可表达新型甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白辅助病毒依赖型腺病毒载体的构建

根据甲型H1N1流感病毒美国加利福尼亚毒株基因序列(A/California/07/2009(H1N1)),全基因合成甲型流感病毒血凝素(HA)编码基因,利用辅助病毒依赖型腺病毒载体(HDAd)骨架质粒pSC15B,构建可表达HA基因的HDAd/HA DNA分子载体,以磷酸钙法转染293Cre4细胞,与辅助病毒H14连续共感染,获得HDAd/HA载体,并大量制备和纯化,进行形态观察和体外感染的初步鉴定。透射电镜下观察HDAd/HA载体具有典型腺病毒形态;与辅助病毒H14共感染293细胞,RT-PCR检测HA基因有转录,显示成功构建HDAd/HA重组腺病毒载体,为甲型流感病毒体内免疫效果和免疫保护作用的研究奠定实验基础。     

H1N1亚型流感病毒在A549和BEAS-2B细胞中复制情况的初步研究

目的 探讨不同宿主来源的H1N1亚型流感病毒在A549和BEAS-2B细胞的复制情况.方法 用分离自人、禽、猪三种宿主的7株H1N1甲型流感病毒分别接种A549和BEAS-2B细胞,分析病毒感染细胞后不同时段的特点;应用受体类型不同的红细胞进行微量血凝试验,检测流感病毒的受体结合特性;同时检测了A549和BEAS-2B细胞表面的受体分布情况.结果 三种宿主来源的H1N1亚型流感病毒感染A549细胞,24 h后CPE十分明显,36 h病毒滴度达到最高值;而感染BEAS-2B细胞后,从24 h-120 h CPE都不是很明显,且所有病毒的病毒滴度都很低.对6株H1N1流感病毒的受体结合特性进行了筛查,发现部分测试病毒具有SA a-2,6Gal受体结合特异性.而A549和BEAS-2B细胞表面均含有SA a-2,3Gal及SA a-2,6Gal受体,且A549细胞表面糖受体含量明显高于BEAS-2B细胞.结论 不同宿主来源的H1N1亚型流感病毒对A549细胞都易感并能有效增殖复制,而对具有相似受体特性、上皮组织来源的BEAS-2B细胞不易感,提示支持流感病毒有效感染、复制存在宿主内的调节机制.     

甲型流感病毒H3N2抗原进化研究进展

流感病毒是引起人类呼吸道感染的常见病原体。在4种季节性流感毒株中, 甲型流感病毒H3N2感染已成为季节性流感疾病和死亡的主要原因, 严重影响公共卫生和社会经济。自1968年首次出现并造成大流行后, H3N2一直在人群中反复流行, 不断通过抗原漂移来逃避宿主免疫系统的攻击, 从而导致低疫苗效力。本文从甲型流感病毒H3N2的抗原进化、抗原进化对疫苗株选择的影响及一些预测流感病毒进化的模型等方面进行分析和综述, 为流感病毒抗原进化分析和未来疫苗研发等工作提供参考。     

2000～2002年我国流行的甲3(H3N2)亚型流感病毒抗原性及基因特性的研究

目的 了解2000～2002年我国流行的甲3流感病毒HA基因突变及其抗原变异情况。方法 鸡胚传代流感病毒，收获尿囊液作为抗原性分析抗原并提取病毒的RNA，进行逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)，扩增产物用纯化试剂盒纯化后测序，用MegAlign软件进行基因种系发生树分析。结果 与A/武汉/359/1995(H3N2)、A／Sydney／5／1997(H3N2)相比，2000～2002年我国分离到的甲3亚型流感病毒的血凝素重链区氨基酸序列存在差异。2001～2002年分离到的甲3毒株与2000年分离出的毒株的血凝素蛋白重链区(HA2)氨基酸序列有4个位点差异，它们分别位于83、186、202和222位，其中83和186分别位于抗原决定簇E和B区，其余均位于受体结合位点(RBS)的左臂。结论 2000～2002年分离到的甲3亚型流感病毒的基因特性发生突变并导致其抗原性发生漂移。     

2008年深圳市甲3亚型流感病毒基因特异性分析

目的了解2008年深圳市H3N2亚型流感流行及病毒变异情况。方法用狗肾传代细胞（MDCK）和鸡胚进行流感病毒分离,收获病毒后提取病毒RNA,进行逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后送大连宝生物公司纯化及测序,测序结果用SIMMONIC软件和MEGA3.1软件进行序列分析。结果深圳2008年流行的H3N2亚型流感病毒血凝素与深圳2007年流行的差异不大,而与同期疫苗毒株A/Wisconsin/67/2005比较有一定的差异,B抗原决定簇上有1个位点发生替换,158位R替换了K;1个糖基化位点增加,在122位氨基酸由D变成了N;与世界卫生组织推荐的2009年流感疫苗毒株比较差异不大。结论深圳市2008年流行的H3N2亚型流感病毒并未形成新的变种,其漂移趋势与世界H3N2亚型流感漂移趋势一致。     

两株京科猪H1N1亚型流感病毒内部基因来源的研究

目的通过内部基因研究了解两株猪(H1N1)亚型流感病毒内部基因是否含有禽流感病毒基因节段及是否与猪群中H9N2亚型毒株发生了基因重配。方法病毒在鸡胚中传代,从收获的尿囊液中提取RNA,通过逆转录合成cDNA,cDNA用PCR扩增。PCR产物用纯化试剂盒纯化,接着进行核苷酸序列测定,然后用MegAlign(Version1.03)和Editseq(Version3.69)软件进行基因进化树分析。结果两株京科猪H1N1病毒内部基因除PB2基因节段有所不同外,其余5个基因节段均相同,但与猪H1N1流感病毒内部基因相近,然而,与古典型猪H1N1毒株有差异。结论两株京科猪H1N1病毒不是基因重配株,它们的内部基因均属猪H1N1流感病毒基因系。     

甲型H1N1流感病毒样颗粒疫苗的初步研究

目的对甲型H1N1病毒样颗粒的免疫原性和保护效果进行初步研究,为研发不依赖鸡胚生产工艺的流感疫苗提供新的思路。方法使用昆虫-杆状病毒表达系统表达并纯化甲型H1N1流感病毒A/California/07/2009(H1N1)的病毒样颗粒;通过Western blot、血凝、单向免疫扩散,透射电镜等方法鉴定病毒样颗粒;使用A/California/07/2009(H1N1)裂解疫苗作为对照,腹腔注射免疫Balb/c小鼠,并使用A/Beijing/501/2009(H1N1)进行攻毒,评价病毒样颗粒疫苗的免疫原性及保护效果。结果经鉴定,纯化后的病毒样颗粒血凝滴度为1:512,HA含量为92.9μg/ml,颗粒大小在100 nm左右,二免10 d后IgG抗体效价7.9×103,血凝抑制实验测得血抑(Hemagglutination Inhibition,HI)效价384,对50LD50的A/Beijing/501/2009(H1N1)病毒的保护率达到100%。结论甲型H1N1流感病毒样颗粒的免疫原性显著高于裂解疫苗,为发展不依赖鸡胚生产的流感亚单位疫苗提供了技术保证。     

禽流感病毒(H5N1)血凝素蛋白真核表达载体的构建与表达

目的:构建禽流感病毒(H5N1)血凝素蛋白HA真核表达载体并表达其编码蛋白(转染293T细胞)。方法:从江苏H5N1流感病毒毒株(A/Jiangsu/07-4(H5N1))提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增HA全长基因,将其克隆至pMD18-T Vector中构建pMD18-T-HA质粒,双酶切pMD18-T-HA与PXJ40-MYC后,构建真核表达载体PXJ40-MYC-HA,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过West-ern blot鉴定HA蛋白的表达。结果:经双酶切、测序鉴定证实HA基因的真核表达载体构建成功。Western blot法可见HA基因编码蛋白的成功表达。结论:成功构建了H5N1血凝素真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达HA蛋白的细胞模型和HA蛋白功能研究奠定了基础。     

一起甲型H1N1流感疫情病原检测及其HA与NA基因特性研究

目的 确认引起一起流感暴发疫情的病原,阐明该病原的血凝素基因(HA)和神经氨酸酶基因(NA)的特性.方法 疫情中最早出现流感样症状病例的咽拭子样本用real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感病毒核酸,采用鸡胚分离法进行病毒培养,选取两病毒分离株进行HA和NA核苷酸序列测定,并进行基因特性分析.结果 此次流感疫情是由甲型H1N1流感病毒引起的,其HA和NA基因均与参比毒株的HA和NA基因高度同源,NA基因没有发生H274Y突变.结论 本研究的甲型H1N1流感病毒分离株为疫苗亲本株和中国分离株的类似株,对神经氨酸酶抑制剂类药物(如达菲)敏感.     

甲型流感病毒血凝素头部蛋白结构域的原核表达及血清学分析

目的在原核系统中表达流感病毒血凝素(hemagglutinin, HA)头部蛋白并进行血清学分析。方法将H1N1和H3N2型流感病毒的HA头部蛋白编码基因克隆到pET-22b(+)原核表达质粒中, 通过IPTG诱导, 在大肠埃希菌BL21中获得含有HA头部与His-Tag的融合蛋白rH1N1-HA和rH3N2-HA。SDS-PAGE分析IPTG诱导前后的融合蛋白, 验证表达的准确性, Western blot验证重组蛋白的表达。纯化重组蛋白, 多剂次免疫家兔, 获得针对H1N1-HA和H3N2-HA头部的多克隆抗体。同时, 重组蛋白免疫BALB/c小鼠, 评价其免疫原性。结果 rH1N1-HA和rH3N2-HA蛋白在小鼠体内诱导了滴度高于40的血凝抑制抗体, 可作为一种保护性抗原。rH1N1-HA和rH3N2-HA蛋白制备的多克隆抗体, 可作为Western blot、ELISA等免疫学应用的重要材料。结论本研究制备的HA头部蛋白可作为一种保护性抗原, 在小鼠体内诱导保护性抗体。HA头部制备的多克隆抗体, 可用于甲型流感病毒的免疫学和血清学研究。     

人易感H6N1禽流感病毒血凝素蛋白的B细胞抗原表位预测及进化分析北大核心CSCD

目的预测人易感H6N1禽流感病毒血凝素蛋白的B细胞抗原表位,并分析其进化特征。方法从GISAID和Gen Bank两大数据库获得人易感H6N1病毒的血凝素蛋白及近缘序列,采用多款预测软件分别预测了其B细胞线性和构象型抗原表位,并分析了这些表位的保守性、适应性和进化特征。结果综合各种因素共预测出4个线性表位(表位A、B、C和D)和2个构象型表位(表位E和F)。表位C和位点41、157、186、187在进化过程中易发生突变,其余表位较为保守,其中表位D最保守;位点157受到强烈的正选择作用,它可能是H6N1病毒逃避宿主免疫系统攻击的一个关键位点。结论人易感H6N1禽流感病毒血凝素蛋白拥有5个保守的B细胞抗原表位(3个线性、2个构象型)和1个正选择作用位点,将为其疫苗的研制、致病机制的理解和病毒防治提供理论基础。     

北京市2022—2023年甲型H3N2流感病毒流行特征与血凝素基因变异分析

目的掌握2022—2023年北京市流感流行特征及甲型H3N2流感病毒血凝素(hemagglutinin, HA)基因、抗原性变异情况, 为北京市流感防控提供科学依据。方法对北京市2022年第14周至2023年第20周流感病原学监测结果进行统计分析, 并选取不同时间、不同人群来源79株甲型H3N2流感病毒, 通过HA基因扩增测序及抗原性分析实验, 分析其基因变异和进化特征。结果 2022年第14周至2023年第20周, 北京市流感病原学监测流感样病例咽拭子24 244份, 检出流感病毒核酸阳性4 987份, 其中甲型H3N2流感病毒2 749份, 检出阳性率为11.34%。79株毒株中50株(63.29%)为疫苗株的低反应株, 2022年8～11月毒株中94.44%为低反应株, 2023年2～3月毒株中54.10%为低反应株, 两者差异有统计学意义(χ2=8.079, P=0.004)。79株甲型H3N2流感病毒HA基因序列与疫苗株A/Darwin/9/2021相比, 核苷酸相似度为97.47%～98.47%, 氨基酸相似度为97.05%～98.17%。基因进化分析显示2022年8～11...     

猪在禽H9N2亚型流感病毒感染人中的作用

目的　了解猪在禽H9N2亚型流感病毒感染人中的作用。方法　用RT PCR扩增目的基因,用PGEM T Vector(美国Promega公司) 4℃过夜连接,重组质粒转入dH5α细菌,筛选阳性菌落,酶切鉴定,送六合通公司自动测序,然后进行进化树分析。结果　两株山东猪H9N2毒株基因组与人及禽分离出的H9N2病毒均有差异,中国内地从人分离出的H9N2毒株的基因组接近鸡的毒株,而香港特区从人分离出的接近鹌鹑的毒株;禽H9N2毒株不仅宿主范围广,同时其基因组具有多样性。结论　禽H9N2亚型毒株是直接感染人,而不是通过所谓的中间宿主猪,然后再感染人。     

新型甲型H1N1流感病毒HA基因DNA疫苗诱导小鼠产生中和抗体

目的 探讨新型甲型流感病毒(2009H1N1)血凝素(HA)DNA疫苗诱导小鼠产生中和抗体特性.方法 构建2009H1N1或1918甲型流感病毒(1918H1N1)HA蛋白表达质粒2009HA和1918HA,采用25μg或200μg剂量2009HA质粒免疫小鼠,以2009HA或1918HA蛋白为包被抗原,测定小鼠血清中2009HA抗体总量或交叉反应抗体含量,分别用2009H1N1和1918H1N1两种假病毒(pp)测定抗体中和活性.结果 25 μg或200μg的2009HA质粒加强免疫小鼠后,4～16周内两组小鼠血清中2009HA总抗体水平以及对2009H1N1pp的中和抗体滴度相似(P>0.05),都含有与1918HA蛋白交叉反应抗体,对1918H1N1pp的交叉中和抗体滴度相似(P>0.05).结论 小剂量2009HA质粒DNA疫苗能够诱导小鼠产生持久的高水平中和抗体,对于预防新现流感病毒具有潜在应用价值.     

2016—2022年杭州流感病毒流行特征及儿童流感重症感染特征分析

目的了解儿童流感流行特征及流感重症的感染特征。方法收集2016年1月—2022年9月严重急性呼吸道感染住院病例样本1 600份, 门诊流感样病例监测样本7 660份。实时荧光PCR法检测流感病毒。并对流感住院重症病例样本及部分流感门诊病例样本进行其他呼吸道病毒的检测, 分析其临床感染特征和合并感染特征。结果 1 600份严重急性呼吸道感染住院病例样本中, 流感病毒阳性率为6.63%(106例), 甲型H1N1、H3N2、B Victoria(BV)、B Yanagata(BY)的占比分别为49.06%(52/106)、17.92%(19/106)、29.25%(31/106)和3.77%(4/106)。7 660份门诊病例中, 流感阳性率为15.01%(1 150例), 甲型H1N1、H3N2、BV、BY的占比分别为22.17%(255/1 150)、30.96%(356/1 150)、41.39%(476/1 150)和5.48%(63/1 150)。甲型H1N1流感病毒更容易引起儿童流感重症, 差异具有统计学意义(χ2=37.978, P<0.001), 而季节性H3N2和B...     

抗禽流感(H5N1)免疫球蛋白制备及体外抑制甲型流感病毒FM1株的试验研究

目的:制备抗禽流感(H5N1)卵划黄免疫球蛋白(IgY),探讨其体外阻断甲型流感病毒FM1株的作用.方法:对经过禽流感疫苗免疫后产生并富集在卵黄中的卵黄免疫球蛋白进行提纯,用辛酸-硫酸氨二步盐析-凝胶色谱法进行纯化,利用细胞病变(CPE)抑制实验,在狗肾细胞系(MDCK)检测抗禽流感(H5N1)免疫球蛋白无毒浓度(TD0)范围及阻断甲型流感病毒FM1株攻击MDCK细胞的最小阻断浓度.结果:抗禽流感免疫球蛋白对DMCK的无毒浓度为1.764 mg/ml,当浓度为0.082 8mg/ml对流感病毒仍有阻断作用.结论:利用辛酸-硫酸氨二步盐析-凝胶色谱法成功制备卵黄免疫球蛋白,抗禽流感(H5N1)免疫球蛋白体外对流感病毒有较强的抑制作用.     

流感病毒H1N1和H5N1感染小鼠小胶质细胞与星形胶质细胞诱导趋化因子转录水平上调

目的:探讨胶质细胞感染流感病毒后的天然免疫反应,检测流感病毒H1N1和H5N1体外感染小鼠小胶质细胞和星形胶质细胞,是否会诱导胶质细胞趋化因子转录水平的变化及其规律.方法:从新生小鼠大脑皮质分离培养神经胶质细胞,并进一步纯化小胶质细胞和星形胶质细胞,经纯度鉴定后,用感染复数为2的流感病毒H1N1和H5N1进行体外感染,8小时后用免疫荧光检测流感病毒核蛋白(NP)的表达,以确认感染细胞比例.在感染早期(6小时)和感染中期(24小时)分别提取细胞RNA,检测趋化因子转录水平的变化.结果:分离得到小鼠的小胶质细胞和星形胶质细胞,病毒感染后超过95%的细胞可以被感染,感染后的小胶质细胞与星形胶质细胞的CCI-3、CCL-5、CXCL-2、CXCL-9和CXCL-10的转录水平发生不同程度的上调,其中CXCL-10的上调幅度最为明显,禽流感病毒H5N1感染能诱导更强烈的上调反应.结论:流感病毒H1N1和H5N1感染小鼠小胶质细胞与星形胶质细胞,可诱导趋化因子转录水平上调.     

H5N1流感病毒M1蛋白免疫制备的单克隆抗体的研究

目的 制备抗人流感病毒H5N1株M1蛋白的单克隆抗体,为流感的快速诊断和研究提供新的工具.方法 应用在大肠埃希菌中表达的人H5N1亚型禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)株M1蛋白,以纯化的表达产物免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与sp2/0细胞系作细胞融合后,间接ELISA法筛选阳性的杂交瘤细胞,并应用间接免疫荧光法对抗体的特异性进行鉴定.结果 获得3株能稳定分泌抗禽流感病毒M1抗原的McAb杂交瘤细胞株,交叉反应试验及间接免疫荧光检测表明,三株McAb具有型特异性.结论 用H5N1禽流感病毒M1蛋白免疫制备的单克隆抗体,具有一定的交叉反应性,可用于多种亚型甲型流感病毒的检测.     

甲型H1N1流感病毒裂解疫苗的研制和临床观察初步结果

目的 研制甲型H1N1流感疫苗并进行人体安全性和有效性观察.方法 用WHO推荐的甲型H1N1流感疫苗毒种按照季节性流感裂解疫苗工艺研制甲型H1N1流感疫苗,成品参照流感病毒裂解疫苗质量标准进行各项指标检定,用2批血凝素含量不同的试制产品进行临床验证.结果 血凝素含量15μg/剂和30μg/剂各1批试制产品经检定并由中国药品生物制品检定所复检,符合暂定质量标准要求.临床观察显示,960名受试者接种15μg或30μg试验疫苗1针,21 d后血清抗体阳性率、保护率均大于70%.3～11岁、12～17岁、18～59岁及≥60岁,15μg组几何平均滴度(GMT)分别较免疫前增长15、39、37和25倍;30μg组GMT分别较免疫前增长26、72、68和36倍.安全性观察结果显示15μg和30μg组总的不良反应发生率为29.38%和43.75%,其中2级反应率为6.25%和15.42%,3级反应率为0.83%和1.46%,未观察到严重不良反应.结论 按照季节性流感生产工艺研制的甲型H1N1流感病毒裂解疫苗具有良好的安全性和有效性.     

H5N1型高致病性禽流感病毒血凝素蛋白及神经氨酸酶的B细胞抗原表位预测

目的预测H5N1亚型高致病性禽流感病毒HA蛋白和NA蛋白的B细胞表位,为基于B细胞表位的预防性疫苗设计提供依据。方法基于HA蛋白和NA蛋白的蛋白质序列,采用Kyte-Doolittle的亲水性方案,Emini方案,Karplus方案和Jameson-wolf抗原指数方案,并辅以MAGE蛋白的二级结构柔性区域分析,预测HA蛋白和NA蛋白的B细胞表位。结果分别预测出了6条血凝素蛋白(Hemagglutinin,HA)以及6条神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)B细胞优势表位。结论这些B细胞表位可为禽流感疫苗的研制提供实验依据。