溶氧反馈-补料分批技术高密度培养基因重组MAGE1/HSP70/MAGE3工程菌

目的 建立人黑色素瘤抗原MAGE1/HSP70/MAGE3融合蛋白基因重组工程菌E.coli.BL21/pET-MHM的高密度发酵工艺.方法 以摇瓶发酵结果为基础,扩大至NBS Bioflo Ⅳ 20 L发酵罐发酵,利用溶氧反馈-补料分批培养技术,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如发酵培养基、活化时间、诱导浓度及时间、pH值及分批补加营养物质等进行优化.结果 保持培养过程中40%的溶解氧,采用半合成培养基、活化至对数生长期时0.2 mmol/L IPTG诱导5 h以及以甘油为碳源连续流加补料的条件发酵,连续3批重复发酵,最终菌密度D(600)均达45～50时,菌体量可提高至70 g/L以上,目的蛋白的表达量占菌体蛋白总量的38%以上.结论 确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺.     

重组人血管内皮细胞生长因子工程菌高密度发酵工艺研究

目的建立人血管内皮细胞生长因子(BL21/pET-24a/hVEGF121)工程菌的高密度发酵工艺.方法采用发酵罐发酵,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如培养基、诱导时间及补料进行优化.结果采用M9复合培养基、活化至对数生长期时诱导4 h以及以甘油为碳源连续流加补料的条件发酵,可使菌体量提高至68 g/L,rhVEGF121的表达量达菌体蛋白总量的23%.结论该发酵工艺提高了工程菌的产量和rhVEGF121的表达水平.     

重组人血管内皮细胞生长因子工程菌高密度发酵工艺研究

目的 建立人血管内皮细胞生长因子(BL21/pET-24a/hVEGF₁₂₁)工程菌的高密度发酵工艺。方法 采用发酵罐发酵,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如培养基、诱导时间及补料进行优化。结果 采用M9复合培养基、活化至对数生长期时诱导4 h以及以甘油为碳源连续流加补料的条件发酵,可使菌体量提高至68 g/L,rhVEGF₁₂₁的表达量达菌体蛋白总量的23%。结论 该发酵工艺提高了工程菌的产量和rhVEGF₁₂₁的表达水平。     

重组人肝细胞生长因子β链工程菌的高密度发酵

目的　实现重组人肝细胞生长因子 β链 (rhHGFβ)工程菌的高密度高表达发酵。 方法　首先在摇瓶中进行了培养条件的摸索 ,确定了该工程菌的培养条件、诱导起始时间和诱导时间 ,然后用 15L自控发酵罐进行分批补料培养 ,发酵中分阶段限制性流加氮、碳源 ,保持溶氧在 30 %以上。结果　菌体发酵密度达到 39g/L(湿菌重 ) ,达到并超过了重组蛋白在摇瓶中的表达水平 ,重组蛋白的表达占菌体总蛋白的 30 %左右。结论　本研究为rhHGFβ进一步下游纯化及功能研究奠定了基础。     

导向性人干扰素α2a工程菌的高密度发酵

目的:优化大肠杆菌表达导向性人干扰素α2a的中试发酵工艺,以获得工程菌的高密度发酵和目的蛋白的高表达. 方法:采用发酵罐发酵,对影响工程菌生长和目的蛋白表达的条件,如pH值、活化时间、诱导时间、溶氧范围及补料流加方式等进行优化. 结果:根据优化条件,连续三批重复发酵10 L工程菌,最终菌体密度均达A600 nm 25～30,菌体获得量均可达湿重50 g/L以上,目的蛋白表达量均为3.2×109 U/L以上. 结论:此发酵工艺具有周期短、产量高以及重复性稳定性好的特点,为下游纯化和进一步大规模生产奠定基础.     

重组蛛丝蛋白工程菌高密度发酵及蛋白的纯化

蜘蛛丝是自然界中性能优良的天然蛋白纤维。为了从基因工程菌中获取大量的重组蛛丝蛋白，采用溶氧反馈．分批补料的高密度发酵方法，在培养过程中保持溶解为30％～40％，以溶氧反馈控制补料培养基流加速度，成功地进行了工程菌的高密度培养，最终菌体OD600达51．2，菌体干重24、1g／L，重纽蛛丝蛋白表达率22．1％，并采用金属亲和层析对重组蛛丝蛋白进行了有效纯化。     

重组幽门螺杆菌粘附素工程菌高密度发酵条件的研究

目的研究重组幽门螺杆菌粘附素基因工程菌的发酵工艺.方法采用德国B.Brau公司C-10型15 L发酵罐发酵,对影响工程菌生长和目的蛋白的表达条件进行了优化.结果在优化的条件下,15 L发酵罐发酵工程菌,菌体收获量可达48.2g/L,目的蛋白表达量约占总蛋白的31.5%.结论此发酵工艺可以提高工程菌收获和目的蛋白的表达.     

重组SRH融合蛋白工程菌发酵的工艺研究

目的通过对影响表达SRH融合蛋白工程菌发酵的主要因素的研究,建立适宜SRH融合蛋白工程菌的发酵工艺。方法通过对发酵过程中的pH、溶氧调控、诱导温度、诱导时机及诱导时间进行优化建立SRH蛋白的发酵工艺,利用SDS-PAGE电泳分析表达情况。进一步利用离子交换和凝胶过滤层析对目的蛋白进行纯化,并对纯化后目的蛋白的溶栓活性和抗凝活性进行检测。结果优化后发酵条件为:发酵pH为7.0、溶氧为45%、菌体浓度达到OD600=8时开始诱导,诱导温度为41℃,诱导时间为4.5h。该发酵条件下得菌量为25g/L。SRH蛋白表达量为45%,并且90%以上为可溶性表达,纯化后蛋白纯度达95%以上,纯品SRH蛋白溶栓活性为1.80×104AU/mg,抗凝活性为100AU/mg。结论建立了SRH融合蛋白工程菌稳定的发酵工艺,该条件下SRH工程菌发酵蛋白表达量较高,多为可溶性表达,且杂蛋白较少,发酵产物具有生物学活性。     

TRAIL工程菌的高密度发酵及其体内活性的测定

目的实现TRAIL工程菌的高密度发酵,并测定TRAIL在体内的抗瘤活性。方法利用自控发酵罐,采用恒定溶氧、连续补料的方法对TRAIL工程菌进行了高密度发酵,从发酵菌体中纯化TRAIL蛋白,构建动物肿瘤模型,用所纯化的蛋白进行体内抗瘤试验。结果高密度发酵取得成功,发酵菌中TRAIL的表达量与摇瓶中的相当,摇瓶水平纯化TRAIL蛋白的工艺也适用发酵水平,体内试验显示TRAIL对小鼠移植瘤的抑制率达到67.2%。结论TRAIL工程菌成功实现高密度发酵,TRAIL蛋白在体内具有明显的抗瘤活性。     

重组人锰超氧化物歧化酶高密度发酵培养条件研究

目的:研究发酵罐中采用乳糖诱导高效表达重组人锰超氧化物歧化酶(rhMn-SOD)的条件。方法:通过摇瓶和发酵罐培养研究了培养基、乳糖浓度、诱导时机、表达时间、溶氧条件、补料碳源种类对rhMn-SOD表达的影响。结果:乳糖诱导浓度为0.25%,溶氧浓度为40%～60%,用葡萄糖作为补料碳源进行高密度发酵,菌体密度A600达到28.98,菌体湿重达到60g/L,Mn-SOD活性达到18222.22U/g,比活为1057.5U/mg,实现了rhMn-SOD的高效表达。结论:对培养基配方和发酵条件进行了优化,为rhMn-SOD大规模生产奠定了基础。     

CEA微型抗体载体的构建及在大肠杆菌中的高效表达

目的制备适合放免显像的抗癌胚抗原微型抗体。　方法在已获得的抗癌胚抗原重链可变区 (VH)及轻链可变区 (VL)基因的基础上将重链可变区 (VH)与轻链可变区 (VL)基因直接连接制成微型抗体基因 ,并在大肠杆菌进行表达。　结果大肠杆菌高效表达了微型抗体C端 6×His的融合蛋白 ,表达量达菌体总蛋白的 15 % ,SDS -PAGE和Western印迹显示表达物分子量为 2 6kd与基因编码蛋白的理论推算值相符 ,RIA表明表达物与CEA特异性结合。结论大肠杆菌表达是制备抗癌胚抗原微型抗体的有效途径     

TTV蛋白抗原在大肠杆菌中的表达

目的 :用原核系统表达TTV的重组蛋白抗原 ,建立诊断TTV感染的特异性方法。方法 :采用PCR方法扩增TTVORF2 基因 ,将之插入到测序质粒载体中进行测序 ,验证序列正确后再嵌入到原核表达载体pQE30 ,并转化大肠杆菌M15菌株 ,进行诱导表达。用SDS PAGE分析表达产物。表达产物经Ni NTA柱层析纯化后 ,得到纯度为90 %的ORF蛋白抗原。用TTV感染者的阳性血清对该蛋白进行了Western BlotBlotting分析。结果 :经IPTG诱导后 ,筛选出 2株高表达株。结论 :该蛋白具有良好的抗原活性     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因工程菌发酵工艺的研究

目的研究建立大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)基因工程菌的发酵工艺.方法先通过摇瓶培养初步确定工程菌的最适生长条件,然后以此为基础在发酵罐中比较、筛选影响菌体生长和目的蛋白表达率的各种条件,并进一步对发酵工艺进行改良优化.结果经试验确定了rLTB基因工程菌发酵罐培养的各项条件的最佳组合,优化后工程菌菌体产量平均可达40.5 g/L,目的蛋白的表达率平均为30.6%.结论建立了稳定、高效的工程菌发酵工艺.     

重组人白细胞介素－3在大肠杆菌中表达及纯化研究

将化学合成的人白细胞介素－３（ｈＩＬ－３）基因与表达质粒ｐＫＫ２２３－３重组并转化大肠杆菌ＪＭ１０５，重组菌在摇瓶中发酵并诱导表达，表达产量达菌体蛋白质总量的５３％以上。发酵菌经超声破碎后得到包含体，经洗涤处理使包含体纯度达９０％以上。用８ｍｏｌ／Ｌ盐酸胍溶解包含体后直接透析复性，复性液经Ｓｅｐｈｏｒｏｓｅ－ＳＰ离子交换层析，得到纯化的重组ｈＩＬ－３，纯度达９８％。用ＴＦ－１细胞进行体外检测活性，比活达到１０８单位／ｍｇ蛋白质。本研究为重组人白细胞介素－３的大规模生产提供了条件。     

大肠杆菌表达的重组人骨形成蛋白—3C端肽的纯化

目的：在用大肠杆菌表达人骨形成蛋白－３羧基端肽段获得成功的基础上，进一步探讨ｒｈＢＭＰ－３Ｃ的纯化方法。     

白细胞介素31在E.coli中的表达及活性鉴定

目的构建人IL-31原核表达载体，在大肠杆菌中表达，研究人IL-31对人表皮角化细胞分泌趋化因子MIP-3β的活性影响。方法大量培养pET28a（＋）-hIL-31工程菌株，提取质粒，BamHI、HindⅢ双酶切，并将其连接到原核表达载体pET32a（＋），通过IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中表达。用RT-PCR检测该目的蛋白对人表皮角化细胞HaCaT表达趋化因子MIP-3β的影响。结果原核表达质粒pET32a（＋）-hIL-31构建正确，经双酶切、PCR和序列测定鉴定，序列正确，IPTG诱导目的基因在大肠杆菌中大量表达，纯化后的目的蛋白可刺激人表皮角化细胞表达MIP-3β。结论原核表达质粒pET32a（＋）-hIL-31构建正确，纯化后的蛋白具有生物学活性，可刺激人表皮角化细胞表达趋化因子MIP-3β，为研究人IL-31的作用及其作用机制和制备单克隆抗体奠定了基础。     

重组NADPH-细胞色素P450还原酶在大肠杆菌中的表达和纯化

目的 在大肠杆菌中表达重组NADPH-细胞色素P450还原酶(CPR)并纯化获得有活性的CPR蛋白。方法 将已构建的NADPH-细胞色素P450还原酶重组质粒pMWl72a-CPR采用温和转化法转入大肠杆菌BL-21中,依次使用超速离心、DE52纤维素阴离子交换层析和2’-5’ADP亲和层析的方法纯化CPR,并检测酶的活性。结果 获得了纯度达99％以上的可溶性CPR蛋白,纯化倍数5、20倍,检测酶的比活性为每分钟1045．49nmol／mg。结论获得了纯度高、有活性的CPR蛋白,可作为工具酶用于某些相关酶的研究,同时也为CPR的工业纯化提供了可行的参考路线。