液相色谱串联质谱法测定人血浆中替考拉宁的血药浓度

目的:建立测定人血浆中替考拉宁浓度的液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)测定方法。方法:选用Welch Ultimate XB-C₁₈(2.1 mm×50 mm,5.0 μm)色谱柱,以达托霉素为内标,以含0.1%甲酸的水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱,柱温为40 ℃。利用乙腈进行沉淀蛋白样品前处理,采用电喷雾离子化多反应监测正离子模式,测定替考拉宁A_2-1、A_2-2、A_2-3、A_2-4和A_2-5 5种主要成分的总浓度。结果:替考拉宁的总浓度线性范围为1~60 μg·mL^-1,定量下限为1 μg·mL^-1,日内和日间精密度RSD均小于15%,提取回收率80.04%~96.02%,内标归一化基质效应为90.12%~104.04%。研究测定了16例给予替考拉宁后患者的血药谷浓度,浓度范围从定量下限至31.2 μg·mL^-1,达标率56.25%,患者个体差异大且初始达标率低。结论:该研究建立了一种快速、简便、稳定的LC-MS/MS测定人血浆中替考拉宁血药浓度的方法,具有较高准确度、精密度和回收率,为临床给药方案的优化奠定基础。     

UPLC-MS/MS法与ELISA法测定胖大海中黄曲霉毒素的比较研究

目的 采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)和酶联免疫吸附法(ELISA)对胖大海中的黄曲霉毒素进行检测，比较 两种方法的检测结果以及方法学差异性。方法UPLC-MS/MS法测定：样品采用70%甲醇提取经过免疫亲和柱净化，色谱柱为C₁₈(100 mm×2.1 mm,1.7μm)，柱温为40℃，流动相为水含0.1%甲酸(A)-甲醇含0.1%甲酸(B)，梯度洗脱，流速为0.3 m L·min^-1，多反应检测扫描采集模式，正负离子同时扫描进行数据采集。同时采用ELISA法测定，样品采用甲醇提取，酶联免疫试剂盒反应。结果 UPLC-MS/MS法测定：黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂线性关系良好，检测限分别为0.013 5,0.002 9,0.008 6,0.003 6μg·kg^-1，定量限分别为0.045 0,0.009 8,0.028 6,0.011 9μg·kg^-1，平均回收率分别为98.98%,10...     

高氧对幽门螺杆菌的清除作用及基于脂质组学的机制

目的 研究高氧对幽门螺杆菌(Hp)的清除作用,并基于脂质组学探讨其可能机制。方法 (1)高氧对Hp的清除作用。将过氧化氢300 g·L^-1加入生理盐水配制成含氧量为13～416 mg·L^-1高氧水溶液。将Hp分为Hp对照组(等体积生理盐水)、枸橼酸铋钾组(7.3 g·L^-1)及高氧组(高氧溶液13,26,52,104,208和416 mg·L^-1)。各组Hp置微需氧环境培养5 d后,紫外分光光度法检测菌落洗脱液在600 nm吸光度(A_{600 nm})值。蒙古沙鼠ig给予Hp 1×10¹¹CFU·L^-1悬液,每天1次,连续20 d,建立蒙古沙鼠Hp感染模型;选取60只感染模型沙鼠,分为Hp模型组(等体积生理盐水)、Hp模型+高氧(高氧溶液26 mg·L^-1)组、Hp模型+三联药物组(克拉霉素8.3 g·L^-1、枸橼酸铋钾7.3 g·L^-1和替硝唑16.6 g·L^-...     

报告基因法测定重组人白细胞介素-2产品生物学活性的研究

目的:建立测定重组人白介素-2(recombinant human interleukin-2, rhIL-2)制品生物学活性的报告基因法(reporter gene assay, RGA)。方法:根据ICH Q2和《中华人民共和国药典》 2020年版指导原则,构建慢病毒转染表达荧光素酶(luciferase, Luc)的C8166细胞,进行rhIL-2生物学活性测定方法学优化与验证,优化内容包括孵育时间、细胞数量、待测样品的初始浓度和稀释比例;验证内容包括特异性、线性和准确性、精密度和耐用性。结果:优化后的检测条件为：孵育时间为24 h;细胞接种密度为1×10⁵细胞·孔^-1;待测样品以10 000 IU·mL^-1为起始浓度1∶3稀释10个梯度。荧光信号值强度与待测样品浓度拟合四参数曲线,计算相对效价。选用不同作用类型的细胞因子进行特异性验证均符合应用要求。采用50%,75%,100%,125%和150%的5个浓度点验证线性和部分准确性,实测与理论效价线性回归分析相关系数R²=0.993 1,各浓度...     

细胞色素P450 3A4酶介导的水飞蓟素对吉非替尼代谢的影响

目的 考察人混合肝微粒体中吉非替尼的酶促反应动力学,探究水飞蓟素对吉非替尼代谢的影响。方法 建立吉非替尼人肝微粒体体外孵育体系,用LC-MS/MS法测定体系中吉非替尼的剩余浓度,计算酶促反应动力学参数,如米氏常数(K_m)、最大反应速率(V_max)以及固有清除率(CL_int)。将系列浓度的水飞蓟素与吉非替尼共同孵育,测定水飞蓟素对吉非替尼代谢的半数抑制浓度(IC₅₀)。结果 在体外人肝微粒体中,测得吉非替尼的K_m为57.12μmol·L^-1,V_max为21.09 nmol·min^-1·mg protein^-1,CL_int为0.37 mL·min^-1·mg^-1。水飞蓟素在0.5～50.0μg·mL^-1内对吉非替尼的代谢具有剂量依赖性的抑制作用,其IC₅₀值为20.74μg·mL^...     

A型肉毒杆菌素注射液矫正前额皱纹

A型肉毒毒素(botulinumtoxin,BTX-A)是一种神经毒素,临床将A型肉毒杆菌素注射液注射于皱纹肌和降眉间肌矫正前额皱纹,取得了很好的疗效。本文于2000～2004年8月对临床57位患者的治疗结果进行观察分析,现报告如下:1资料与方法1.1一般资料57例患者,其中女46例,男11例,年龄30～55岁。1.2方法A型肉毒杆菌素系兰州生物制品研究所生产,商品名“衡力”。使用前放置在-5～-20℃保存,用生理盐水稀释后在2～8℃下4h以内用完,否则影响效价。每瓶用2.5ml生理盐水稀释,稀释后浓度为每0.1ml含4u肉毒杆菌素。注射部位分别位于皱眉肌和降眉间肌,注射时让…     

HPLC-ESI-MS/MS同时测定癫痫患儿血浆中丙戊酸、苯巴比妥和托吡酯的药物浓度

目的建立基于高效液相色谱串联质谱技术(HPLC-ESI-MS/MS)同时测定癫痫患儿血浆中丙戊酸、苯巴比妥和托吡酯浓度的方法,用于癫痫患儿的血药浓度监测及结果分析。方法样品用有机溶剂沉淀蛋白法进行前处理,分别以丙戊酸-D6、托吡酯-D12、苯巴比妥-D5为内标,采用Phenomenex Kinetex^?EVO C₁₈色谱柱(2.1 mm×50 mm,2.6μm),以0.07%甲酸-1 mmol乙酸铵-水(A)和甲醇(B)作为流动相进行梯度洗脱,流速为0.5 mL·min^-1。质谱检测系统采用电喷雾离子源负离子模式,多离子反应监测模式扫描。考察该方法的专属性、定量下限(LLOQ)、标准曲线、残留效应、稀释效应、准确度、精密度、基质效应和稳定性。结果丙戊酸在0.6～120μg·mL^-1线性关系良好(r=0.998 9),LLOQ为0.6μg·mL^-1;苯巴比妥在0.25～50μg·mL^-1线性关系良好(r=0.999 1),LLOQ为0.25μg·mL     

用高效液相色谱-质谱联用法测定人血浆中尼洛替尼的浓度

目的 建立一种测定人血浆中尼洛替尼浓度的液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)检测方法,并应用于尼洛替尼健康受试者体内药代动力学研究。方法 以[¹³C,²H₃]-Nilotinib为内标,血浆样品经甲醇沉淀蛋白后,以甲醇-2 mmoL·L^-1醋酸铵水溶液(含0.1%甲酸)=66∶34 (v/v)为流动相,Agilent公司ZORBAX Eclipse plus C₈ (4.6 mm×100.0 mm, 3.5μm)色谱柱分离,流速为700μL·min^-1,每个样品的分析时间为10.0 min。样品经电喷雾离子源正离子化后,通过三重四极杆串联质谱仪,多反应监测模式。考察该方法的专属性、标准曲线与定量下限、精密度与回收率、稳定性、基质效应和残留效应。结果 尼洛替尼的血浆浓度在2.50～2 000.00 ng·mL^-1内线性良好,批内、批间精密度均在1.10%～6.70%,相对偏差在±15%范围内。尼洛替尼血浆样品室温放置24 h,反复冻...     

建立UPLC-MS/MS法测定急性髓系白血病患者维奈克拉血药浓度

目的 建立超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法测定急性髓系白血病患者维奈克拉血药浓度。方法 用乙腈为沉淀剂沉淀蛋白,采用Waters Xevo TQ-S cronos/H-Class Plus三重四极杆超高效液相色谱质谱仪进行检测。采用C₁₈色谱柱(50mm×2.1mm,1.7μm)进行色谱分离,流动相：0.1%甲酸(A)-100%乙腈(B),流速0.4mL·min^-1,梯度洗脱。使用电喷雾离子源和正离子反应监测模式进行监测反应。定量分析离子对为m/z 868.5→321.0(ESI⁺),外标-标准曲线法进行定量分析。结果维奈克拉标准曲线方程为Y=10.900 7X-221.636。维奈克拉在线性范围125～800 0 ng·mL^-1(r=0.998 3)内线性关系良好,定量下限、低、中、高浓度的质控样品所测得的日内精密度分别为12.41%、10.57%、5.13%、6.19%;日间精密度分别为11.70%、6.84%、4.14%、6.97%。回收率均≥90%。在室温下放置6h,在4℃...     

门冬酰胺酶效价和纯度测定方法研究

目的:建立和优化鉴别、纯度和效价测定等质量控制方法,提高和完善大肠埃希菌(Escherichia coli)、欧文氏菌(Erwinia carotovora)来源的门冬酰胺酶的质量标准。方法:考察了Xbridge protein BEH SEC(300 mm×7.8 mm, 3.5μm, 200?)和TSK G3000swxl(300 mm×7.8 mm, 5μm)2款色谱柱在纯度测定方法中的分离情况,并对流动相进行了优化;考察了效价测定方法中反应的量效关系和线性范围,探讨了斜率比模型和标准曲线法的效价计算方式。结果:以0.1 mol·L^-1磷酸盐缓冲液(pH 6.7)为流动相,采用Xbridge protein BEH SEC色谱柱进行分离,主峰前后各杂质峰分离度有了较大改善。2种菌种来源的门冬酰胺酶效价反应剂量在2～30 U·mL^-1范围内均呈直线反应,r均大于0.995,标准曲线测定方法更为简单、准确,样品采用高低双剂量可以有效消除实验误差,双剂量测定偏差可小于±2.0%。结论:与绝对法相比,相对法在效价测定的准确度和重现性方面都有较大...     

抗蛋白酶3抗体检测及影响因素的研究

目的研究血清样本稀释度、封闭液、孵育条件、洗涤条件及酶标板包被后保存时间对血清抗蛋白酶3(PR3)抗体检测结果的影响。方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对159份血清进行抗PR3抗体检测,并用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析确定阳性界限(cut-off)值。结果血清样本最佳稀释度为1∶50;5%脱脂奶粉封闭酶标板能有效地降低本底值;孵育缓冲液中加入牛血清白蛋白及脱脂奶粉比单用磷酸盐缓冲液(PBS)对测定值有明显影响。经ROC曲线分析实验的阳性临界值为正常阴性对照吸光度(A)值的2.5倍,灵敏度和特异性分别为84.62%和98.46%。结论血清抗PR3检测结果受血清样品稀释、封闭液、孵育条件及阳性临界值的选择等多因素的影响。     

用酶标记法测定肉毒A型毒素

本文系用酶联免疫吸附测定法(ELISA)的双夹心技术定量测定肉毒A型毒素的初步报告。具体方法是:在聚苯乙烯管内加入1ml(10μg)抗肉毒A型马血清,室温旋转过     

以CD79b为靶点抗体偶联药物结合活性的评价研究

目的:建立抗CD79b单抗及抗CD79b单抗-vc-MMAE的表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR)法和酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法评价其结合活性。方法:采用SPR法,使用Protein A芯片,测定抗CD79b单抗及抗CD79b单抗-vc-MMAE与其靶点CD79b蛋白之间的动力学常数包括结合常数(K_a)和解离常数(K_d)、亲和力常数(K_D)、半最大效应浓度(half maximal effective concentration, EC₅₀)及相对效价;采用经典ELISA法测定抗CD79b单抗及抗CD79b单抗-vc-MMAE与CD79b的EC₅₀及相对效价。结果:经3次实验测定,抗CD79b单抗与CD79b的K_a为(2.61±0.14)×10⁶ L·mol^-1·s^-1,K<...     

免疫比浊法测定血清淀粉样蛋白A的钩状效应及其解决方案

目的探讨研制的血清淀粉样蛋白A(SAA)试剂盒的钩状效应及其解决方法。方法以83个西门子定值血清为研究对象,分析研制的SAA试剂盒的线性范围、准确度和精密度等性能;用试剂盒检测超高值血清样本,验证是否存在钩状效应,并研究稀释法能否解决钩状效应。结果 SAA试剂盒线性范围为1～200 mg/L,测定值与样本定值之间的偏差在20%以内,精密度CV均3.0%。浓度超出200 mg/L样本的实测值明显低于定值,浓度范围在1～1000 mg/L的拟合曲线未出现明显的下降趋势,而1～2000 mg/L、1～3000 mg/L拟合曲线出现明显的下降趋势,存在钩状效应。用稀释法测定异常值样本,测定值与定值相近。结论所发现的非正常测定值由钩状效应所致,稀释法能够解决钩状效应问题。     

HPLC-MS/MS法考察水黄皮素在SD大鼠体内的药代动力学特征

目的：建立大鼠血浆中水黄皮素的定量分析方法,并对其药代动力学进行研究。方法：通过灌胃给予SD大鼠水黄皮素(10 mg·kg^-1),血浆样品经蛋白沉淀法处理后进行HPLC-MS/MS定量分析,以五味子醇甲为内标,采用Agilent Poroshell 120 EC-C₁₈(50 mm×3.0 mm,2.7μm)色谱柱,乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)为流动相,流速0.3 mL·min^-1,梯度洗脱;采用电喷雾离子源(ESI),正离子多反应监测模式(MRM)扫描,水黄皮素[M+H]⁺m/z 293.1→277.0,五味子醇甲[M+H]⁺m/z433.2→384.2;使用DAS软件计算相关药代动力学参数。结果：在1.5625～1600 ng·mL^-1浓度范围内,水黄皮素线性关系良好(r=0.9997),定量下限为1.5625 ng·mL^-1,精密度RSD和准确度RE均小于20%;低、中、高质控样品精密度RSD和准确度RE均小于15%,提取...     

ELISA法测定大鼠血浆中抗体偶联药物浓度及药代动力学研究

目的:建立检测大鼠血浆中抗体偶联药物(ADC006M)[重组抗人表皮生长因子受体2(HER2)结构域Ⅱ人源化单克隆抗体-单甲基澳瑞他汀E(MMAE)偶联剂]浓度的酶联免疫吸附分析法(ELISA),并用于研究单次静脉注射的药代动力学特征。方法:基于ELISA的检测原理，在96孔板上预先包被抗MMAE抗体，加入待测样品，用HRP标记的抗体B1G7(B1G7-HRP)进行检测，加入TMB底物显色，终止反应后，在酶标仪450 nm/630 nm波长处读取吸收度(A),并参考相关法规进行方法学验证。同时，单次静脉注射给予SD大鼠5 mg·kg^-1ADC006M测定其血浆浓度，对测定结果进行曲线拟合并计算药代动力学参数。结果:确定方法的线性范围为31.25～2 000 ng·mL^-1,定量限为31.25 ng·mL^-1;方法批内、批间准确度RE分别在-14.6%～12.6%和-13.1%～-0.7%,批内、批间精密度RSD均≤12.6%;方法的选择性(基质效应)、特异性、稀释线性与钩状效应以及各项稳定性考察结果均良好。通过对SD大鼠...     

乙酰吉他霉素干混悬剂对肺炎支原体的体外抗菌作用

目的:探讨乙酰吉他霉素干混悬剂对肺炎支原体(MP)的体外抗菌作用。方法:选择2016—2019年本实验室保存的呼吸系统感染患者的MP临床分离株51株，以阿奇霉素、红霉素对照药物，采用微量倍比稀释法测定乙酰吉他霉素干混悬剂对MP的体外最低抑菌浓度(MIC)。结果:51株临床分离株中，43例耐药株，含23SrRNA 2063位点突变，8例敏感株，无耐药相关位点突变。微量倍比稀释法的结果显示：乙酰吉他霉素干混悬剂对MP标准株FH和M129的MIC值均为0.125 mg·L^-1,对MP临床耐药株的MIC值为8～32 mg·L^-1,MIC₅₀为16 mg·L^-1,MIC₉₀为32 mg·L^-1;对MP临床敏感株的MIC值为0.063～0.125 mg·L^-1, MIC₅₀和MIC₉₀均为0.125 mg·L^-1。红霉素对MP临床耐药株MIC范围为256～1 024 mg·L     

复方丹皮酚纳米乳对裸鼠体内人源肺癌A549的影响

目的研究复方丹皮酚纳米乳对裸鼠体内人源肺癌A549的影响及部分机制研究。方法建立裸鼠人源肺癌A₅₄₉移植瘤模型,灌胃给予不同剂量的复方丹皮酚纳米乳(48、96和192 mg·kg^-1),观察其对A₅₄₉移植瘤的治疗作用,每5 d使用游标卡尺测量裸鼠移植瘤的最长径和最短径,动态观察裸鼠移植瘤的生长情况,并计算其体积,以此绘出裸鼠移植瘤生长曲线。通过酶联免疫吸附法测定血清中白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的水平,初步探讨其作用机制。结果所有治疗组均对裸鼠A549移植瘤肿瘤体积、肿瘤体积增长率有一定的抑制作用,且随剂量的增加,抑制作用更强;与荷瘤对照组比较,复方丹皮酚纳米乳高剂量组和康莱特注射液组血清白细胞介素2表达明显升高(P<0.01、P<0.01),复方丹皮酚纳米乳中、高剂量组和康莱特注射液组肿瘤坏死因子α表达水平明显升高(P<0.05、P<0.01、P<0.01)。结论复方丹皮酚纳米乳对人源肺癌A₅₄₉裸鼠移植瘤具有一定的抑制作用,其作用机制可能与促进细胞因子白细胞介素2和肿瘤坏死因子α的表达有关。     

用高效液相色谱-同位素稀释质谱法测定川崎病患儿血浆中阿司匹林和水杨酸的药物浓度

目的 建立高效液相色谱-同位素稀释质谱(HPLC-IDMS)法测定川崎病患儿血浆中阿司匹林(ASP)和水杨酸(SA)浓度的方法。方法 血浆样品经有机溶剂沉淀蛋白后,分别以ASP-D4和SA-D4为内标,采用Phenomenex Kinetex~? XB C18色谱柱(2.6 mm×50.0 mm, 3.0μm),以0.1%甲酸-水(A)和乙腈(B)作为流动相进行梯度洗脱,流速为0.5 mL·min^-1,进样量为6μL。质谱检测方式为负离子模式,多反应监测扫描。结果 ASP在1.02～4 000 ng·mL^-1线性关系良好(r²=0.995 4),定量下限(LLOQ)为1.02 ng·mL^-1。SA在1.28～5 000 ng·mL^-1线性关系良好(r²=0.998 5),LLOQ为1.28 ng·mL^-1。准确度、精密度、基质效应和稳定性均符合《中国药典》(2020年版)规定。结论 该方法操作简便快速稳定,灵敏度专属性高,可用于ASP...     

七叶皂苷钠对氧化型低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

目的 研究七叶皂苷钠(SA)对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响及其机制。方法 将体外培养的人主动脉血管平滑肌细胞(HA-VSMC)随机分为对照组(正常培养不做处理)、模型组(以100μg·mL^-1 ox-LDL处理24 h)和低、中、高剂量实验组(在ox-LDL处理的基础上分别以0.4,1.6和6.4μg·mL^-1的SA处理24 h)。用噻唑蓝(MTT)实验检测细胞增殖，以划痕愈合实验检测细胞迁移，以酶联免疫吸附(ELISA)法检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)和超氧化物歧化酶(SOD)水平，用蛋白质印迹法检测蛋白激酶B(Akt)/核因子-κB(NF-κB)信号通路相关蛋白表达。结果 对照组、模型组和低、中、高剂量实验组细胞OD_{450 nm}值分别为0.31±0.03、0.90±0.06、0.76±0.06、0.54±0.04、0.36±0.02,迁移率分别为(56.36±3.38)%、(87.02±6.58)%、(78.74±4.55)%、(69.98±3.48)%、(62.68±4....