一起入境航班关联新冠肺炎聚集性疫情病毒全基因组特征分析

目的分析2021年8月北京市一起入境航班关联新冠肺炎聚集性疫情中新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)基因组特征及变异情况, 为疫情防控和风险评估提供参考。方法收集此次疫情全部50例关联病例的呼吸道标本, 使用数字PCR方法对病毒载量进行测定, 使用高通量测序对病毒全基因组进行测定分析, 对基因组数据拼接整理后进行变异位点分析及系统发生分析。结果全部50例样本中病毒载量中位数为5.57×104拷贝/ml(ORF1ab基因)和5.85×104拷贝/ml(N基因)。共测定获得SARS-CoV-2病毒全基因组序列46份, 均为Omicron变异株BA.5分支。其中21例与7例形成两个进化簇, 内部全基因组核苷酸相似度高于99.993%和99.997%。结论该起聚集性疫情可能由两个传播链和其他散在感染共同构成, 疫情病毒为境外流行的Omicron变异株BA.5分支。     

河南省首起奥密克戎COVID-19疫情全基因组特征与溯源分析

目的对河南省首起本土奥密克戎COVID-19确诊病例的呼吸道标本进行SARS-CoV-2全基因组测序, 分析基因组突变及分子溯源情况。方法采用全基因组测序技术对2022年1月7日—1月29日疫情相关的COVID-19病例阳性样本进行全基因组测序和序列比对分析, 分析病毒全基因组序列的一致性和变异进化情况。结果通过SARS-CoV-2基因组高通量测序, 共获得120例病例的SARS-CoV-2全基因组序列, 占安阳COVID-19疫情总病例数的25.64%(120/468)。与武汉参考株(NC₀45512.2)相比, 120例病例的全基因组序列存在57～59个核苷酸突变位点, 在共享57个核苷酸位点的基础上增加1～2个核苷酸突变位点, 均属于VOC/Omicron变异株(BA.1.1进化分支), 基因组序列高度同源。其中, 首发病例A全基因组序列含有57个核苷酸突变位点, 首发病例B全基因组序列在含有57个相同的核苷酸突变位点基础上, 增加1个特有变异位点(C1594T), 提示二者为同一传播链。经中国疾病预防控制中心和河南省疾病预防控制中心与国内本土病例和输入病例...     

Nanopore高通量测序检测呼和浩特市4例SARS-CoV-2感染者病毒基因组

目的对呼和浩特市6例确诊为SARS-CoV-2感染患者进行全基因组测序, 了解病毒特征, 追溯病毒来源。方法采用Nanopore三代高通量测序技术对6份咽拭子样本进行病毒基因组测序, 基于ARTIC病毒基因组组装流程, 使用生物信息学软件将病毒序列与参考序列进行比对, 分析进化情况。结果获得4份样本的全基因组序列, 均属于SARS-CoV-2变异株Delta (B.1.617.2-like), Pangolin分型为AY.122。测序时长1.5 h/样本, 测序长度27 009～29 560 bp, 覆盖度90.32%～98.85%。共鉴定出50个碱基位点突变、46处氨基酸变异, 错义突变占比74%(37/50), 错义突变中以ORF1ab基因占比最高45.95%(17/37)。结论 Nanopore单分子测序技术在病毒全基因组测序中具有读长长、测序时间短的特点。与武汉参考株比对发现, 该病毒的核苷酸位点变异存在多态性, 要密切关注病毒变异情况, 切实做好防控措施。     

奥密克戎BA.2引起的12起云南省边境地区本土疫情首例病例新冠病毒基因特征分析

目的了解云南省边境地区新型冠状病毒肺炎本土疫情特征, 分析感染的新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)基因组变异情况并进行溯源。方法收集2022年2月中旬至4月期间云南省边境地区12起本土疫情首例病例基本信息及标本, 应用全基因组测序技术进行病毒基因序列测定, 通过在线分析平台和软件, 判断病毒型别, 分析病毒突变情况, 结合流调内容, 推测疫情病毒感染来源。结果 12起云南省边境地区本土疫情首例病例职业较多样, 且活动区域均未离开过当地。Pangolin分型结果显示12起疫情SARS-CoV-2基因组均属Omicron (BA.2)变异株, 其中各2起疫情SARS-CoV-2基因组进一步分属BA.2.10和BA.2.3.2进化分支。全基因组核苷酸突变分析表明, 有十起疫情首例病例病毒基因序列存在1个及以上数目的特有核苷酸突变位点, 结合流行病学调查内容, 提示12起疫情可能均存在不同的病毒感染来源。进一步分析氨基酸突变发现, 病例间基因序列除具备进化分支代表性突变位点外, 还具有特有的氨基...     

野生型SARS-CoV-2感染康复者血清中SARS-CoV-2 Omicron突变株BA.1.1.529、BA.2和BA.3的中和抗体评估

目的 分析野生型SARS-CoV-2(2019新型冠状肺炎病毒)感染康复者血清中SARS-CoV-2 Omicron变异株BA.1.1.529、BA.2和BA.3的中和抗体滴度。方法 以8名已从SARS-CoV-2新冠肺炎中恢复的康复者血清为研究对象,采用ELISA方法检测野生型SARS-CoV-2感染康复者血清中SARS-CoV-2 Omicron变异株BA.1.1.529、BA.2和BA.3的中和抗体滴度,并将其与野生株SARS-CoV-2的中和抗体滴度进行对比分析。结果 在野生型SARS-CoV-2感染康复者血清中,SARSCoV-2 Omicron变异株BA.1.1.529中和抗体滴度显著低于野生株SARS-CoV-2中和抗体滴度（P<0.001）,而SARS-CoV-2Omicron的BA.1.1.529、BA.2和BA.3 3个亚系之间的中和抗体滴度无差异。结论 野生型SARS-CoV-2感染康复者血清中SARS-CoV-2 Omicron变异株BA.1.1.529、BA.2和BA.3的中和抗体滴度均较少。提示感染野生株SARS-CoV-2患者康复后可能对Omicro...     

病毒载量对SARS-CoV-2测序准确性的影响

目的评估病毒载量对严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)全基因组测序准确性的影响, 为新冠病毒基因监测提供技术支撑。方法提取3例新冠病毒阳性病例的核酸进行4个梯度稀释处理, 同时提取83例新冠病毒阳性病例的核酸进行验证, 通过测序深度、基因组覆盖率和测序深度均一性等指标对测序结果进行评价。结果病毒载量的改变不能影响原始测序数据的质量, 病毒载量对测序数据的准确性具有一定的影响:当Ct值≤32时, 病毒载量变化对测序深度和基因组覆盖率的影响并不显著, 能够达到全基因组测序目的;当Ct达到38时, 覆盖率急剧下降至50%以下, 无法测到病毒的基因组全长。结论通过评估病毒载量对SARS-CoV-2的测序准确性的影响, 我们建议选取Ct值≤32的样本, 产生的测序数据的全基因组覆盖率能够满足后续分析要求。     

云南省一株柯萨奇病毒B组5型分离株的全基因组解析

目的对云南省2022年一例流感样病例的咽拭子分离得到的柯萨奇病毒B组5型(coxsackievirus B5, CVB5)病毒株进行全基因组测序, 并分析其遗传进化、基因突变和重组特征。方法通过人宫颈癌细胞培养获得病毒分离株, 应用全基因组测序技术对分离株进行病毒基因序列测定, 采用MEGA、RDP4及SimPlot软件, 解析病毒基因组学特征。结果分离株YN-01/CHN/2022与2株广东CVB5流行株核苷酸同源性为96.6%, 属GⅠ.C1分支, 与国内大多其他CVB5流行株相似度低(≤90.3%), 揭示国内CVB5流行株间基因组差异较大。该分离株VP1序列存在2个特有的氨基酸突变(T246A和T275A), 但其95位氨基酸未发生改变。基因重组分析显示YN-01/CHN/2022可能为重组株, 重组位点发生在P1区VP4(940)和P2区2A(3 540)。结论本研究分离株YN-01/CHN/2022属于CVB5 GⅠ.C1基因型, 存在特异的核苷酸分歧, 也证实了CVB5基因组有重组现象发生。该数据提示增强CVB5分子流行病学研究工作, 持续追踪病毒进化规律, 不断提高相关...     

全基因组测序在环境样本新型冠状病毒检测中的应用

目的:通过对环境样本进行全基因组测序,为全基因组测序在检测环境标本中SARS-CoV-2的应用提供实践基础,为新冠肺炎疫情的溯源和防控工作提供科学依据.方法:采用新冠病毒全基因组靶向扩增结合Illumina二代测序的技术对5例SARS-CoV-2核酸阳性环境样本进行全基因组测序,应用多种分析软件及在线病毒变异分析平台,...     

基于高通量测序技术的发热伴血小板减少综合征病毒全基因组多重PCR测序方法的建立与评价

目的基于二代测序(next generation sequencing, NGS)技术建立一种发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV)基因组的测序方法。方法提取SFTSV阳性血清样本病毒核酸, 利用Primer5.0软件设计SFTSV特异性引物, 构建多重PCR方法对病毒核苷酸序列进行特异性扩增, 利用二代测序仪进行全基因组测序。结果 28份SFTSV阳性血清样本均能进行特异性扩增并获得全序, 覆盖度均超过94%, A型病毒株最多(20株)、其次为B型(4株)、E型(3株)。结论本研究基于多重PCR建立了针对SFTSV的特异性强、质量好的高通量测序方法, 提高了测序效率。     

新冠灭活疫苗序贯免疫对Wuhan-Hu1和Omicron变异株的体液免疫反应

目的研究新冠灭活疫苗序贯免疫策略对Wuhan-Hu1和Omicron变异株中和抗体的影响。方法 BALB/c小鼠免疫两针Wuhan-Hu-1灭活疫苗, 再分别用Omicron或Wuhan-Hu-1灭活疫苗加强免疫, 采用酶联免疫吸附试验检测小鼠血清结合抗体水平;用水疱性口炎病毒假病毒检测系统检测小鼠血清中Omicron变异株中和抗体水平;采用酶联免疫吸附斑点实验检测特异性T细胞反应。结果与免疫一针Wuhan-Hu1灭活疫苗相比, 免疫两针疫苗提高小鼠血清特异性Wuhan-Hu1、Delta和Omicron受体结合域(receptor binding domain, RBD)IgG滴度。与加强免疫Wuhan-Hu1灭活疫苗组相比, 小鼠加强免疫Omicron灭活疫苗后, 血清Wuhan-Hu1和Omicron特异性结合抗体RBD IgG GMT分别提高1.41和1.26倍;针对Omicron变异株BA.1、BA.2、BA.4/5和BF.7的中和抗体GMT分别提高4.5、3.4、12.1和6.5倍。加强免疫Wuhan-Hu1或Omicron灭活疫苗后, 小鼠血清Wu-RBD IgA滴度高于...     

新型冠状病毒奥密克戎变异株无症状感染者新冠病毒全基因组测序分析

目的:了解贵阳市 2022 年 9 月新型冠状病毒奥密克戎变异株引起的本土疫情中,无症状感染者新型冠状病毒(Sever acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)的基因组特征.方法:采用新型冠状病毒全基因组靶向扩增结合Illumina二代测序技术,对 2022 年 9 月贵阳市本土疫情中的 6 例无症状感染者的新型冠状病毒核酸样本进行全基因组测序,采用 Nextclade和Pangolin平台判定病毒谱系及型别,分析病毒的变异特征.结果:成功从 6 例新型冠状病毒无症状感染者样本中获得新型冠状病毒全基因组序列,Nextclade分型结果显示这些序列均属于21L型(Omicron),Pangolin分型结果显示均属于BA.2.76.与新型冠状病毒武汉株(NC_045512.2)相比,感染者1、4有76个核苷酸突变位点,感染者2、5有78个核苷酸突变位点,感染者 3、6 有 77 个核苷酸突变位点,突变主要集中在S区(刺突蛋白区).6 条序列的氨基酸变异位点为分别为56、57个.结论:贵阳市持续开展新型冠状病毒全基因组测序,可及时监测和发现新型冠状病毒变异株,为今后我市新冠疫情精准溯源、风险研判与预警、毒株变异研究等方面提供关键数据支撑.     

新冠病毒感染者病毒RNA脱落时间的影响因素研究

目的了解新冠病毒感染者病毒RNA脱落时间与病毒单核苷酸突变和感染者人口、基础疾病等因素的关系, 为新冠病毒感染动力学的研究提供更多线索。方法收集江苏省2021年7月至9月暴发的一起新冠肺炎聚集性疫情感染者流行病学、临床表现、基础疾病等资料, 采集病例鼻咽拭子样本, 采用二代测序技术对样本进行病毒全基因组测序。利用在线分析平台判断病毒型别、分析突变位点, 利用Cox比例风险模型分析新冠病毒RNA脱落时间与各研究因素的关系。结果本起新冠疫情最终获得病毒全基因组序列的人员350例, 其中女性占60.3%, 年龄中位数49岁[四分位数间距(IQR, 37～65岁)], 中位病毒RNA脱落时间33天(IQR, 26～44天)。全基因组测序分析显示, 同武汉参考株序列相比, 感染者序列存在34～41个核苷酸突变位点, 属于VOC/Delta变异株(B.1.617.2进化分支), C346T、C1060T、T2803C、T7513C、A29681C为本起疫情350例病例新冠病毒基因组序列主要单核苷酸变异位点(SNP)。单因素Cox回归分析显示, 年龄、基础疾病、临床分型、疫苗接种情况、SNP T28...     

货车司机远距离传播新型冠状病毒肺炎事件的分子溯源

目的追溯新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019, COVID-19)病例的感染来源及病毒传播路径, 证实经长途货车司机跨省远距离传播COVID-19事件。方法采用全基因组靶向扩增结合二代测序技术, 对2022年3月福建省泉州市本土疫情暴发期间漳州市报告的5例货车司机COVID-19病例鼻咽拭子标本进行新型冠状病毒(2019 novel coronavirus, 2019-nCoV)全基因组测序, 应用在线分析平台判定病毒型别及突变位点, 利用进化分析软件构建系统发育树, 结合流行病学调查数据, 综合分析病例的感染来源及传播路径。结果成功从5例病例中获得2019-nCoV全基因组序列, 序列长度为29 770～29 839 bp, 基因组平均覆盖度为99.53%;病毒分型结果显示5株病毒均为Omicron变异株, 但分属3种BA.2亚分支;序列分析结果显示3例病毒与2022年3月福建省泉州市本土疫情流行的两种进化分支病毒高度相似, 另2例病毒则与该起疫情流行的病毒存在差异较大(核苷酸突变位点差异7～14个、氨基酸突变位点差异5～7个);进化分析结果表明3例病毒...     

扬州市境外输入4例病例新冠病毒基因特征分析

目的基于高通量测序技术对2022年1月至2022年10月扬州市4例境外输入新冠肺炎病例的咽拭子标本进行全基因组分析, 了解其序列变异情况, 为后续防控策略的调整提供科学依据。方法利用Illumina iseq100和Oxford nanopore平台对扬州市4例境外输入新冠肺炎病例的咽拭子标本分别进行二代及三代高通量测序, 获取全基因组序列, 分析病毒变异位点与谱系型别。结果基于二代测序平台, 4例输入性病例序列长度为29 758 bp～29 861 bp, 全基因组覆盖度为99.46%～99.90%。基于三代测序平台, 4例输入性病例序列长度为29 778 bp～29 831 bp, 全基因组覆盖度为99.65%～99.83%。与武汉参考株(NC₀45512.2)相比, 4例病例序列分别检出核苷酸突变数为66、72、73、76。选取二代测序结果进行系统进化分析表明, 4条序列均与当时流行的新冠病毒变异株奥密克戎亚型相似(BA.1.1、BA.2、BA.2.3和BA.5.2)。结论两种测序平台分析结果基本一致, 4例输入性新冠肺炎患者感染病毒均与奥密克戎变异株相似,...     

两株GI.1型札如病毒全基因组测序及初步分析

目的对GI.1型札如病毒进行全基因组扩增测序尝试并开展初步分析。方法利用本研究设计的GI组札如病毒全基因组5’末端通用引物及杯状病毒3’末端引物, 对本实验室保存的两株GI.1型札如病毒标本进行全基因组扩增, 然后进行文库构建、上机测序及序列组装。通过BioEdit软件进行序列比对分析, 采用MEGA 7.0软件构建进化树进行进化分析。结果两个标本测序质量优异, 测序方法具有可行性;在全基因组(WGS)、NSP基因、VP1基因及VP2基因进化树中, 均归类为GI.1型;位点变异分布于各个基因片段, 但VP1基因的N端保守性较好, 熵值较低;大部分基因的核苷酸突变尤其是NS3、NS5及VP1基因的核苷酸突变以同义突变为主, 未形成相应氨基酸的突变。结论成功地开展了对GI.1型札如病毒全基因组扩增测序及相关进化分析, 为札如病毒的检测提供了新的思路。     

SNaPshot技术检测乙型肝炎病毒基因组P基因区单核苷酸多态性的研究

目的　建立SNaPshot技术对乙型肝炎病毒(HBV)基因组P基因区单核苷酸多态性(SNP)的分析。方法　针对HBVYMDD变异位置的上、下游设计引物,用PCR方法进行DNA扩增,产物直接测序或克隆测序。再针对变异位点74 1A G变异型(YVDD)和74 3G T变异型(YIDD)的紧邻上游设计高度特异的SNaPshot检测引物,用不同荧光标记的ddNTP对PCR产物进行一步延伸,然后置于310型DNA测序仪上观察荧光信号,可直观的检测上述两位点的单核苷酸多态性。结果　在拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者中,经测序证实P基因区不仅存在74 1、74 3位点的变异,还存在5 14C A、5 2 3C A、5 6 2T A、6 6 7C A等位点的变异。对已证实P基因区变异的13例患者血清用SNaPshot技术检测YMDD结果与测序结果完全相同,显示SNaPshot技术高度的特异性。结论　SNaPshot技术检测HBV基因组SNPs具有快速、简便、准确特异的特点,还检测到野生株和变异株的混合存在。     

马尔堡、埃博拉病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立

目的 建立一种快速、敏感、特异的双重实时荧光定量PCR方法,可同时检测马尔堡病毒和埃博拉病毒.方法 通过序列比对挑选出两种病毒基因组中高度保守的序列,分别设计引物及Taqman探针,两条探针分别标记FAM和Texas Red荧光报告基因,建立双重实时荧光定量PCR反应体系.结果 双重荧光定量PCR方法检测两种病毒阳性标准品的灵敏度分别为30.5拷贝/μl和28.6拷贝/μl,通过检测日本脑炎病毒、黄热病毒、登革热病毒无交叉反应,有较好的灵敏度和特异性.结论 建立了马尔堡、埃博拉病毒双重荧光定量PCR检测方法,实现了两种病毒同时实时定量检测,在传染病防控领域有较好的应用前景.     

寨卡病毒、登革病毒、黄热病毒、基孔肯雅病毒微流控荧光定量RT-PCR检测方法的建立及评价

目的 结合微流控与荧光定量RT-PCR技术建立寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)、登革病毒(dengue virus,DENV)、黄热病毒(yellow fever virus,YFV)和基孔肯雅病毒(chikungunya virus,CHIKV)的快速核酸检测方法,以实现这4种病毒感染的快速诊断。方法 以ZIKV的NS1基因、DENV和YFV的NS5基因以及CHIKV的E1基因作为靶序列设计4组特异性引物探针;用体外转录RNA评价方法的灵敏性;用其他病毒核酸评价方法的特异性;ZIKV、YFV、CHIKV检测方法采用模拟阳性样本,DENV检测方法采用临床患者标本进行验证,并与传统荧光定量RT-PCR检测方法进行比较。结果 ZIKV、DENV、YFV、CHIKV4种方法的最低检出限分别是14.57拷贝/μl、94.27拷贝/μl、8.25拷贝/μl、223.19拷贝/μl;4种检测方法与其他病毒核酸无交叉反应;ZIKV、YFV、CHIKV模拟阳性样本检出率为100%,各浓度检测Ct值的变异系数均在2%左右;20份DENV临床患者标本检出率为100%,与传统荧光定量RT-PCR检...     

新型冠状病毒Omicron变异株突变位点研究进展

新型冠状病毒Omicron(B.1.1.529)株于2021年11月在南非首次被发现, 随后逐渐成为全球范围内主流毒株, 并于11月26日被世界卫生组织定义为第5种关切变异株(variants of concern, VOCs)。本文从新型冠状病毒基因组和蛋白质结构、核酸位点突变和氨基酸位点突变等方面总结了Omicron株的突变趋势, 从Omicron株与其他VOCs的序列比较、Omicron株各子代分支序列比较两方面阐述了Omicron株的突变位点特点, 并进一步从免疫逃逸、毒力和传播能力等方面阐述了Omicron株位点突变后的影响, 最后对小分子抗病毒药物、抗体和疫苗的研发方向进行综述, 以期对接下来的相关研究提供参考。     

2011—2020年福建省手足口病相关柯萨奇病毒A2型分子流行病学特征分析

目的研究福建省2011—2020年手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)相关的柯萨奇病毒A2型(coxackievirus A2, CV-A2)流行病学及病毒基因组特征。方法利用描述性流行病学方法对2011—2020年福建省疾病预防控制中心实验室收集的HFMD相关CV-A2病例进行流行病学特征分析。采用Mega X和Simplot 3.5.1等软件对一代测序获得的VP1基因和二代测序获得的全基因组进行系统进化分析和重组分析。结果 2011—2020年福建省HFMD相关CV-A2病例35例, 以1～2岁幼儿(28/35)为主, 男女性别比2.5∶1(25/10)。VP1区基因系统进化树显示, 福建省内CV-A2流行株存在两种基因亚型, 即C1和D1基因亚型, 仅1株(2019FJPT064)属于C1基因亚型, 其余27株为D1基因亚型。其中, 4株2011—2012年分离株为D1基因亚型cluster 1分支, 另外2株2011—2012年分离株及2012年后的分离株均属于D1基因亚型cluster 2分支。6株福建CV-A2毒株全基因组长度在7...