人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在重组痘苗病毒中的 …

目的 观察人ＧＭ－ＣＳＦ（粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子）对重组痘苗病毒免疫效果的影响。方法 大鼠体内观察。结果 从核酸和蛋白水平均证实重组痘苗病毒ＲＶＪＳＢ１１７５Ｄ／ＧＭ－ＣＳＦ可同时表达ＧＭ－ＣＳＦ及ＨＳＶ－１ｇＤ（单纯疱疹病毒ｇＤ糖蛋白），但ＲＶＪＳＢ１１７５Ｄ／ＧＭ－ＣＳＦ免疫大鼠产生的抗－ＨＳＶ１ｇＤ特异性抗体水平与ＲＶＪＳＢ１１７５Ｄ组相比无显著性差异。结论 人ＧＭ－ＣＳＦ在大鼠体内对     

粒—巨噬细胞和粒细胞集落刺激因子作用的研究进展

粒－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）和粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）不仅具有刺激造血于细胞的作用，且可影响定向造血祖细胞的增殖和向成熟阶段分化，成熟细胞的功能激活和细胞的生存等功能。本文就ＧＭ－ＣＳＦ及Ｇ－ＣＳＦ的研究进展作一简要综述．     

急性白血病患儿脑脊液PCR扩增HCMV－DNA的研究

应用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）扩增和洋地黄探针杂交的方法，对５３例急性白血病（ＡＬ）患儿脑脊液（ＣＳＦ）样本进行了检测。经过ＰＣＲ扩增，可见明显的人巨细胞病毒ＤＮＡ（ＨＣＭＶ－ＤＮＡ）４００ｂｐ扩增带；经洋地黄探针特异性杂交鉴定，ＡＬ患儿ＣＳＦ标本ＰＣＲ扩增产物的ＨＣＭＶ－ＤＮＡ阳性检出率为８３．０２％。本实验为ＡＬ病人ＣＳＦ的ＨＣＭＶ检测提供了一个简便方法。     

人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子在大肠杆菌中的融合表达及纯化

人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子在大肠杆菌中的融合表达及纯化南京大学生物化学系，国家医药生物技术重点实验室２１０００８李节，华子春，邱平，朱德煦人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）是由１２７个氨基酸组成的糖蛋白，为粒细胞、巨噬细胞发育、分化、...     

急性白血病患儿脑脊液PCR扩增HCMV—DNA的研究

应用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）扩增和洋地黄深针杂交的方法，对５３例急性白血病（ＡＬ）患儿脑脊液（ＣＳＦ）样本进行了检测，经过ＰＣＲ扩增，可见明显的人巨细胞病毒ＤＮＡ（ＨＣＭＶ－ＤＮＡ）４００ｂｐ扩增带，经洋地黄探针特异性杂交鉴定，ＡＬ患儿ＣＳＦ标本ＰＣＲ扩增产生的ＨＣＭＶ－ＤＮＡ阳性检出率为８３．０２％。本实验为ＡＬ病人ＣＳＦ的ＨＣＭＶ检测提供了一个简便方法。     

逆转录病毒表达载体N2A／hGM—CSF的构建及其在COS…

用特异性核酸内切酶Ｂａｍ Ｈｉ剪切质粒ｐＣＤ／ｈＧＭ－ＣＳＦ，制备人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因片段，低融点胶回收后，连接至Ｎ２Ａ载体Ｂｇ１Ⅱ位点，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，经快提质粒进行酶切鉴定和核酸打点杂交筛选出重组质粒Ｎ２Ａ／ｈＧＭ－ＣＳＦ。利用ＤＥＡＥ－葡聚糖介导该重组质粒转化ＣＯＳ－７细胞，收集４８ｈ培养上清液，免疫学和生物学活性检测表明该上清中表达产物具有天然ＧＭ－ＣＳＦ的活性，而用质粒     

人G—CSF新型高效表达克隆的构建与鉴定

利用ＲＴ－ＰＣＲ技术，自人的脾脏单核细胞ｍＲＮＡ扩增出人粒细胞集落刺激因子（ｈＧ－ＣＳＦ）结构基因，ＤＮＡ序列分析表明与天然ｈＧ－ＣＳＦ一致，将其克隆于表达载体ｐＪＧＷ１中，在大肠杆菌中进行诱导表达研究。结果表明：ｈＧ－ＣＳＦ重组蛋白表达率在２５％以上，并具有与天然ｈＧ－ＣＳＦ一致的生物学活性。     

逆转录病毒表达载体N2A／hGM－CSF的构建及其在COS－7细胞的初步表达

用特异性核酸内切酶ＢａｍＨＩ剪切质粒ｐＣＤ／ｈＧＭ－ＣＳＦ，制备人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因片段，低融点胶回收后，连接至Ｎ２Ａ载体ＢｇｌⅡ位点，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，经快提质粒进行酶切鉴定和核酸打点杂交筛选出重组质粒Ｎ２Ａ／ｈＧＭ－ＣＳＦ。利用ＤＥＡＥ－葡聚糖介导该重组质粒转化ＣＯＳ－７细胞，收集４８ｈ培养上清液，免疫学和生物学活性检测表明该上清中表达产物具有天然ＧＭ－ＣＳＦ的活性，而用质粒Ｎ２Ａ转化ＣＯＳ－７细胞，培养上清中未检测出ＧＭ－ＣＳＦ活性。     

再障患者血清GM—CSF水平及体外骨髓造血祖细胞对GM—CSF的反应

目的：了解再生障碍性贫血（再障）患者血清粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎ，ｆａｃｔｏｒ，ＧＭ－ＣＳＦ）水平及粒－巨噬细胞系造血祖细胞（ｃｏｌｏｎｙ－ｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔｓ ｏｆ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ，ＣＦＵ－ＧＭ）对ＧＭ－ＣＳＦ的增殖反应特性。方法：用＾１２５Ｉ放射免疫分析法测定１５例再障碍患者     

CD自杀基因联合GM—CSF基因治疗的抗肿瘤作用及免 …

目的 研究自杀基因与粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因联合治疗抗肿瘤作用及免疫机理。方法 小鼠皮下接种黑色素瘤Ｂ１６Ｆ１０细胞３天后,分别在肿瘤局部直接注射表达小鼠ＧＭ－ＣＳＦ的重组腺病毒ＡｄＧＭ－ＣＳＦ和表达大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）基因的腺病毒Ａｄ－ＣＤ,然后连续１０天腹腔注射５氟胞嘧啶（５ＦＣ）Ａ（ＡｄＣＤ／５ＦＣ／ＡｄＧＭＣＳＦ组）,单用ＡｄＣＤ／５ＦＣ组,单用ＡｄＧＭ－Ｃ     

HBV preS2S-rhGM-CSF融合基因表达质粒的构建和表达

目的：研究GM-CSF和preS2对乙肝DNA疫苗的免疫增强作用。方法：采用PCR方法，扩增HBV preS2 S基因约846 bp的片段和rhGM-CSF(包括甘氨酸接头)基因450bp的片段。通过T-A克隆技术和基因定向克隆，构建融合基因的真核表达质粒pcDNA3．1-S2S-rhGM-CSF，并在HepG2细胞中表达。结果：经酶切、PCR及DNA测序鉴定，融合基因表达质粒HBV preS2S-rhGM-CSF成功地构建。将其转染HepG2细胞后，目的基因的转录通过RT-PCR得到证实，而且表达的融合蛋白能与抗-HBs、抗-preS2和抗-GM-CSF单克隆抗体(mAb)均产生特异性反应。结论：融合基因表达载体pcDNA3．1-S2S-rhGM-CSF的成功构建并表达，为进一步研究乙肝DNA疫苗奠定了实验基础。     

小鼠GM-CSF基因真核表达载体的构建及其表达活性的鉴定

目的：构建小鼠GM－GSF基因的高效真核表达载体，筛选导入该载体后高水平表达GM－CSF的小鼠淋巴瘤细胞系RMA，并探讨转GM－CSF基因瘤苗治疗小鼠T淋巴细胞瘤的方法。方法：PCR扩增小鼠GM－CSF cDNA3‘端770bp的片段，将其插入真核表达载体pcDNA3；用电穿孔法将构建的载体导入小鼠淋巴瘤细胞系RNA，有限稀释法制备单个细胞克隆，经RT－PCR、骨髓祖细胞增殖实验和集落形成实验筛选相对高表达GM－CSF的RNA克隆，该克隆细胞经丝裂霉素灭活后免疫小鼠以诱导其产生抵抗RMA肿瘤细胞再攻击的能力。结果：构建的重组质粒含有预期片段，插入方向正确，核酸序列无误，且获得了高表达GM－CSF的RMA克隆，将其用丝裂霉素灭活免疫小鼠后使它们产生了抗肿瘤免疫保护力。结论：转GM－CSF基因瘤苗可能作为有效的抗T淋巴细胞瘤瘤苗。     

突变型人PRKAG2基因的克隆及其表达载体构建

目的构建含有定点突变的人PRKAG2基因表达载体。方法首先应用Trizol法抽提健康人全血mRNA,通过实时聚合酶链反应(RT-PCR)克隆得到野生型人PRKAG2 cDNA;继而通过聚合酶链反应(PCR)定点突变的方法获得突变型人PRKAG2基因,命名为G100S,最后应用酶切连接的方法得到重组载体pEGFP-G100S。结果Trizol法提取人细胞mRNA,经RT-PCR合成cDNA第一条链,特异性引物PCR扩增得到PRKAG2基因片段,目的片段条带在1 761 bp左右。分段克隆得到的G100S片段分别为300 bp与1 500 bp左右。转化Top10感受态细菌,PCR筛选阳性菌落5个克隆有3个克隆可见1 800 bp左右的阳性片段,筛选得到pEGFP-G100S重组阳性克隆。测序证实重组载体pEGFP-G100S构建成功。结论构建的含定点突变人PRKAG2基因重组载体pEGFP-G100S为进一步研究基因PRKAG2 G100S突变的功能奠定了基础。     

晕动病易感性SNP对肾上腺素α2A受体基因表达调控的影响

目的:研究人肾上腺素α_2A受体基因-12 96位G/C多态性对DNA与蛋白质结合的影响。方法:以重组质粒为模板,扩增-12 96位为G或C的 390bp片段 (-1414--102 5)bp,分别与细胞核蛋白质结合,经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,与地高辛 (Dig)标记的同源DNA片段杂交。另将Dig-dUTP标记的同一片段与经SDS-PAGE转印至膜上的细胞核蛋白质进行DNA-蛋白质结合反应,以抗Dig抗体检测结合反应信号。结果:EMSA结果显示,-12 96位为C的片段可与细胞核蛋白质结合,X光片上显示一条特异性结合带;为G时则无;人肾上腺素α_2A受体基因 (-1414--102 5)bp 390bpDNA片段与细胞核提取物杂交结果显示,在约15kU位置可见一蛋白质条带。结论:肾上腺素α_2A受体基因-1414--102 5bp之间可能存在一转录因子结合位点,-12 96位为C时,能与一特异性核蛋白结合,此蛋白质的相对分子量约为15kU。     

聚合酶链式反应快速检测E型肉毒神经毒素基因

目的Ｅ型肉毒中毒是人类肉毒中毒的主要型别之一，本试验旨在建立用于Ｅ型肉毒梭菌鉴定的ＰＣＲ方法。方法用人工合成的寡核苷酸引物扩增Ｅ型肉毒神经毒素基因的一段３６８ｂｐ的ＤＮＡ片段，快速检测Ｅ型肉毒神经毒素基因，对梭状芽胞杆菌属的４０株保藏菌株及３３份土壤标本进行了鉴定，用Ｅ型肉毒梭菌ＣＭＣＣ（Ｂ）６４５０１对其灵敏度进行了检查。结果从所有Ｅ型神经毒素原性菌株或标本均能扩增出目的片段，且能用特定的限制性内切酶切成相应的片段。其它菌株均未能扩增出目的片段。灵敏度试验可从３０个菌体扩增出目的片段。结论此方法用于Ｅ型神经毒素原性梭菌的鉴定具有较高的灵敏度及特异性。     

THANK基因的克隆和序列分析

目的 克隆ＴＨＡＮＫ基因全长及胞外区片段并测序。方法 采用ＰＴ－ＰＣＲ技术,唑人白血病细胞系ＨＬ－６０细胞总ＰＡＮ中扩增人ＴＨＡＮＫ ｃＤＮＡ,并定向克隆于ｐＭＤ－１８Ｔ载体,转染大肠杆菌、抽提质粒后,用ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ＾ＴＭ３７７ＸＬＤＮＡ 自动测义测序。结果ＲＴ－ＰＣＲ扩增出一个８５８ｂｐ的ＤＮＡ片段,限制性内切酶图谱分析和测序结果显示：该８５８ｂｐ片段为编码入ＴＨＡＮＫ的ｃＤＮＡ,与公布     

恶性疟原虫FCC—1／HN株环子孢子蛋白基因分枝杆菌——大肠杆穿梭表达重组质粒的构建及序列测定

本文对恶性疟原虫环子孢子蛋白(circumsporozoiteprotein,CSP)基因片段进行克隆和序列测定。根据恶性疟原虫837株基因编码序列设计合成一对引物,采用PCR技术从恶性疟原虫FCC-1/HN株基因组DNA中特异扩增CSP基因片段的Ⅰ区、中央重复区、重复区后可变区和Ⅱ区;经纯化的扩增产物用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切后,定向克隆入大肠杆菌——分枝杆菌穿梭表达质粒,转化感受态大肠杆菌DH5α,重组克隆经抗性筛选和快速凝胶电泳鉴定,再经PCR和酶切鉴定,并对重组子进行序列测定。结果表明从恶性疟原虫FCC-1／HN株基因组DNA中可特异扩增出约1171bp的基因片段,阳性重组质粒经双酶切和PCR鉴定与预期的结果一致,序列测定表明所克隆的基因和编码环子孢子抗原的基因片段相符。     

我国登革病毒分离株NS1基因的扩增

本研究利用逆转录（ＲＴ－ＰＣＲ）技术将由聚乙二醇浓缩的登革病毒制备的ＲＮＡ合成为双股ｃＤＮＡ，建立了扩增登革病毒大片段ｃＤＮＡ的条件。采用该方法扩增了我国登革２型病毒株的ｃＤＮＡ片段，长度为１３８３ｂｐ。它不但包括完整ＮＳ１基因，而且也包括了对ＮＳ１编码蛋白的功能起重要作用的位于其上游和下游的部分碱基序列。登革病毒大片段ｃＤＮＡ的扩增有助于对我国毒株ＮＳ１基因的克隆与表达的研究。     

rpoB作为蜡样芽胞杆菌群快速检测的标志基因的实验研究

目的探讨常规PCR和实时荧光定量PCR（Q-PCR）方法检测蜡样芽胞杆菌群rpoB基因的特异性和敏感性。方法提取蜡样芽胞杆菌群和其他各种对照细菌的基因组DNA,合成蜡样芽胞杆菌群rpoB基因扩增引物,采用常规PCR和SYBRgreen实时定量PCR两种方法扩增rpoB基因片段,并将PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行DNA测序。结果常规PCR和Q-PCR均能扩增出蜡样芽胞杆菌群rpoB基因的174bpDNA片段,而各种对照菌株均未见扩增。序列比对发现蜡样芽胞杆菌群细菌在该片段中存在5处核苷酸的不同,差异率为2.88%。以炭疽芽胞杆菌基因组DNA系列稀释作为扩增模板显示常规PCR最小检出量为3.42pg,Q-PCR的敏感性达到171fg,3次重复实验显示Q-PCR检测rpoB基因的灵敏度为（3.32×101±7.45×100）拷贝。结论以rpoB基因为检测靶基因的Q-PCR方法具有高度的特异性和良好的敏感性,能实现对蜡样芽胞杆菌群快速而准确的检测。     

FSHR部分基因的真核表达质粒构建和生物信息学分析

目的克隆FSHR基因部分片段（145～330bp）（FSHRn）,构建真核表达重组质粒,预测其编码蛋白作为候选避孕疫苗的可行性。方法提取小鼠睾丸组织的总RNA,利用RT—PCR技术反转录成cDNA,按照GenBank中小鼠FSHR N-端序列设计引物,扩增基因片段并插入pcDNA3．1／myc-His（-）B载体,重组质粒经PCR、双酶切和测序鉴定后用Vector NTI9．0软件作生物信息学分析。结果扩增片段长度为186bp,测序结果与已知序列吻合,重组真核表达质粒经PCR和双酶切鉴定获得正确重组子,生物信息学分析其编码蛋白抗原性肽段主要集中在15～20aa、22～27aa、32～36aa、42～48aa、58～67aa,与人的基因同源性为90％。结论成功克隆了FSHRn基因片段并构建了pcDNA3．1／FHSRn真核表达重组质粒;FSHRn具有良好的抗原性．FSHRn蛋白可作为良好的动物候选疫苗,为此段蛋白的深入研究和人类男性避孕疫苗的研制打下基础。