覆盆子及其近缘混淆品的PCR-RFLP鉴别研究

目的 建立一种覆盆子特异性的分子鉴别方法。方法 通过对覆盆子及其混淆品的ITS序列进行测序分析,根据差异位点设计限制性内切酶,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法(polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)进行鉴别,建立并优化PCR鉴别方法,并对其稳定性和适用性进行考察与验证。结果 设计的引物可实现对覆盆子及其混淆品序列的扩增,扩增产物为800 bp大小的条带,通过对限制性内切酶MboI进行酶切后的片段长度进行分析,仅覆盆子的序列可被酶切形成2个片段,而混淆品的序列不能被切开,从而特异性鉴别是否为覆盆子。结论 本实验建立的PCR-RFLP方法可用于鉴别覆盆子。     

药用植物束花石斛、流苏石斛及其形态相似种的PCR-RFLP鉴别研究药用植物束花石斛、流苏石斛及其形态相似种的PCR-RFLP鉴别研究

目的建立简易的采用rDNA ITS区作为分子标记对中药石斛的基源植物进行分子鉴定的技术。方法 用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法获得ITS片段的限制性图谱。束花石斛及其形态相似种的PCR扩增产物用Cla I和Apa LI酶切,流苏石斛及其形态相似种的PCR扩增产物用Sph I酶切。结果根据预测的PCR-RFLP图谱,可以鉴别药用植物束花石斛、流苏石斛及它们的形态相似种。用这种方法鉴定了市场上收集的25件商品束花石斛、流苏石斛新鲜药材的原植物。结论rDNA ITS的PCR-RFLP可用于鉴定石斛药材的原植物,具有简便、费用低的优点。     

齿瓣石斛的位点特异性PCR鉴别

目的设计出齿瓣石斛的位点特异性鉴别引物,仅通过PCR就能完成对齿瓣石斛真伪进行准确鉴别。方法根据齿瓣石斛及其他枫斗类、黄草类石斛的rDNA ITS序列数据库,设计了齿瓣石斛的位点特异性PCR鉴别引物JB-Chiban-01S和JB-Chiban-01X。然后,对38种石斛属植物模板DNA进行了PCR扩增,阳性者即为齿瓣石斛正品。结果当退火温度设定为58℃时,只有齿瓣石斛的模板DNA能被扩增出来,而其他的37种石斛属植物均为阴性。该鉴别反应重复性好,已在鉴别齿瓣石斛时发挥重要作用。结论运用位点特异性鉴别引物能成功地对齿瓣石斛进行PCR鉴别,与DNA测序鉴别方法相比,位点特异性PCR具有高效、准确、简便、省时等优点。     

麦冬药材及饮片中掺混山麦冬的PCR-RFLP鉴别方法研究

目的:通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP法)建立一种能快速鉴别麦冬药材及饮片中掺混山麦冬的方法。方法:对麦冬和山麦冬的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)序列酶切位点进行比对，选择山麦冬的特异性酶切位点PmlI,设计PCR-RFLP反应引物。以退火温度58℃、循环数为30,LR-F和LR-R鉴别引物(10μmol·L^-1)各0.5μL,PmlI限制性内切酶在37℃酶切2 h的反应条件为PCR-RFLP法的参数，并进行方法学考察和统计分析。结果:在退火温度58℃、循环数为30时，山麦冬或掺有山麦冬的麦冬样品经过特异性引物扩增后，能被PmlI限制性内切酶酶切，在100～250 bp之间检出2条单一DNA条带，麦冬样品则无此条带。该方法稳定性好，专属性强，能对麦冬与山麦冬饮片及掺混样品进行鉴别，并对麦冬中掺入山麦冬的检出限为5%。结论:建立的PCR-RFLP鉴别方法稳定性好，灵敏度高，实现了麦冬与山麦冬饮片及麦冬中掺混山麦冬的快速检测，可用于麦冬与山麦冬药材真伪鉴别的补充检验方法。     

球花石斛的位点特异性PCR鉴别研究

为建立球花石斛的DNA分子标记鉴别方法，本文根据测定及GenBank上登录的109种共计164个石斛样本的rDNA ITS序列，设计了特异性鉴别引物QH-JB1 和QH-JB2，并对球花石斛进行了位点特异性PCR鉴别研究。结果表明，当复性条件为63.5 ℃，1 min时，只有球花石斛的模板DNA能被扩增出约300 bp的阳性扩增带，而其他种石斛均为阴性。证明用本法鉴别球花石斛简便、省时，也适用于干燥球花石斛药材的鉴别，具有广泛的应用前景。     

珍稀铁皮石斛SSR标记的开发及种质纯度鉴定

本研究利用磁珠富集法开发了60对铁皮石斛的SSR引物,从中筛选出15对多态性位点丰富、带型清晰、重复性好的引物。利用筛选出的SSR引物对铁皮石斛野生居群材料进行了遗传分析,共鉴定出等位变异92个,平均每个SSR位点等位变异数为6.1个;表观杂合度(HO)范围是0.60～0.85,平均值为0.72;期望杂合度(HE)范围是0.49～0.85,平均值为0.74。平均每个SSR位点多态信息含量(PIC)为0.702,变化范围为0.437～0.829。利用15对SSR引物对20种石斛试验材料进行跨种扩增,检测出有13对SSR引物具有种间通用性。此外,还利用所筛选的4对SSR引物检测了集约化种植过程中的铁皮石斛组培苗的种质纯度,结果显示:所开发的SSR标记可用于铁皮石斛组培苗的品种纯度鉴别。     

铁皮石斛与几种常用混淆品的红外光谱鉴别

目的 寻找能够鉴别铁皮石斛与几种常用混淆品的新方法．为进一步探索石斛类药材、饮片快速、有效的鉴别方法。方法 采用药材原粉末加KBr直接压片法测定铁皮石斛与几种常用混淆品的红外光谱．所获得的指纹图谱进行特征峰指认和对比分析。结果 铁皮石斛与几种常用混淆品的红外吸收频率、吸收峰的峰形和相对强度都存在较显著的差异。结论 首次采用红外光谱法鉴别铁皮石斛与几种常用混淆品,结果快速、准确,为控制铁皮石斛商品提供了可靠的依据。     

进口药材“大、小广天仙子”的鉴别研究

目的 多种方法联合鉴别进口药材“大、小广天仙子”。方法 参照《儿茶等43种进口药材质量标准》中性状和显微鉴别方法,并根据2020年版中国药典中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则分析相关ITS1、ITS2、pshA-trnH、matK、rbcL基因序列信息,利用关键差异位点探索建立聚合酶链式反应法-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)鉴别方法。结果 进口“大、小广天仙子”在显微特征和5个DNA条形码基因上均具有明显差异。“大广天仙子”符合进口药材标准规定;“小广天仙子”来源于另一个物种,为混伪品。利用ITS2上能被限制性内切酶NdeⅠ识别的关键差异位点可建立新的PCR-RFLP鉴别法。结论 采用显微鉴别和PCR-RFLP法可有效鉴别广天仙子真伪。     

铁皮石斛野生居群遗传多样性的RAPD分析与鉴别

目的采用RAPD分子标记技术，对铁皮石斛8个野生居群的遗传多样性、亲缘关系以及分子鉴别等进行研究。方法筛选随机引物进行RAPD分析，通过UPGMA聚类，研究铁皮石斛各居群间的遗传关系，构建居群亲缘关系的分子系统树；利用特异性条带对铁皮石斛野生居群进行指纹分析鉴别。结果共筛选出10个有效引物，在8个野生居群材料的RAPD扩增中共得到439个位点，平均每个引物扩增出43.9个位点，每个居群扩增出54.9个位点；在所获得的104条可重现谱带中，9条是单态的，95条是多态的，多态性程度达91.35%，遗传距离在0.590～0.727之间，平均为0.686。结论铁皮石斛居群间遗传差异明显，具有较丰富的遗传多样性；RAPD可以作为铁皮石斛野生居群遗传多态性、居群亲缘关系和分子鉴别研究的有效手段；引物S412可以有效鉴别铁皮石斛的8个野生居群。     

铁皮石斛制剂的高效液相色谱定性鉴别

目的研究铁皮石斛制剂的高效液相色谱(HPLC)定性鉴别方法。方法以柚皮素为对照,色谱柱为Zorbax SB C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为A(甲醇)-B(0.2%H3PO4水溶液)梯度洗脱,流速为1.0 mL/min,检测波长为280 nm。结果比较10批次铁皮石斛制剂的HPLC图,选择柚皮素及相对保留时间比为1.11～1.14处色谱峰为参照,可用于铁皮石斛制剂的HPLC鉴别。结论该方法操作简单、专属性强,为铁皮石斛制剂的质量控制提供了可靠的定性鉴别方法。     

PCR-RFLP法鉴别罗布麻与混淆品白麻 及其psbA-trnH序列分析

目的:基于叶绿体psbA-trnH基因间隔区序列,建立一种PCR-RFLP(聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性)方法鉴别罗布麻(Apocynum venetum L.)及其混淆品白麻(Apocynum pictum),并验证psbA-trnH序列酶切位点种间特异性和种内保守性.方法:将罗布麻和白麻提取总DNA,扩增psbA-trnH序列,扩增产物双向测序.序列分析发现,罗布麻含有特异性酶切位点SspⅠ.结果:扩增产物psbA-trnH为300～400 bp.罗布麻psbA-trnH产物均可以被SspⅠ酶切成两条条带,白麻却不能被SspⅠ酶切.生物信息分析结果表明,在罗布麻属中,罗布麻psbA-trnH序列的SspⅠ酶切位点具有种间特异性和种内保守性,在夹竹桃族进化树中,罗布麻与白麻距离最近.结论:本实验建立的PCR-RFLP方法可以有效鉴别罗布麻和白麻.     

应用PCR-RFLP技术检测乙型肝炎病毒变异rtI233V

目的 建立一种应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析技术检测乙型肝炎病毒(HBV)变异rtI233V的方法 .方法 参照GenBank收录的HBV基因逆转录(RT)区序列设计PCR引物,根据HBV RT区rt233位野生型和变异犁的序列,分别选择Bst1107I和Bsp1407I两种内切酶.以rtI233V变异株及野毒株质粒为模板进行PCR扩增,PCR产物分别用Bst1107I和Bsp14071两种限制性内切酶进行酶切,观察酶切产物琼脂糖凝胶电泳条带变化.并以变异型和野生型质粒的不同配比,分析该检测方法 的敏感性.结果 本研究建立的PCR-RFLP方法 可同时检测野毒株和rtI233V变异株.PCR扩增后,野毒株和rtI233V变异株的PCR产物长度均为255 bp.以Bst 11071酶切,野毒株质粒的PCR产物可以切成75 bp和180 bp两段,rtI233V变异株PCR产物的长度保持不变.以Bsp1 4071酶切,rtI233V变异株质粒的PCR产物可以切成75bp和180bp两段,野毒株质粒的PCR产物长度保持不变,测序结果 与上述结果 一致.敏感性检测表明,此方法 至少可检出标本中10%的变异株.应用此方法 检测100例慢性乙型肝炎患者,筛选出2例rtI233V变异患者.结论应用PCR-RFLP方法 可检测rtI233V变异,具有较高的敏感性,可用于HBV变异rtI233V的早期诊断.     

黄草类石斛的薄层色谱鉴别研究

目的：建立黄草类石斛的薄层色谱（TLC）定性鉴别方法。方法：采用薄层色谱法,考察不同基源石斛及商品药材中专属性成分联苄类化合物毛兰素（erianin）、石斛酚（gigantol）、杓唇石斛素（moscatilin）和3,4＇-,5-三羟基．3’-甲氧基联苄（tristin）的薄层色谱行为,对石斛药材进行定性鉴别。结果：通过21种不同基源的石斛及11批商品石斛的薄层色谱鉴别,证明此方法专属性强,操作简单,重复性好,为石斛的鉴别提供了一种准确、有效的新方法。结论：本方法可用于黄草类石斛的鉴别,为中药石斛的质量标准研究提供科学依据。     

基于rDNA ITS序列SNP位点的特异性聚合酶链反应引物鉴别青椒和花椒

目的设计专用于花椒与青椒鉴别的特异性聚合酶链反应(PCR)引物,建立花椒与青椒的分子鉴别方法。方法本研究提取花椒与青椒样品的DNA,并利用rDNA ITS(核糖体DNA内部转录间隔区)序列通用型引物分别对样品进行PCR扩增,PCR产物经双向测序、比对,寻找单核苷酸多态性(SNP)特异性位点,并分别针对花椒与青椒的SNP位点设计出花椒与青椒的特异性PCR引物,用于花椒与青椒的特异性PCR引物鉴别。结果所设计的特异性引物为花椒和青椒的鉴别提供了分子鉴定的依据,可以快速、准确地检测出花椒和青椒。结论本文所设计的特异性PCR引物能有效地鉴别出花椒与青椒,该方法具有准确、高效、灵敏、简便等特点,具有较好的市场应用前景。     

基于PCR的麦冬鉴别方法研究

目的：建立中药材麦冬的PCR检测方法。方法：对麦冬及其混伪品的ITS序列进行比对分析,在ITS 1区设计了麦冬的特异性引物,并通过对PCR反应条件的优化,建立麦冬的PCR鉴别方法。结果：建立了麦冬真伪鉴别的PCR检测方法,并利用该方法对收集的样品进行检测,实现了麦冬与混伪品的准确鉴别。结论：该方法操作简单、特异性强、重复性好,检测结果客观易判读。     

曲茎石斛及其近似种鉴别的形态和DNA分子证据

目的　探讨曲茎石斛 (南阳居群 )与同属近似种 :细茎石斛 (南阳居群 )、霍山石斛 (霍山居群 )、铁皮石斛(天台居群 )药材鉴别的形态及DNA分子证据。方法　对曲茎石斛 (南阳居群 )及其近似种的药材进行了外部形态和rDNAITS序列比较。结果　曲茎石斛及其近似种药材的外部形态虽无明显区别 ,但在rDNAITS序列上却存在着显著而稳定的差异。曲茎石斛 (南阳居群 )与铁皮石斛 (天台居群 )的rDNAITS序列的差异最小 ,绝对遗传距离为 7;但与细茎石斛 (南阳居群 )及霍山石斛 (霍山居群 )rDNAITS区的差异较大 ,绝对遗传距离分别为 4 0和 4 2。在rDNAITS区域中 ,作者共挑选了 7个碱基位点用作鉴别曲茎石斛 (南阳居群 )及其近似种的DNA证据。结论　根据药材的形态特征及rDNAITS区碱基序列差异 ,可准确鉴别曲茎石斛及其近似种药材。     

曲茎石斛及其近似种鉴别的形态和DNA分子证据

目的　探讨曲茎石斛(南阳居群)与同属近似种:细茎石斛(南阳居群)、霍山石斛(霍山居群)、铁皮石斛(天台居群)药材鉴别的形态及DNA分子证据。方法　对曲茎石斛(南阳居群)及其近似种的药材进行了外部形态和rDNA ITS序列比较。结果　曲茎石斛及其近似种药材的外部形态虽无明显区别,但在rDNA ITS序列上却存在着显著而稳定的差异。曲茎石斛(南阳居群)与铁皮石斛(天台居群)的rDNA ITS序列的差异最小,绝对遗传距离为7;但与细茎石斛(南阳居群)及霍山石斛(霍山居群)rDNA ITS区的差异较大,绝对遗传距离分别为40和42。在rDNA ITS区域中,作者共挑选了7个碱基位点用作鉴别曲茎石斛(南阳居群)及其近似种的DNA证据。结论　根据药材的形态特征及rDNA ITS区碱基序列差异,可准确鉴别曲茎石斛及其近似种药材。     

药用石斛鉴别方法研究进展

石斛药用历史悠久,作为一种药食同源的名贵药材,市场中存在品种混淆的现象。因药用石斛种类繁多,且多为同属植物,鉴别难度较大。该文分别对传统鉴别方法、色谱及光谱鉴别方法、分子生物学鉴别方法等多种鉴别方法进行归纳整理。单一的鉴别方法存在局限性,建议结合药用石斛的性状、显微、化学成分以及基因序列的特点,建立综合、有效的石斛鉴别体系和质量标准,为药用石斛的鉴别提供研究思路,以期保障用药安全。     

位点特异性PCR鉴别两面针掺伪飞龙掌血的方法研究

目的:探讨DNA条形码技术对鉴定两面针掺伪飞龙掌血的可行性，建立两面针特异性快速聚合酶链式反应(PCR)分子鉴定方法。方法:通过对两面针和伪品飞龙掌血DNA条形码进行对比分析，寻找单核苷酸多态性(SNP)位点并设计特异性鉴别引物，优化PCR反应体系与程序，进行退火温度、引物酶、反应循环数、灵敏度及专属性等方法学考察。结果:ITS2条形码适用于两面针及伪品飞龙掌血的鉴别，所建立的位点特异性PCR鉴别方法，在退火温度为56℃、循环数为33次时，伪品飞龙掌血经过特异性引物扩增后，在200～300 bp之间检出一条单一DNA条带，而两面针则无此条带。结论:所建立的位点特异性PCR方法可准确检测两面针中是否含有飞龙掌血，为两面针质量监测提供一种新型的鉴定手段。     

霍山地区4种石斛属植物的遗传多态性分析

利用AP-PCR方法对4种霍山来源的石斛属植物基因组DNA进行了多态性分析，从75种随机引物中筛选出10种扩增条带清晰、稳定的随机引物，通过PCR扩增共获得250条DNA片段，其中呈多态性的片段数为165条，占扩增条带数的66％，显示了霍山来源的石斛植物具有较高的遗传多态性；利用NT-syspc分析软件对不同石斛品种间的平均遗传距离进行了分析，并利用UPGMA聚类分析方法构建它们的亲缘关系聚类图，结果表明4种霍山来源的石斛品种具有较近的亲缘关系，它们之间的平均遗传相似系数为0．63，其中铁皮石斛和铜皮石斛的亲缘关系最近，两者间的遗传相似系数为0．78，它们与串珠石斛的遗传相似系数分别为0．6和0．61，与霍山石斛的遗传相似系数分别为0．63和0．58；但是，相对于形态接近的铜皮石斛，铁皮石斛与霍山石斛的亲缘关系更近。