p0.01);吉西他滨作用24小时组、48小时组及72小时组组间比较,也有显著性差异(p0.01)。1.0μg/ml吉西他滨作用于HL-60细胞24小时后,出现明显的诱导细胞凋亡作用,阳性率83.67%,与空白对照组(阳性率3.00%)和Ara-C组(阳性率10.67%)比较差异均有统计学意义(p0.01)。结论:吉西他滨对HL-60细胞c-myc基因及C-MYC蛋白表达有显著的抑制作用,能够诱导HL-60细胞凋亡,其抑制及诱导凋亡作用强于阿糖胞苷,提示吉西他滨可能作为白血病治疗的新选择。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B对肝细胞凋亡的影响

目的：探讨丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B在原发性肝癌发生中的作用,及其发生机制。方法：设置对照组、空白载体PCXN2组、转染NS4B组。使用脂质体介导法,转染丙型肝炎病毒非结构蛋白重组质粒NS4B进入Chang肝细胞内,并用G418筛选。绘制生长曲线,分别用流式细胞仪检测瞬时表达及稳定表达时肝细胞凋亡率,用均数±标准差表示,统计学分析采用Dunnettt检验及q检验。结果：瞬时表达各组（PCXN2,NS4B）凋亡率分别为：（9.18±0.60）%,（4.45±0.53）%。稳定表达各组（PCXN2,NS4B）凋亡率分别为：（15.75±2.09）%,（3.66±0.34）%。与PCXN2组比较P〈0.01。结论：NS4B抑制肝细胞凋亡率,可能导致肝细胞异常增殖,诱导肝癌发生。     

三氧化二砷对白血病HL-60细胞株的凋亡作用

目的：探讨三氧化二砷对HL-60的诱导凋亡作用。方法：琼脂糖电泳检测DNA条带;Hoecst 33258染色后荧光显微镜观察细胞核的变化。用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果：10μmol/L三氧化二砷处理HL-60细胞24~48 h可见到DNA出现梯形条带;处理24~48 h HL-60细胞核呈现细胞核浓缩和核碎裂现象。流式细胞仪测定12、24、和48 h的细胞凋亡率分别为（8.5±2.1）%、（12.8±3.4）%及（21.4±5.8）%,而培养48 h的HL-60细胞自然凋亡率仅为（1.5±0.5）%（P〈0.05）。结论：三氧化二砷可诱导HL-60细胞凋亡。     

Xbp-1基因沉默对硼替佐米诱导人多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响

本研究旨在探讨xbp-1基因沉默对硼替佐米诱导骨髓瘤细胞株NCI-H929(H929)凋亡的影响。通过小发夹RNA(shRNA)干扰xbp-1基因表达,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测靶细胞凋亡率,采用Wes-ternblot检测XBP-1蛋白水平。结果表明:通过慢病毒载体PLL3.7介导的xbp-1 shRNA表达,能有效抑制H929细胞XBP-1蛋白表达,xbp-1 shRNA表达细胞的凋亡率显著高于对照组[(10.13±0.61)%vs(2.5±0.2)%,p0.05];经硼替佐米处理后,xbp-1基因功能缺陷的H929细胞的凋亡率显著高于空载体组[(45.07±1)%vs(2.73±0.25)%,p0.05]。结论:xbp-1基因沉默能够显著增强硼替佐米对多发性骨髓瘤细胞的促凋亡活性。