粉尘螨Der f5克隆表达、纯化和免疫原性鉴定

目的克隆表达粉尘螨第5组变应原(dermatophagoides farinae,Der f5)基因,并鉴定纯化蛋白免疫原性。方法根据Der f5基因已知序列,设计出相应的引物,提取粉尘螨总RNA,采用RT-PCR方法扩增出Der f5基因片段,PCR产物克隆入pMD18-T载体,转化大肠埃希菌Top10,经PCR和酶切鉴定并测序。将上述所得阳性克隆菌株扩大培养,碱裂解法提取质粒,所得重组质粒pMD18-T-Der f5和空质粒pET-32a同时用限制性内切酶Bam HⅠ与HindⅢ双酶切,经纯化后连接并转化至大肠埃希菌Top10。构建的重组质粒pET32a-Der f5,经PCR、酶切和测序鉴定后,再转化至大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定其表达效果,用Ni+离子亲和层析柱纯化重组质粒pET32a-Der f5表达产生的组氨酸重组蛋白。结果构建了重组质粒pMD18-T-Der f5和pET32a-Der f5。SDS-PAGE结果表明Der f5基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中获得良好的表达,经亲和层析纯化后,SDS-PAGE结果显示单一条带。该蛋白以尘螨过敏患者血清进行Western blotting,结果表明具有良好的IgE结合活性。结论克隆、表达并纯化了具有良好尘螨致敏患者IgE结合活性的Der f5,为粉尘螨变态反应性疾病的特异性诊断和治疗以及进一步的实验研究奠定了基础。     

粉尘螨过敏原Der f 13基因克隆表达与免疫原性鉴定

目的克隆表达粉尘螨过敏原Der f 13,并鉴定其免疫原性。方法提取粉尘螨总RNA,通过RT-PCR获得Der f 13的cDNA片段。根据已知Der f 13序列设计出表达引物,再通过已获得的cDNA和引物进行PCR扩增,将扩增产物连接到T载体上并转入克隆菌Top 10中,涂板、培养,挑选阳性菌落,LB/AMP培养送测序。将测序正确的基因转入表达载体PET32中,经酶切鉴定测序再转入表达菌BL21中,表达Derf 13蛋白,纯化、鉴定所得蛋白,并通过Western-blot等方法检测其免疫学活性。结果 RT-PCR结果显示,Der f 13基因片段大小为410 bp;同源性分析表明:本实验所克隆的Der f 13基因与NCBI数据库的Der f 13基因的同源性为95%;SDS-PAGE结果显示,重组质粒PET32-Der f 13在BL21(DE3)中高效表达,重组蛋白分子质量为35 ku,表达后的重组蛋白主要以可溶性蛋白形式存在,经与尘螨过敏患者血清反应,检测出重组蛋白有较强免疫学活性。结论克隆出Der f 13基因,表达和纯化出目的蛋白,并具有免疫原性,为过敏性疾病的诊断和免疫治疗奠定理论基础。     

粉尘螨变应原Derf1基因的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:原核表达、纯化粉尘螨主要变应原Der f1重组蛋白,并制备其多克隆抗体。方法:大量诱导表达含pET-28a(+)-Der f1质粒的BL21菌株,SDS-PAGE电泳并割胶纯化目的蛋白,以此为抗原免疫新西兰大白兔,收集血清进行效价检测并用Western blot检测其特异性。结果:割胶回收可有效纯化Der f1重组蛋白,抗Der f1抗体效价为1∶32 000。结论:成功制备Der f1多克隆抗体,以期为尘螨过敏性疾病的诊断和免疫治疗提供参考。     

屋尘螨第21类过敏原原核表达和过敏原性鉴定

目的 屋尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus）是引起过敏性疾病的主要过敏原,鉴定其免疫原性是研究哮喘和其他过敏性疾病的基础。由于不同地区生物的多样性,本实验在国内首次对屋尘螨Der p 21进行克隆、表达和免疫原性鉴定。方法 提取屋尘螨总RNA,RT-PCR扩增Der p 21的cDNA片段,根据已知Der p 21序列设计出表达引物,再通过已获得的cDNA和引物进行PCR扩增,将扩增产物连接到克隆载体上并转入克隆菌E.coli Top10中,涂板过夜培养,挑选菌落,保菌,取样送至公司测序。将测序正确的基因转入表达载体PET32中,经酶切鉴定测序再转入表达菌BL21中,大量表达重组蛋白Der p 21经过纯化后,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 检测目的蛋白表达并进行免疫印迹分析(Western blotting)。结果 双酶切显示Der p 21已成功连接在载体上,SDS-PAGE显示目标基因在大肠埃希菌BL21成功表达,纯化后的重组Der p 21蛋白分子量约为50 kD, Western blotting结果显示有明显条带。结论 成功克隆表达Der p 21 cDNA,表达和纯化出重组蛋白,并具有免疫原性。     

含KSHV vIL-6基因原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与鉴定

目的:在大肠埃希菌中表达卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)vIL-6基因,并进一步纯化和鉴定表达蛋白.方法:以本实验室已构建的重组质粒pGEX-6p-1-vIL-6为模板,PCR扩增目的基因片段,将PCR产物克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,构建vIL-6的重组原核表达质粒pET-32a(+)-vIL-6.将重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白.表达产物通过镍亲和层析柱纯化并经蛋白质印迹法鉴定.结果:限制性内切酶检测和基因测序证实,成功构建了含有vIL-6基因的原核表达载体.蛋白质印迹法结果显示,在大肠埃希菌BL21(DE3)中His-Tag融合蛋白得到了表达,亲和层析法纯化后获得了相对分子质量为43 000的vIL-6融合蛋白.结论:重组质粒pET-32a(+) -vIL-6能在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,利用镍亲和层析柱可纯化获得融合蛋白.     

甲基CpG结合域四聚体蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的 在大肠埃希菌中表达甲基CpG结合域四聚体蛋白,并对其进行纯化和鉴定。方法 将重组表达质粒4×MBD-pET30b+转化大肠埃希菌DH5a克隆扩增并测序鉴定后,转化大肠埃希菌BL21（DE3）后接种于LB 培养基中,异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白的表达, 表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达,用此蛋白免疫染色人胚肾细胞后用荧光显微镜观察。结果 克隆质粒测序结果与理论预期完全一致,SDS-PAGE显示在大肠埃希菌中表达出相对分子量为46 000的目标蛋白,Western blot显示目标蛋白带有His融合标签（氨基端）和HA标签（羧基端）。荧光显微镜观察显示MBD蛋白能与细胞内的甲基化CpG基序特异性结合。结论 成功表达并纯化了具有免疫原性的甲基CpG结合域四聚体蛋白,为今后进一步研究DNA甲基化奠定了基础。     

日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj26GST的构建及其表达

目的 构建日本血吸虫重组质粒pET28a-Sj26GST,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达.方法 超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增获得Sj26GST抗原编码基因,克隆至原核表达载体pET28a,构建重组质粒pET28a-Sj26GST,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定.结果 RT-PCR扩增出676 bp的Sj26GST基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST基因成功插入pET28a中,SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约为36×103的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的26%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别.结论 成功构建了日本血吸虫重组质粒pET28d-Sj26GST,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性.     

粉尘螨变应原第2组分真核表达载体的构建及其在小鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的 构建含粉尘螨变应原第2组分(Der f 2)基因真核表达载体,并观察其在小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达.方法 提取粉尘螨总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法扩增Der f 2基因,测序鉴定后将Der f 2基因克隆入pcDNA3.0质粒中,构建真核表达载体pcDNA3.0-Der f 2.将小鼠BMSCs分3组进行实验,包括pcDNA3.0-Der f 2转染组、pcDNA3.0空质粒转染组及未转染组,分别利用RT-PCR、蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Der f 2基因及蛋白在3组BMSCs中的表达.结果 扩增的Der f 2基因序列与GenBank的参考序列完全一致,Der f 2基因正确克隆至真核表达载体pcDNA3.0中.转染BMSCs 48 h后,RT-PCR、Western blot检测结果显示,未转染组和pcDNA3.0空质粒转染组未检测到Der f 2基因表达,pcDNA3.0-Der f 2转染组检测到特异性条带,且大小与预期相符.结论 pcDNA3.0-Der f 2真核表达载体构建成功,Der f 2的mRNA和蛋白能在小鼠BMSCs中正确表达.     

幽门螺杆菌UreB414-OMP18-LTB融合蛋白的构建及免疫原性初步研究

目的 构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp) 尿素酶B亚单位活性片段(UreB414)、外膜蛋白(OMP18)及大肠埃希菌LTB融合疫苗并研究其抗原性.方法 PCR扩增ureb414、omp18、ltb基因,分别克隆入pMD18-T载体,测序并鉴定方向后依次连接,构建融合基因UOL,然后将其亚克隆入原核表达载体pET-28a,转化入大肠埃希菌BL21,SDS-PAGE电泳进行表达,Western印迹检测表达蛋白的抗原性.结果 PCR扩增分别获得约414、537 bp和320 bp产物,与GenBank中相关序列具有高度同源性,三者融合后获得一约1 200 bp目的 基因.重组融合蛋白表达量可达细菌总蛋白的15%,免疫印迹检测结果显示该重组蛋白可为UreB、OMP18、LTB兔抗血清特异识别,具有良好的抗原性.结论 成功构建了具有良好免疫原性的UreB-OMP18-LTB融合蛋白.     

日本血吸虫SJCHGC02377蛋白部分片段的克隆与表达

目的:克隆和表达日本血吸虫SJCHGC02377蛋白。方法:采用RT-PCR从日本血吸虫成虫总RNA中扩增出编码SJCHGC02377蛋白的基因片段;经克隆和测序分析后,亚克隆至表达载体pET-23 a(+),转化大肠埃希菌BL21,菌落PCR和双酶切鉴定;阳性菌株经IPTG诱导表达SJCHGC02377蛋白部分片段,亲和层析予以纯化。结果:RT-PCR扩增出SJCH-GC02377蛋白基因片段;获得的阳性克隆序列与GenBank中登录的日本血吸虫SJCHGC02377蛋白的基因序列一致;SJCH-GC02377蛋白基因被亚克隆到原核表达载体pET-23 a(+),在BL21中获得了表达,表达的蛋白经亲和层析获得纯化。结论:成功构建了日本血吸虫SJCHGC02377蛋白的重组表达质粒,在大肠埃希菌中获得表达。     

Solid and liquid state characterization of tetrahydrocurcumin using XRPD,FT-IR,DSC, TGA,LC-MS,GC-MS,and NMR and its biological activities

Tetrahydrocurcumin (THC) is one of the major metabolites of curcumin (CUR), an ancient bioactive natural polyphenolic compound. This research article describes both the solid and liquid state characterization of THC using advanced spectroscopic and thermo-analytical techniques. Anti-inflammatory, anti-oxidant, and neuroprotective activities of THC were investigated using in vitro cell lines. Liquid chromatography-mass spectrometry analysis revealed that our sample comprised 95.15% THC, 0.51% tetrahydrodemethoxycurcumin (THDC), 3.40% hexahydrocurcumin, and 0.94% octahydrocurcumin. Gas chromatography-mass spectrometry analysis indicated the presence of 96.68% THC and 3.32% THDC. THC in solution existed as keto-enol tautomers in three different forms at different retention time, but the enol form was found to be dominant, which was also supported by nuclear magnetic resonance analysis. THC was thermally stable up to 335.55 °C. THC exhibited more suppression of cytokines (TNF-α, IL-1β, and MIP-1α) than CUR in a concentration-dependent manner in mouse splenocytes, while NK-cell and phagocytosis activity was increased in macrophages. THC showed a significant reduction of free radicals (LPO) along with improved antioxidant enzymes (SOD and catalase) and increased free radical scavenging activity against ABTS⁺ radicals in HepG2 cells. THC displayed higher protection capability than CUR from oxidative stress and neuronal damage by improving cell viability against H₂O₂ induced HepG2 cells and MPP⁺ induced SH-SY5Y cells, respectively, in a concentration-dependent manner. Thus, a variation of the biological activities of THC might rely on its keto-enol form and the presence of other THC analogs as impurities. The present study could be advantageous for further research on THC for better understanding its physicochemical properties and biological variation.