抑制Rac1表达对高糖诱发神经元损伤后线粒体自噬的影响

目的评价抑制Ras相关的C3肉毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, Rac1)表达对高糖诱发神经元损伤的影响。方法对数生长期PC12细胞接种于6孔板, 采用随机数字表法将细胞分为4组(每组3孔):正常浓度葡萄糖组(C组)、高浓度葡萄糖组(HG组)、高浓度葡萄糖+慢病毒抑制Rac1组(HG+shRac1组)、高浓度葡萄糖+慢病毒阴性对照组(HG+NC组)。C组以葡萄糖浓度为4.5 g/L的DMEM完全培养基培养PC12细胞24 h, HG组以葡萄糖浓度为45 g/L的DMEM完全培养基培养PC12细胞24 h, HG+shRac1组以葡萄糖浓度为45 g/L的DMEM完全培养基培养用Rac1 shRNA慢病毒载体转染的PC12细胞24 h, HG+NC组以葡萄糖浓度为45 g/L的DMEM完全培养基培养用阴性慢病毒载体转染的PC12细胞24 h。Western blot法检测微管相关蛋白1轻链3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)Ⅰ、LC3Ⅱ、Bcl-2/...     

氨磷汀对谷氨酸所致N9小胶质细胞损伤的保护作用

目的 观察氨磷汀对谷氨酸( glutamate,Glu)所致N9小胶质细胞损伤的保护作用.方法 建立Glu损伤模型,探索最适氨磷汀浓度,实验分4组:空白对照组(Con组),正常培养小胶质细胞24 h;Glu损伤组(Glu组),含10 mmol/L Glu的培养基处理N9细胞24 h;氨磷汀组(Ami+Glu组),含1 mmol/L氨磷汀和10 mmol/L Glu的培养基处理N9细胞24 h;TBOA组(Ami+TBOA+Glu组),含100 μmol/L TBOA、1 mmol/L氨磷汀和10 mmol/L Glu的培养液培养N9小胶质细胞24h.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞代谢率,检测培养液乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、一氧化氮(nitrogen monoxide,NO)的含量,收集贴壁细胞超声破碎,检测谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量.结果 与损伤组比较,1 mmol/L氨磷汀保护组细胞代谢率(88.9±1.7)％升高(P＜0.05),LDH释放量(141±40)％减少(P＜0.05),SOD含量(128±13)％增加(P＜0.01),GSH含量(88±8)％增加(P＜0.01),NO释放量(147±34)％下降(P＜0.01);该作用可被兴奋性氨基酸转运体(excitatory amino acid transporter,EAAT)拮抗剂TBOA逆转.结论氨磷汀通过抗氧化机制减轻Glu对N9小胶质细胞的损伤.     

氢对脂多糖-尼日利亚菌素诱导巨噬细胞焦亡的影响及lncRNA NEAT1在其中的作用

目的评价氢对脂多糖(LPS)-尼日利亚菌素诱导巨噬细胞焦亡的影响及长链非编码RNA(lncRNA)核富集转录体1(NEAT1)在其中的作用。方法体外培养人单核巨噬细胞系THP-1, 采用随机数字表法分为4组(n=25):对照组(C组)、LPS-尼日利亚菌素组(LN组)、富氢液培养基+LPS-尼日利亚菌素组(H+LN组)和慢病毒转染+富氢液培养基+LPS-尼日利亚菌素组(LV+H+LN组)。C组细胞使用普通培养基正常培养24 h;LN组加入终浓度为100 ng/ml的LPS和10 μmol/L的尼日利亚菌素孵育24 h;H+LN组将普通培养基更换为0.6 mmol/L的富氢液培养基, 随即加入终浓度为100 ng/ml的LPS和10 μmol/L的尼日利亚菌素孵育24 h;LV+H+LN组使用经慢病毒转染致NEAT1稳定过表达的THP-1细胞, 并将普通培养基更换为0.6 mmol/L的富氢液培养基, 随即加入终浓度为100 ng/ml的LPS和10 μmol/L的尼日利亚菌素孵育24 h。采用CCK-8法检测细胞活力, 比色法检测LDH释放量, ELISA法检测培养基IL-1β和IL-...     

维生素B1介导的Akt/mTOR/STAT3信号通路在谷氨酸诱导的PC12细胞损伤中的作用

[目的]研究维生素B1(thiamine,VitB1)介导的Akt/mTOR/STAT3信号通路在谷氨酸(glutamate,Glu)诱导的PC12细胞损伤中的作用.[方法]应用MTT法检测不同浓度谷氨酸对PC12细胞作用不同时间的细胞生长抑制率,筛选出合适的作用浓度与作用时间后,将细胞分为4组,分别为A组:正常对照组;B组:20 mmoL/L谷氨酸处理组;C组:20 mmol/L谷氨酸+300 μmol/L维生素B1处理组;D组:20 mmol/L谷氨酸+300 μmol/L维生素B1+ 800 nmol/L雷帕霉素(rapamycin,RAPA)处理组.应用流式细胞术观察各组作用12 h后细胞凋亡率,Western blot观察各组处理1、4、8、12 h后,p-Akt,p-mTOR,p-STAT3蛋白表达情况.[结果](1)谷氨酸对PC12细胞的生长抑制作用随作用时间和作用浓度的增加而增强;(2)A组的凋亡率为(3.42±0.79)％;C组凋亡率为(23.85±1.58)％,明显低于B组(40.20±2.54)％和D组(53.49±2.83)％(P＜0.01);(3) Western blot 检测结果表明C组各时间点p-Akt,p-mTOR,p-STAT3表达均高于A、B、D组,并且p-Akt表达量在1h时最高,p-mTOR和p-STAT3在4h时达到高峰.[结论]维生素B1激活了细胞Akt/mTOR/STAT3信号通路,该通路对谷氨酸诱导的神经细胞损伤起到了保护作用.     

超声微泡介导HSV1-TK/GCV自杀基因系统对人肝癌细胞株HepG2的杀伤作用

目的 观察超声微泡(UM)介导HSV1-TK/GCV自杀基因系统对人肝癌细胞株HepG2的杀伤效率.方法 将HepG2接种在培养板中,随机分为以下5组:(A)空白对照组;(B)单纯质粒组;(C)超声微泡+质粒组;(D)超声+质粒组;(E)超声+超声微泡+质粒组.转染后24 h,荧光显微镜观察各组细胞绿色荧光的表达,流式细胞仪检测各组细胞的转染效率,噻唑蓝(MTT)比色法检测转染方法对HepG2活性的影响,Western blot法检测各组细胞的TK蛋白表达;转染后24h,各组细胞加入0、0.1、1.0、10.0、50.0、100.0、500.0、1000.0 mg/L共8个浓度梯度的前药更昔洛韦(GCV),72 h后MTr法检测各组细胞的存活率.结果 荧光显微镜下E组的绿色荧光强度明显高于其他各组;流式细胞仪检测基因转染率分别为0％、0.39％、0.61％、1.10％、36.00％,荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测提示E组tk mRNA相对表达量为1.13,是其余各组的7～9倍,Western blot 条带灰度分析显示E组TK蛋白的明显高于其他各组(P＜0.05);转染方法对HepG2细胞活性无明显影响(P＞0.05);GCV浓度在50 mg/L以上培养72 h后,低频超声+超声微泡+质粒组细胞几乎全部被杀灭,存活率为0,杀伤效应最强(P＜0.05),其余各组几乎无杀伤作用.结论 超声破坏微泡造影剂可提高HSV1-TK基因在HepG2中的转染和表达,增强HSV1-TK/GCV自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤效应,而超声辐照和微泡造影剂在转染过程中对细胞的活性无影响.     

异丙酚对布比卡因致PC12细胞毒性时细胞Ca2+浓度和一氧化氮合酶活性的影响

目的 评价异丙酚对布比卡因致PC12细胞毒性时细胞Ca2+浓度和一氧化氮合酶(NOS)活性的影响.方法 PC12细胞悬液(105/ml)随机分成4组:对照组(C组)、异丙酚组(P组)、布比卡因组(B组)和异丙酚+布比卡因组(PB组),每组PC12细胞分别接种于36孔板(每孔1 ml,每组9孔)、激光共聚焦显微镜专用培养皿(每皿1 ml,每组6皿)和24孔板(每孔 1 ml,每组6孔).C组加入D-Hank液500 μl;P组加入异丙酚至终浓度为2 mmol/L;B组加入布比卡因至终浓度为0.09 mmol/L;PB组同时加入异丙酚和布比卡因,终浓度分别为2 mmol/L和0.09 mmol/L.于36孔板中孵育24 h后测定PC12细胞凋亡率;于激光共聚焦显微镜专用培养皿中孵育6、24 h时,测定PC12细胞游离Ca2+浓度;于24孔板中孵育6、24 h时测定细胞NOS活性.结果 与C组相比,B组和PB组PC12细胞游离Ca2+浓度、NOS活性和凋亡率均升高(P<0.01),P组上述指标差异无统计学意义(P>0.05);与B组相比,PB组PC12细胞游离Ca2+浓度、NOS活性和凋亡率均降低(P<0.05).结论 在细胞水平,异祆丙酚可能通过抑制NOS活性和钙超载,减轻布比卡因诱导的神经毒性.     

NORAD在氯胺酮诱发小鼠海马神经元毒性中的作用：与内质网应激的关系

目的评价长链非编码RNA NORAD在氯胺酮诱发小鼠海马神经元毒性中的作用及其与内质网应激的关系。方法分离并培养原代小鼠海马神经元, 采用随机数字表法分为5组(n=36):对照组(C组)、氯胺酮组(K组)、氯胺酮+pcDNA3.1-NORAD质粒组(K+NORAD组)、氯胺酮+对照质粒组(K+NC组)和氯胺酮+NORAD+衣霉素组(K+NORAD+TM组)。C组使用正常培养基培养24 h;K组加入40 μmol/L氯胺酮孵育24 h;K+NORAD组先转染pcDNA3.1-NORAD质粒至神经元中, 48 h后加入氯胺酮40 μmol/L孵育24 h;K+NC组先转染pcDNA3.1(+)质粒至神经元中, 48 h后加入氯胺酮40 μmol/L孵育24 h;K+NORAD+TM组先转染pcDNA3.1-NORAD质粒, 24 h后加入内质网应激激活剂衣霉素1 μg/ml孵育24 h, 然后再加入氯胺酮40 μmol/L孵育24 h。采用CCK-8法检测神经元活力, 检测乳酸脱氢酶(LDH)释放量, 采用TUNEL法和流式细胞术检测细胞凋亡情况, Real-time PCR法测定NORA...     

氯胺酮复合咪达唑仑对谷氨酸诱导PC12细胞凋亡的影响

目的 探讨氯胺酮复合咪达唑仑对谷氨酸诱导PC12细胞凋亡的影响.方法 诱导分化4 d的神经元样PC12细胞随机分为5组:对照组(c组);谷氨酸组(Glu组)加入20 mmol/L谷氨酸;氯胺酮组(K组)、咪达唑仑组(M组)、氯胺酮+咪达唑仑组(K+M组)均加入20 mmol/L谷氨酸后,分别加入50 μmol/L氯胺酮、1μmol/L咪达唑仑、50 μmol/L氯胺酮+1 μmol/L咪达唑仑.各组细胞继续培养24 h后采用MTT法检测细胞活力,Hoechst33258核染色法及Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测凋亡细胞.结果 与C组比较,Glu组细胞活力降低,细胞凋亡率升高(P<0.01);与Glu组比较,K组和M组细胞活力升高,细胞凋亡率降低(P<0.05);与K组和M组比较,K+M组细胞活力升高,细胞凋亡率降低(P<0.05);K组和M组细胞活力及细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05).结论 氯胺酮复合咪达唑仑可更有效地抑制谷氨酸诱导PC12细胞凋亡.     

Musashi RNA结合蛋白2通过Wnt/β-catenin信号通路对肝癌细胞增殖的影响

目的探究Musashi RNA结合蛋白2(MSI2)如何通过Wnt/β-catenin信号通路发挥调控肝癌细胞增殖的作用。方法通过转染短发夹RNA(shRNA)抑制MSI2表达, 将细胞分为转染对照质粒(sh-Ctrl)组和sh-MSI2组。MSI2过表达实验中将细胞分为对照组(Vector组, 转染空白质粒Vector)和过表达组(MSI2组, 转染MSI2重组质粒)。CCK-8和平板克隆实验检测细胞增殖。蛋白质印迹法检测干预MSI2后β-catenin、转录因子7(TCF7)和淋巴增强因子1(LEF1)的表达。Rescue回复实验中将细胞分为MSI2+sh-Ctrl组(同时转染MSI2重组质粒和sh-Ctrl质粒)和MSI2+sh-β-catenin组(同时转染MSI2重组质粒和sh-β-catenin质粒)。在过表达MSI2的基础上敲低β-catenin进行肝癌细胞增殖能力检测。结果 sh-MSI2组HepG2和MHCC97H细胞的增殖率均低于sh-Ctrl组, 差异具有统计学意义(P<0.05)。MSI2组的SMMC-7721和MHCC97L细胞增殖率均高于Vector组...     

不同浓度氯胺酮对谷氨酸诱导大鼠脊髓背角神经元和星形胶质细胞凋亡的影响

目的观察不同浓度氯胺酮对谷氨酸诱导的大鼠脊髓背角神经元和星形胶质细胞凋亡的影响。方法取出生1-3 d Wistar大鼠T11-L5脊髓背角神经元和星形胶质细胞,原代混合培养2 周。将细胞随机分为6组(n=8):对照组(C组)加入Hanks液;谷氨酸组(G组)加入谷氨酸至终浓度100μmol/L;氯胺酮组(K组)加入氯胺酮至终浓度1 mmol/L;GK1、GK2、GK3组先加入谷氨酸至终浓度100μmol/L,30min后分别加入氯胺酮至终浓度0.1、1、10mmol/L。培养48 h后取各组细胞上清液检测白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)浓度,瑞氏染色观察细胞形态变化,流式细胞仪检测神经元和星形胶质细胞凋亡。结果与C组比较,G、GK1、GK2组神经元和星形胶质细胞凋亡峰值增加,GK3组细胞几乎全部死亡,未能上机检测细胞凋亡,G、GK1、GK2、GK3组IL-1β和TNF-α浓度升高(P<0.01)。与G组比较,GK2组各指标均降低,GK,组IL-1β和TNF-α浓度升高(P<0.01)。结论1 mmol/L氯胺酮可降低谷氨酸引起大鼠脊髓背角神经元和星形胶质细胞的凋亡。     

氯胺酮对谷氨酸引起神经元样嗜铬细胞瘤细胞株凋亡的影响

目的 观察氯胺酮对谷氨酸引起神经元样嗜铬细胞瘤(PC12)细胞株凋亡的影响。方法PC12细胞株分别以2×103/孔和1×105/ml密度接种于96孔细胞培养板和60 mm细胞培养皿中,置于培养基,培养基中加10 nmol/L神经生长因子(7S-NGF),96孔细胞培养板和60 mm细胞培养皿的细胞均随机分为五组,A组暴露于20 mmol/L谷氨酸中,B组暴露于20 mmol/L谷氨酸 0.1 mmol/L氯胺酮(氯胺酮比谷氨酸提前1 min 加入)中,C组暴露于20 mmol/L 谷氨酸 1.0 mmol/L氯胺酮中,D组暴露于20 mmol/L 谷氨酸 100 μmol/L D-2-氨基-5-膦酸基戊酸(D-AP5)(细胞与D-AP5提前孵育2h)中,E组暴露于等容积的不含7S-NGF的新鲜培养液中,采用MTT法测定细胞培养板中PC细胞的细胞活力,采用死端比色TUNEL系统细胞检测培养皿中PC12细胞株的凋亡率。结果 A组、B组、C组和D组细胞活力分别为:37％±6％、65％±7％、99％±10％、90％±22％,与A组比较,B组、C组、D组细胞活力均升高(P<0.05或0.01)。A组、C组、D组、E组凋亡细胞率分别为66％±10％、20％±6％、22±7％、3.2％±1.8％,与A组比较,C组、D组、E组细胞凋亡率明显降低(P<0.01)。结论 氯胺酮通过抑制谷氨酸引起的神经元样PC12细胞株凋亡而发挥神经保护作用。     

靶向细胞外信号调节激酶2短发夹式RNA对人食管癌Eca109细胞增殖的影响

目的 观察靶向细胞外信号调节激酶2(ERK2)短发夹式RNA(shRNA-ERK2)对人食管癌细胞株Eca109细胞增殖的影响.方法 构建重组质粒pGeneClipTM-shRNA-ERK2脂质体介导重组质粒转染人食管癌Eca109细胞,荧光倒置显微镜观察转染效率;噻唑蓝(MTT)比色法检测转染食管癌Eca109细胞后细胞的增殖能力;Western blot检测转染后食管癌Eca109细胞ERK2基因的表达和凋亡抑制基因Survivin的表达.结果 测序证实载体构建成功,荧光倒置显微镜观察转染后72 h转染效率50%～70%;转染重组质粒96 h后食管癌Eca109细胞生长抑制率最高为10.45%,与阴性对照组(非特异性序列对照)和空白对照组比较抑制效果明显(P＜0.05);转染重组质粒72 h和96 h后食管癌Eca109细胞株中ERK2和Survivin的表达与U0126对照组和阴性对照组比较均下降(P＜0.05).结论 重组质粒pGeneClipTM-shRNA-ERK2在食管癌Eca109细胞株中能发挥靶基因沉默作用,影响Survivin基因的表达,抑制食管癌细胞增殖.     

miRNA-146a在小鼠小胶质细胞炎症反应中的作用

目的评价microRNA(miR)-146a在小鼠小胶质细胞炎症反应中的作用。方法小鼠小胶质细胞BV2进行培养,选取对数生长期的细胞,采用随机数字表法分为5组(n=48):对照组(C组)、LPS组、LPS+miR-146a模拟物组(LPS-M组)、LPS+miR146-a抑制物组(LPS-I组)和LPS+阴性对照组(LPS-NC组)。LPS-M组、LPS-I组和LPS-NC组分别将miR-146-a模拟物RNA、miR-146a抑制物RNA和模拟物/抑制物的错义RNA转染至细胞。转染成功后,LPS组、LPS-M组、LPS-I组和LPS-NC组细胞分别加入终浓度为1 μg/ml的LPS,C组加入等容量培养基,孵育6 h。采用qRT-PCR法检测细胞miR-146a、白介素受体相关激酶1(IRAK1) mRNA和肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6) mRNA的表达,采用Western blot法检测细胞IRAK1和TRAF6的表达。收集细胞上清液,采用ELISA法检测TNF-α、 IL-1β和IL-6的浓度。结果与C组比较,LPS组细胞miR-146a表达、IRAK1和TRAF6及其m...     

富氢液对人肾小管上皮细胞缺氧复氧损伤时Akt/Nrf2信号通路的影响

目的评价富氢液对人肾小管上皮细胞缺氧复氧损伤时丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)/核因子-E2相关因子2(Nrf2)信号通路的影响。方法体外培养的人肾小管上皮细胞系, 以1.5×104个/ml的密度接种于96孔培养板(200 μl/孔)或以2×105个/ml密度接种于6孔培养板(2 ml/孔), 采用随机数字表法分为5组(n=30):对照组(C组)置于常氧恒温培养箱(37 ℃、5%CO2-21%O2-74%N2)中培养28 h;富氢液组(H组)加入含0.6 mmol/L富氢液的培养基, 置于常氧恒温培养箱中孵育28 h;缺氧复氧组(H/R组)置于厌氧恒温培养箱(37 ℃、5%CO2-1%O2-94 %N2)中缺氧24 h, 取出后置于常氧恒温培养箱复氧4 h;缺氧复氧+富氢液组(H/R+ H组)置于厌氧恒温培养箱中缺氧24 h, 取出后加入含0.6 mmol/L富氢液的培养基, 置于常氧恒温培养箱中复氧4 h;缺氧复氧+富氢液+Akt抑制剂Uprosertib组(H/R+ H+U组)加入终浓度为10 μmol/L的Uprosertib孵育1 h, 其余处理同H/R+ H组。各组细胞处理结束...     

MiR-4429/NQO1对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤及炎症因子分泌的影响

目的探讨miR-4429与依赖还原型辅酶/醌氧化还原酶1(NADH quinone dehydrogenase 1,NQO1)对高糖诱导的肾小管上皮细胞增殖、凋亡、炎症因子分泌的影响及其作用机制。方法体外培养人肾小管上皮细胞HK-2,用30 mmol/L葡萄糖处理24 h,制备糖尿病肾病肾小管上皮细胞损伤模型,记作高糖组;用含有5.5 mmol/L葡萄糖的培养基培养24 h,记作正常对照组;用含有50 mmol/L甘露醇的培养基培养24 h,记作高渗对照组;分别将miR-4429抑制剂(anti-miR-4429)、anti-miR-4429阴性对照序列(anti-miR-NC)、anti-miR-4429与NQO1小干扰RNA(si-NQO1)、anti-miR-4429与si-NQO1阴性对照序列(si-NC)转染至HK-2细胞,使用含有30 mmol/L葡萄糖的培养基培养24 h,分别记作HG+anti-miR-4429组、HG+anti-miR-NC组、HG+anti-miR-4429+si-NQO1组、HG+anti-miR-4429+si-NC组。检测各组细胞miR-4429、NQO1 mRNA的表达水平,并检测各组细胞存活率、细胞凋亡率、Caspase-3蛋白水平、NQO1蛋白水平、丙二醛(malondialedhyde,MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)含量、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量。采用双荧光素酶报告实验验证miR-4429过表达对野生型和突变型NQO1荧光素酶活性的影响。结果高糖处理后,miR-4429、Caspase-3的表达水平显著升高(P0.05),细胞凋亡率显著升高(P0.05),MDA含量与IL-1β、TNF-α水平显著升高(P0.05),但NQO1 mRNA的表达水平显著降低(P0.05),细胞存活率与SOD活性显著降低(P0.05);抑制miR-4429表达后细胞凋亡率与Caspase-3表达量显著降低(P0.05),MDA含量与IL-1β、TNF-α水平显著降低(P0.05),细胞存活率显著升高(P0.05),SOD活性显著升高(P0.05);双荧光素酶报告实验证实miR-4429能够抑制NQO1的3′-UTR区荧光素酶活性(P0.05);抑制NQO1的表达可明显减弱miR-4429的表达对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的保护作用。结论 miR-4429可靶向调控NQO1的表达从而促进高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡,降低细胞存活率,加重细胞氧化损伤与炎性损伤。     

大鼠RNAi-A2aR慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建大鼠RNAi-腺苷A2a受体(A2aR)慢病毒载体并进行鉴定。方法首先构建3对短发夹RNA(shRNA)-A2aR序列(shRNA-A2aR 1、shRNA-A2aR 2、shRNA-A2aR 3), 在shRNA慢病毒载体中分别插入3对双链shRNA oligo, shRNA慢病毒重组质粒构建成功后, 将重组质粒、包装载体、穿梭载体共转染293T细胞, 从而获得病毒液。实验Ⅰ采用随机数字表法将大鼠原代心肌细胞分为3组(n=6):空载组(V组)、shRNA-A2aR 1组和shRNA-A2aR 3组, 各组分别转染MOI为10的相应病毒液, 转染48 h时, Western blot法检测A2aR表达水平, 确定干扰效率, 以筛选最佳慢病毒载体。实验Ⅱ采用随机数字表法将大鼠原代心肌细胞分为5组(n=36):空载组(V组)、MOI5组、MOI10组、MOI15组和MOI20组, 各组分别转染相应MOI的病毒液(最佳慢病毒载体), 于转染24、48和72 h时, 采用CCK-8法测定细胞存活率, 荧光显微镜下观察细胞活力和细胞死亡情况, Western blot法检测A2aR表达水...     

ERK1/2 MAPK通路在TIMP-1抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡中的作用

目的 探讨细胞外信号调节激酶(ERK1/2)丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路在基质金属蛋白酶1组织抑制剂(TIMP-1)抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡中的作用。 方法 将人正义、反义TIMP-1用脂质体法转染大鼠肾小球系膜细胞，并将细胞分为正常对照组、未转染组、空载体组、正义转染组和反义转染组。各组细胞分别用高糖(25 mmol/L)和(或)MEK(ERK1/2通路中的MAPK激酶)特异性抑制剂PD98059(50 μmol/L)刺激24 h。应用透射电镜观察细胞内部结构变化。Western 印迹观察磷酸化(p)的ERK1/2、P90rsk、Bad及总的P90rsk、Bad、Bcl-2蛋白的表达。 结果 加入PD98059后，各组细胞内可见凋亡小体形成、细胞皱缩、核固缩、染色体边集及膜泡样突变等现象，与未转染组比较，以反义转染组最明显，凋亡细胞数目最多；正义转染组细胞形态改变不十分明显，凋亡细胞数目相对较少。此外，加入PD98059后，ERK1/2、P90rsk、Bcl-2及Bad的磷酸化明显减少(P < 0.05)，ERK1/2和P90rsk的磷酸化以正义转染组最明显(P < 0.01)；总P90rsk、总Bad表达量在各组之间无显著差异。 结论 ERK1/2 通路在TIMP-1抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡过程中起重要作用。     

megsin基因转染对高糖环境中系膜细胞胞外调节蛋白激酶表达的影响

目的 观察megsin基因转染对高糖环境中小鼠肾小球系膜细胞血小板源性生长因子BB（PDGF-BB）、磷酸化胞外调节蛋白激酶1/2（pERK1/2）、转化生长因子β1（TGF-β1）的表达及Ⅳ型胶原水平的影响;探讨megsin基因对细胞外信号调节激酶（ERK）通路的作用。 方法 将小鼠肾小球系膜细胞分为7组：低糖组（A组,5.5 mmol/L）、高糖组（B组,30 mmol/L）、高糖+空质粒组（C组）、高糖+megsin质粒组（D组）、高糖+megsin质粒+ERK通路抑制剂组（E组）、高糖+ megsin siRNA组（F组）和低糖+甘露醇组（24.5 mmol/L甘露醇,G组）。分别在培养12、24、48 h后,采用Western印迹法测定各组系膜细胞megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1的表达,放射免疫测定法（RIA）测定各组细胞上清液中Ⅳ型胶原浓度。 结果 与A组相比,高糖刺激可上调系膜细胞megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1的表达及上清液Ⅳ型胶原的水平（均P ＜ 0.05）,且有一定的时间依赖性。转染megsin基因可进一步上调高糖环境下系膜细胞PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1、Ⅳ型胶原的表达（均P ＜ 0.05）。应用ERK通路抑制剂后,与D组相比系膜细胞megsin 和PDGF-BB的表达无明显变化（均P ＞ 0.05）,而pERK1/2、TGF-β1及Ⅳ型胶原的表达则明显降低（均P ＜ 0.05）。转染megsin siRNA对系膜细胞megsin基因进行干扰后,系膜细胞PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1的表达及Ⅳ型胶原的含量较B组下调（均P ＜ 0.05）。 结论 高糖环境下,转染megsin基因可使小鼠系膜细胞megsin、PDGF-BB表达增高,其可能部分通过ERK通路使TGF-β1表达上调及Ⅳ型胶原合成与分泌增加。megsin siRNA干扰可使上述指标下调,megsin基因可能在糖尿病肾病发病中起重要作用。     

HDAC3在原代大鼠心肌细胞高糖缺氧复氧损伤中的作用：与自噬的关系

目的评价组蛋白去乙酰化酶3 (HDAC3)在原代大鼠心肌细胞高糖缺氧复氧损伤中的作用及其与自噬的关系。方法将1～3 d左右的新生SD乳鼠提取原代心肌细胞, 铺板。按随机数字表法分为5组(n=24):对照组(C组, 糖浓度5.5 mmol/L)、缺氧复氧组(H/R组)、高糖组(H组, 糖浓度30 mmol/L)、高糖缺氧复氧组(HH/R组)和高糖缺氧复氧+HDAC3抑制剂RGFP966组(HH/R+RG组)。采用50%葡萄糖注射液制备高糖培养基(终浓度为30 mmol/L)。H/R组细胞置于低氧环境(5%CO2-0.9%O2-94.1%N2)中培养6 h, 再置于常氧环境中复氧2 h制备心肌细胞缺氧复氧模型。HH/R+RG组于缺氧复氧前24 h加入RGFP966, 终浓度10 μmol/L。于细胞复氧2 h时, 采用CCK-8法检测细胞活力;ELISA法检测细胞上清LDH活性;自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)转染下共聚焦显微镜检测细胞自噬水平;Western blot法检测心肌细胞HDAC3、p62、LC3Ⅱ和LC3Ⅰ的表达, 计算LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值。结果与C组比较, H/...     

自噬在右美托咪定减轻大鼠高糖离体心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用

目的评价自噬在右美托咪定减轻大鼠高糖离体心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用。方法正常培养的对数期大鼠H9c2心肌细胞,以1×106个/ml密度接种于6孔板,采用随机数字表法分为4组(n=15):对照组(C组)、高糖缺氧复氧组(HG+H/R组)、右美托咪定组(DEX组)和右美托咪定+自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤组(3-MA组)。细胞密度达到50%时,使用含1%胎牛血清+1%双抗的培养基孵育24 h。采用高糖培养基(糖浓度33 mmol/L)培养24 h,37 ℃下培养箱(95%N2+5%CO2)培养4 h,复氧(90%O2+10%CO2)2 h,制备高糖心肌细胞缺氧复氧损伤模型,DEX组和3-MA组于缺氧前1 h时加入右美托咪定,终浓度5 μmol/L,3-MA组右美托咪定孵育1 h时加入3-MA,终浓度5 μmol/L。于复氧后2 h时采用CCK-8法测定细胞活力,采用试剂盒检测上清液LDH活性,采用Western blot法检测自噬相关蛋白LC3、P62和Beclin-1的表达,计算LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值,采用RT-PCR法检测P62和Beclin-1 mRNA的表达。结果与C组比较,HG+H...