胃上皮永生细胞、胃腺癌细胞和胃腺癌淋巴结转移细胞多耐药基因1和P-糖蛋白的表达

目的:探讨胃上皮永生细胞、胃腺癌细胞和胃腺癌淋巴结转移细胞中多耐药基因1(mdr1)和P-糖蛋白(P-gp)的表达.方法:常规培养胃上皮永生细胞系(GES-1)、胃腺癌细胞系(BGC823)和胃腺癌淋巴结转移细胞系(SGC7901)细胞,用RT-PCR和原位杂交检测此3种细胞的mdr1 mRNA表达,用免疫印迹和免疫组化检测它们的P-gp表达,用流式细胞仪检测阿霉素在细胞内的蓄积以判断它们的P-gp功能状态.结果:在原位杂交的标本上,杂交信号呈紫蓝色颗粒,分布于胞质.GES-1细胞颗粒数量少,BGC823颗粒数量多,细胞轮廓十分明显;SGC7901颗粒细小而少,少数细胞杂交信号丰富.免疫印迹显示GES-1 P-gp的表达较BGC823和SGC7901弱;GES-1 P-gp积分光密度为46.36±19.24,BGC823为61.32±28.46,SGC7901为50.45±21.36,BGC823的P-gp表达强于SGC7901和GES-1(P＜0.05),SGC7901和GES-1的差异无统计学意义(P＞0.05).GES-1阿霉素特异荧光强度为10.12±4.18,BGC823为27.44±7.06,SGC7901为35.88±14.55,3者相比差异有统计学意义(P＜0.001).结论:在胃癌的发生发展中,细胞对抗肿瘤药的反应性不同,随着细胞恶性变,P-gp介导的耐药性增加.     

青蒿琥酯对胃癌耐药细胞SGC7901/mdr1阿霉素耐药性的影响

目的以胃癌细胞SGC7901为对照,观察青蒿琥酯(Art)对胃癌耐药细胞SGC7901/mdr1的阿霉素耐药性的影响。方法四甲基偶氮唑蓝法检测Art耐药逆转性,将培养的SGC7901和SGC7901/mdr1细胞加入不同浓度的Art,确定Art逆转SGC7901/mdr1细胞阿霉素耐药性的浓度;加入不同终浓度的阿霉素并不断调整,直至对SGC7901/mdr1和SGC7901细胞的抑制范围均涵盖50%的抑制率,确定阿霉素的实验浓度;2种细胞均加入确定好的不同浓度阿霉素,SGC7901细胞设为亲本对照组,SGC7901/mdr1细胞分为2组,加入确定耐药逆转Art浓度的设为实验组,不加Art的设为Art阴性对照组,判断Art对耐药细胞SGC7901/mdr1的耐药逆转效果。结果 Art对SGC7901和SGC7901/mdr1细胞均有生长抑制作用,不同浓度Art之间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05);Art对SGC7901/mdr1的50%抑制浓度高于SGC7901细胞(P<0.05);Art对SGC7901/mdr1和SGC7901细胞20%抑制浓度的差异无统计学意义(P>0.05),取二者的平均值110 mg·L-1作为Art对SGC7901/mdr1细胞的耐药逆转浓度。涵盖SGC7901/mdr1和SGC7901细胞50%抑制率的阿霉素质量浓度为3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 mg·L-1。SGC7901/mdr1细胞实验组、Art阴性对照组和亲本对照组的细胞生长抑制率随阿霉素浓度的不断增加而增高,不同浓度阿霉素之间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05);阿霉素对实验组细胞的50%抑制浓度低于Art阴性对照组(P<0.05),与亲本对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Art对耐药细胞SGC7901/mdr1的耐药逆转倍数约为2.31倍,相对逆转率约为83.00%。结论 Art对SGC7901/mdr1有生长抑制作用;Art可以逆转耐药细胞SGC7901/mdr1对阿霉素的耐药性。     

人胃癌SGC7901/VCR裸鼠移植瘤模型的建立及耐药性检测

目的建立人胃癌SGC7901/VCR裸鼠移植瘤模型,并检测其多药耐药性,为进行肿瘤多药耐药逆转剂的筛选和体内实验研究奠定基础。方法采用皮下接种法建立裸鼠移植瘤模型;观察裸鼠生长状况;移植瘤生长情况;进行瘤重及瘤体积比较;移植瘤P-gp耐药蛋白表达;原代培养细胞,检测移植瘤模型多药耐药性。结果人胃癌SGC7901/VCR裸鼠移植瘤组织病理学检查为低分化腺癌,移植瘤组织原代细胞培养后,P-gp表达强阳性+++,具有多药耐药性,模型建立成功。结论成功建立了人胃癌SGC7901/VCR裸鼠多药耐药移植瘤模型,为胃癌耐药研究提供了较理想的动物模型。     

三氧化二砷对胃癌耐药细胞P-gP、GST-s表达的抑制

目的 研究三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)对胃癌细胞多药耐药细胞的P-糖蛋白(p-glucoprotein,P-gp)、谷胱甘肽s转移酶(glutathione-s transferring enzyme,GST-s)抑制作用.方法 逐渐递增长春新碱(vincristine,VCR)浓度诱导胃癌细胞株SGC7901产生耐药性SGC7901/VCR.MTT法测定诱导前后VCR、5-氟尿嘧啶(fluorouacil,5-Fu)、表阿霉素等抗癌药对肿瘤细胞的杀伤作用,从而明确SGC7901/VCR是否对多种化疗药物产生耐药-即具有多药耐药性;Western blot测定肿瘤细胞内P-gp、GST-s表达.结果 胃癌SGC7901/VCR细胞对VCR、5-Fu、表阿霉素的耐药倍数分别为16.56倍、2.69倍及13.05倍.经As2O3预处理24 h后,VCR、5-Fu、表阿霉素对SGC7901/VCR的耐药倍数显著下降(P<0.05).SGC7901/VCR在静息时细胞内P-gP、GST-s8蛋白表达显著高于SGC7901.而As2O3可使SGC7901/VCR细胞内P-gP、GST-s蛋白表达显著下降.结论 三氧化二砷可以抑制P-gP、GST-s蛋白的表达,从而降低细胞的耐药性.     

SGC7901和SGC7901/ADR细胞中S100A6蛋白及mRNA的表达

目的：探讨S100A6与胃癌多药耐药的关系。方法：常规培养人胃癌细胞SGC7901及其耐药细胞株SGC7901/ADR,在SGC7901/ADR细胞培养基中加入阿霉素（0.375mg/L）维持耐药。取对数生长期的SGC7901和SGC7901/ADR细胞,分别采用免疫细胞化学方法、Westernblot方法和RT-PCR检测S100A6蛋白及mRNA的表达情况。结果：免疫细胞化学染色结果显示S100A6在SGC7901细胞中的阳性染色强度高于SGC7901/ADR细胞;Westernblot结果显示SGC7901细胞中S100A6蛋白的相对表达量（4.356±0.759）高于SGC7901/ADR细胞的（2.243±0.089）（t=4.788,P=0.039）;RT-PCR结果显示SGC7901细胞中S100A6mRNA的相对表达量（0.659±0.017）与SGC7901/ADR的（0.582±0.060）相比,差异无统计学意义（t=2.125,P=0.150）。结论：S100A6蛋白在SGC7901和SGC7901/ADR细胞中的差异性表达可能与细胞多药耐药有关;这种差异表达是翻译后事件。     

TRAF1基因干扰质粒的构建及其对胃癌细胞生物学功能的影响

目的:构建T F1基因干扰重组质粒及建立T F1基因干扰瞬时转染胃癌细胞模型,然后通过干扰目标胃癌细胞中的T F1基因来检测T F1对胃癌细胞的生物学功能的影响。方法:首先通过real-time PCR和Western印迹验证T F1在胃癌细胞系BGC823,SGC7901,MGC803中的表达,筛选出T F1表达量最高的一株细胞作为干扰转染的目标细胞;设计及构建3个T F1的shRNA表达载体pLVX-shRNA-T F1-shRNA1~3,将其分别转染至目标胃癌细胞系中,应用real-time PCR和Western印迹筛选出干扰效率最强的shRNA,最后通过M及流式细胞术检测T F1对胃癌细胞凋亡能力的影响,通过Transwell小室迁移实验来检测对其迁移功能的影响。结果:与GES-1比较,T F1基因在BGC823,SGC7901,MGC803中的表达均有上调(P<0.05),其中以BGC823表达最高;3个T F1shRNA对T F1基因均有抑制作用,以pLVX-shRNA-T F1-shRNA2干扰效果最强;干扰胃癌细胞BGC823中的T F1可使细胞生长活力减弱,凋亡明显增加,但对其迁移功能无明显影响。结论:T F1基因在胃癌细胞系BGC823中上调最明显;pLVX-shRNA-T F1-shRNA2可成功干扰BGC823中T F1的表达;T F1可抑制BGC823细胞的凋亡。     

抑制P13K/PKB通路逆转胃癌耐药的作用及其机制

目的 观察抑制PI3K/PKB信号通路对胃癌耐药性的逆转作用,并探讨其可能机制. 方法 通过体内外实验方法检测长春新碱(vincristine,VCR)及联合LY294002(PI3K/PKB通路抑制剂)埘SGC7901/VCR细胞的生长抑制作用;采用Western blot及RT-PCR分别检测细胞中PKB、磷酸化PKB的蛋白表达水平及MDR1、Bax、Bcl-2基因表达水平;流式细胞仪检测细胞的凋亡.结果 LY294002能明显增加SGC7901/VCR细胞对VCR的敏感性,促进VCR诱导细胞凋亡,使其耐药指数从40.45降至8.50;LY294002可明显降低耐药细胞中磷酸化PKB的蛋白表达和MDR1、Bcl-2的基因表达水平(P<0.01),促进Bax的基因表达(P<0.01);体内实验显示联合用药组的裸鼠移植瘤大小明显小于VCR组(P<0.01). 结论 抑制PI3K/PKB通路可逆转胃癌耐药,其机制可能与降低耐药基因MDR1的表达以及调控相关凋亡基因Bax和Bel-2的表达有关.     

朊蛋白在耐阿霉素胃癌细胞系SGC7901/ADR中的过表达及其意义

目的 探讨朊蛋白(PrP)在耐阿霉素胃癌细胞系SGC7901/ADR中过表达及其与胃癌多药耐药性的相关性。方法(1)利用Northern印迹和Western印迹分别从RNA 水平和蛋白质水平检测朊蛋白在胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR及其亲本细胞SGC7901中的表达;(2)借助DNA重组技术构建朊蛋白基因的正反义真核表达载体;(3)通过电穿孔方法将正反义真核表达载体分别转入SGC7901和SGC7901/ADR细胞;(4)以流式细胞仪检测瞬时转染细胞中的阿霉素蓄积和潴留。结果(1)Northern印迹和Western印迹结果提示朊蛋白在SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中的表达显著高于其在SGC7901中的表达;(2)将正反义真核表达载体转入SGC7901(命名为PS)和SGC7901/ADR(命名为PA)中,PCDNA3.1空载体转入SGC7901(命名为BS)和SGC7901/ADR(命名为BA);转染48h后检测转染细胞的平均阿霉素荧光强度,阿霉素蓄积BS为8.9±0.7,PS为6.6±0.3,BA为5.5±0.7,PA7.5±0.6,阿霉素潴留BS为8.0±0.7,PS为5.9±0.5,BA5.1±0.7,PA为7.1±0.5,PS与BS相比两组均为P<0.01,BA与BA相比均为P<0.01表达,并对胃癌细胞,具有统计学意义。结论 朊蛋白在胃癌耐药细胞系SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中高表达并对胃癌细胞的药物蓄积有影响。     

苦参碱逆转人胃癌细胞株SGC7901/VCR耐药性实验研究

目的 研究苦参碱(Matrine)对人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR的多药耐药的逆转效应及其机制.方法 以长春新碱(VCR)诱导的人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR为研究对象,MTT法研究苦参碱对体外培养的人胃癌多药耐药细胞株SGC7901/VCR细胞增殖的影响及逆转效应、用间接免疫荧光法经流式细胞仪检测MRP的表达并分析其机制.结果 MTT法显示苦参碱在0.5、1.0、2.0 mg·mL-1浓度下处理SGC7901/VCR细胞72 h后,其生长抑制率依次为10%、15%、32%,且可以逆转SGC7901/VCR对VCR的耐药,呈剂量依赖性,逆转倍数分别为9.4、13.4、24.5倍.0.5 mg·mL-1苦参碱与SGC7901/VCR细胞共同培养24 h后,SGC7901/VCR细胞的MRP表达从(36.00±4.32)%降低至(25.00±3.85)%(P<0.01).结论 苦参碱可以体外逆转人胃癌细胞多药耐药细胞SGC7901/VCR的耐药性,其逆转机制与降低MRP的表达有关.     

胃癌SGC7901细胞长春新碱耐药性相关miRNA的初步分析

目的 探讨胃癌SGC7901细胞对长春新碱(VCR)化疗药物耐药相关的微小RNA(miRNA),并预测异常表达miRNA的靶基因.方法 体外培养胃癌SGC7901细胞和胃癌VCR耐药细胞SGC7901/VCR;提取总RNA并质检,采用miRNA 8.0微阵列芯片检测分析miRNA表达谱;荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)验证差异表达的miRNA,生物信息学分析软件预测可能调控的靶基因;采用Western blot方法检测靶基因的蛋白表达水平.结果 芯片检测发现,SGC7901和SGC7901/ VCR细胞中63个异常表达的miRNA;其中miR-1267、miR-221、miR-223、miR-200c、miR-99a表达显著性上调;miR-122、miR-1246、miR-302a、miR-195、miR-124表达显著性下调.在胃癌细胞和胃癌组织中验证结果初步显示,miRNA-122和miR-302a可能分别调控靶基因IGF-IR和WDR62.结论 获得的差异表达miRNA,以及预测的靶基因IGF-IR和WDR62可能在胃癌化疗药物VCR耐药中起关键性作用.     

维胺酸对人胃癌细胞SGC─7901的分化诱导作用

应用图象分析、聚丙烯酰胺凝胶同工酶电泳、放免、伴刀豆球蛋白凝集反应等，观察了维胺酸对人胃癌细胞系ＳＧＣ－７９０１的分化诱导作用。结果发现，一定剂量的维胺酸对细胞的生长、增殖有抑制作用，使细胞内ＤＮＡ平均含量下降，核面积变小，ＬＤＨ同工酶谱发生变化，Ｈ型亚基升高，Ｍ型亚基降低，细胞ＣＥＡ分泌量和ＣｏｎＡ凝集反应均显著下降。光镜下，细胞铺展较好，排列较有序，叠堆生长少见，细胞质嗜碱性降低。以上结果说明，维胺酸对细胞形态以及生理、生化等方面均有影响，并产生一定的分化诱导作用     

生长抑素对胃癌SGC-7901细胞VEGF、NF_κB表达的影响

目的研究生长抑素对胃癌SGC-7901细胞血管内皮生长因子（VEGF）、核转录因子-κB（NFκB）表达的影响。方法不同浓度生长抑素处理SGC-7901。MTT法测量吸光度值,计算细胞生长抑制率;免疫细胞化学（SP）法检测VEGF、NFκB蛋白表达的变化;RT-PCR半定量检测VEGF、NFκB mRNA表达水平。结果实验组与对照组比较,细胞生长抑制率有明显差异（P〈0.05）,同一实验组不同时间点（24、48、72h）间比较,细胞生长抑制率也有明显差异（P〈0.05）,表明生长抑素对SGC-7901细胞生长抑制作用有剂量时间依赖性;不同浓度生长抑素处理48h后,SGC-7901细胞VEGF、NFκB蛋白表达下降,实验组与对照组比较有明显差异（P〈0.05）;mRNA的表达呈浓度依赖性降低,实验组与对照组比较有明显差异（P〈0.05）。结论生长抑素能下调胃癌SGC-7901细胞VEGF、NFκB表达,抑制胃癌细胞增殖。     

反义Survivin核酸对荷瘤裸鼠放疗敏感性影响的初步研究

目的 探讨反义Survivin核酸(anti-pcDNA3-svv)对荷瘤裸鼠放疗敏感性的影响.方法 采用电转染法转染胃癌细胞系SGC7901,观察转染组(SGC7901-SVVanti)和未转染组(SGC7901)在体内(裸鼠)和体外(细胞水平)对放射线敏感性的不同;采用免疫组化SP法对比转染组和未转染组裸鼠肿瘤中Survivin蛋白表达的不同.结果 SGC7901-SVVanti组细胞随着照射剂量的升高,细胞存活率明显低于SGC7901组,其IC50分别为(718.7±1.6)cGY和(1654.1 ±1.2)cGY,差异具有统计学意义(P＜0.05);相同剂量的X线照射裸鼠后,SGC7901-SVVanti组裸鼠的肿瘤缩减率明显高于SGC7901组裸鼠,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 Survivin反义核酸可以在体内、外水平增加荷胃癌细胞裸鼠对放射线的敏感性;抑制Survivin蛋白在裸鼠肿瘤中的表达.     

Serrin B和Nodosin对HL60、SGC7901、LOVO、U87、AGZY细胞株的毒性作用

目的探讨天然药物Serrin B和Nodosin对人早幼粒白血病细胞株HL60、人胃腺癌细胞株SGC7901、人结肠癌细胞株LOVO、人胶质瘤细胞株U87、人肺腺癌细胞株AGZY的毒性作用。方法将对数期生长的HL60、SGC7901、LOVO、U87、AGZY细胞株接种于96孔板中,细胞贴壁后,分别加入Serrin B或Nodosin,使药物的终浓度分别为0.00、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00μmol.L-1,24 h后用四甲基偶氮唑盐法检测细胞株的死亡率。结果 Serrin B对HL60、SGC7901、LOVO、U87和AGZY细胞株均有较强的毒性作用(P<0.01),且其毒性作用呈现剂量-效应关系。Nodosin对HL60、SGC7901、LOVO、U87细胞株具有较强的毒性作用(P<0.05,P<0.01),而对AGZY细胞株无明显毒性作用。结论 Serrin B和Nodosin是中药溪黄草抗癌作用的有效成分,为人类多种肿瘤治疗的新药研究开发提供新的思路。     

罗格列酮逆转人胃癌祼鼠移植瘤对丝裂霉素耐药的作用

目的观察PPARγ激动剂罗格列酮（ROS）能否逆转人胃癌SGC7901/VCR细胞裸鼠移植瘤对丝裂霉素（MMC）的耐药作用。方法建立人胃癌SGC7901/VCR细胞裸鼠移植瘤模型,将48只裸鼠随机分为6组：空白对照组（生理盐水0.2 mL灌胃）、MMC组（MMC 2.5 mg/kg腹腔注射）、ROS组（ROS100 mg/kg灌胃）、MMC＋ROS中剂量组（MMC2.5 mg/kg腹腔注射＋ROS 50 mg/kg灌胃）、MMC＋ROS高剂量组（MMC 2.5 mg/kg腹腔注射＋ROS 100 mg/kg灌胃）、MMC＋CSA组（MMC2.5 mg/kg腹腔注射＋CSA 50 mg/kg灌胃）。每组8只裸鼠;用药40天后,观察各组裸鼠体重和移植瘤体积变化,计算抑瘤率,绘制移植瘤的生长曲线;HE染色观察移植瘤的组织形态。结果处死前各组裸鼠体重差异无统计学意义（P〉0.05）;空白对照组、MMC组移植瘤瘤体积和抑瘤率差异无显著性（P〉0.05）,ROS组、MMC＋ROS中剂量组、MMC＋ROS高剂量组、MMC＋CSA组与空白对照组、MMC组比较移植瘤瘤体积和抑瘤率差异均有显著性（P〈0.05）。结论罗格列酮可抑制人胃癌SGC7901/VCR细胞祼鼠移植瘤瘤体生长,罗格列酮可部分逆转人胃癌SGC7901/VCR细胞祼鼠移植瘤对丝裂霉素的耐药性。     

SGC7901-DC融合细胞疫苗表型变化特点的研究

目的利用细胞融合技术,获取SGC7901胃癌细胞-DC融合细胞疫苗,并对融合细胞表型变化进行检测,了解其变化特点,为基于树突状细胞的融合疫苗研究及应用提供实验依据.方法利用聚乙二醇(PEG)诱导SGC7901胃癌细胞、树突状细胞融合,利用HAT、HT筛选培养系统对融合细胞进行筛选培养,获取纯净融合疫苗;应用直标荧光单克隆抗体进行染色,流式细胞仪检测细胞表型变化特点.结果SGC7901胃癌细胞-DC融合后,融合细胞具备独特的形态学特点,其细胞表面分子表达较亲代DC显著升高.结论SGC7901胃癌细胞-DC融合细胞疫苗具备独特形态学特点,其细胞表面分子表达较亲代DC显著升高,成为其具备更强生物学效应的细胞学基础.     

白花蛇舌草提取物体外对人胃癌细胞SGC-7901增殖抑制作用的实验研究

目的探讨白花蛇舌草提取物体外对人胃癌细胞SGC-7901增殖的抑制作用。方法通过体外无菌传代培养人胃癌细胞SGC-7901,将白花蛇舌草提取物以0．05mg/mL、0．1mg／mL、0．15mg／mL、0．2mg／mL四个不同浓度作用于该细胞,24h后采用MTF法检测细胞活性及数量。结果药物组0．05mg／mL和0．1mg／mL浓度孔的吸光值与对照组相比无显著性差异（P〉0．05）,而0．15mg／mL和0．2mg／mL浓度孔的吸光值明显小于对照组（P〈0．05）。结论白花蛇舌草提取物体外对人胃癌细胞SGC-7901增殖有一定的抑制作用,且抑制作用的强弱可能跟药物浓度有关,值得进一步研究。     

胃癌细胞SGC7901/ADR耐药相关蛋白质分子的差异展示

[目的]应用蛋白质组学技术寻找新的胃癌多药耐药相关蛋白分子,探讨胃癌多药耐药机制。[方法]以胃癌细胞SGC7901和阿霉素诱导的耐药胃癌细胞SGC7901/ADR为研究对象,用固相pH梯度等点聚焦二维聚丙烯酰胺电泳技术展示两种细胞表达的全蛋白,凝胶考马斯亮蓝染色,Image Master 2D Melanie5.0凝胶分析软件分析并比较差异表达的蛋白分子。[结果]SGC7901中检测到414个蛋白点,SGC7901/ADR检测到553个蛋白点,两者匹配点386个,差异点71个,其中SGC7901/ADR蛋白质表达明显上调蛋白26个点,明显下调蛋白点45个。[结论]SGC7901/ADR细胞中差异蛋白分子可能与胃癌阿霉素耐药机制有关。