PCR—SSP检测人胰腺癌细胞株PC—2 K—ras基因点突变及其方式

目的 检测人胰腺癌细胞株PC－2 K－ras基因点突变及其突变方式，明确基因治疗靶点的碱基序列。方法 针对K－ras基因第12位密码子点突变方式（CGT，CAT，GTT）设计顺序特异性引物（SSP），对人胰腺癌细胞株PC－2进行聚合酶链反应（PCR），扩增产物借助聚丙烯酰胺凝胶电泳判定该细胞株有无K－ras基因点突变及其突变方式。结果 人胰腺癌细胞株PC－2存在K－ras基因点突变，突变方式为CGT。结论 PCR－SSP法简便快速，特异性高，本研究结果为胰腺癌的下一步基因治疗奠定了基础。     

非小细胞肺癌细胞中c—k—ras基因点突变的研究

作者采用聚合酶链反应和限制性片段长度多态分析方法，研究非小细胞肺癌组织中ｃ－ｋ－ｒａｓ基因第１２位密码子点突变情况。．结果发现：２９例被检测标相中５例有点突变，其发生频率为７１．２４％；相同病理分期，点突变阴性患者的临床生存期明显长于点突变阳性者。     

宣威昆明两地肺癌ras基因表达及突变的比较研究

目的 :比较ras基因在宣威、昆明两地肺癌中遗传变异的差异性 .方法 :采用免疫组化染色和PCR -SSCP -DNA直接测序技术 ,对 4 5例宣威地区肺癌和 4 5例昆明地区肺癌石蜡包埋组织标本中ras蛋白的表达及k -ras基因 12密码子突变进行检测 .结果 :5 5例 (5 5 / 90 )ras蛋白表达阳性 ,其中宣威肺癌组 31例 ,昆明肺癌组 2 4例 ,2 8例 (2 8/ 90 )检测到k -ras基因 12密码子突变 .对ras基因在两组肺癌中的表达及突变进行比较分析表明 :ras蛋白表达及k -ras基因 12密码子突变在宣威肺癌组中高于昆明肺癌组 ,但差异无统计学意义 (P >0 0 5 ) ,ras蛋白在Ⅰ期肺癌病例以及腺癌病例中的表达 ,宣威肺癌组均高于昆明肺癌组 ,差异有统计学意义 (P =0 0 4 5 ,χ2 =4 5 72 ,P =0 0 32 ) .结论 :ras基因的激活是肺癌发生过程中常见的分子生物学事件 ;宣威地区肺癌与昆明地区肺癌相比 ,ras蛋白在Ⅰ期病例以及腺癌病例中的表达存在着差异 .k -ras基因 12密码子在宣威地区肺癌中的突变与昆明地区肺癌相比无明显特异性     

应用寡核苷酸芯片检测白血病患者P53和K-ras基因点突变

目的 研究白血病病例中P53、K—ras基因点突变情况。方法 采用寡核苷酸芯片技术对临床收集的白血病标本进行P53、K—ras突变热点检测。结果 共检测出P53突变8例、K—RAS突变4例。其中P53突变包括ANLL—M3 2例，M2 3例，ANLL—M5、ALL、CML各1例。K—ras突变包括CML3例，ALL1例。结论 P53、K—ras突变在白血病发生、发展中起到一定作用。应用寡核苷酸芯片进行P53、K—ras点突变检测，优缺点并存，具有一定临床实用价值。     

人肺癌组织中C-Ha-ras,C-myc和C-sis基因扩增的研究

用同位素α－P32dCTP标记癌基因C－Ha－ras，c－myc和V－sis基因片段，通过点杂交和Southern杂交法检测17例鳞癌、9例腺癌、3例其它类型肺癌组织和9例非肺癌组织中C－Ha－ras，C－myc和C－sis基因扩增的情况。结果发现：在所检测的29例肺癌样品中，10例（58．8％）鳞癌，3例腺癌（33．3％）和2例其它类型癌有C－Ha－ras基因扩增，4例（23．5％）鳞癌，3例（33．3％）腺癌出现C－myc基因扩增，4例（23．5％）鳞癌，1例（11．1％）腺癌和1例其它类型癌有C－sis基因扩增。同时我们也发现有5例肺癌组织（4例鳞癌和11例腺癌）出现两种癌基因的扩增。上述结果提示：C－Ha－ras，C－myc和C－sis基因的扩增与肺癌的发生有密切关系，特别是C－Ha－ras基因扩增在肺鳞癌的形成过程中可能起着重要作用。同时也提示：肺癌的发生与两件癌基因的扩增可能有一定关系。     

53例胃癌前病变粘膜组织K—ras基因突变情况分析

目的：探讨胃癌前病变组织K－ras基因突变情况,揭示K－ras基因突变与胃癌发生的关系。方法：应用聚合酶链反应（PCR）与单链构多态性分析（SSCP）对53例经病理切片诊断为胃癌前病变粘膜组织和10例正常胃粘膜组织进行K－ras基因突变分析。结果：53例胃癌前病变粘膜组织中,K－ras基因发生突变40例,占75．5％;男女间突变率比较差异无显著性（P＞0．05）;而10例正常胃粘膜组织无K－ras基因突变发生。结论：K－ras基因突变是胃癌前病变中常见的分子事件,用PCR－SSCP法检测胃粘膜组织K－ras基因的突变情况将有助于了解胃癌发生的生物学行为,对早期诊断有一定的帮助。     

肺癌原癌基因c－Ha－ras点突变的研究

应用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交技术，在１１例肺癌标本中观察到８例发生了ｃ－Ｈａ－ｒａｓ基因第１２位密码子点突变，突变率为７７．８％。上述肺癌病例中８例取到癌旁组织，发现１例发生了该位点突变，２例兼有突变与未突变杂交带。结合临床、病理资料分析结果提示：ｃ－Ｈａ－ｒａｓ基因第１２位密码子，或突变至少在一部分肺癌病例中并非细胞恶变过程中的起始事件，但可能为早期事件；该位点突变在不同病理类型中未见显著性差异，与ＴＮＭ分期、吸烟史非密切相关。     

肺癌原癌基因c—Ha—ras点突变的研究

应用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交技术，在１１例肺癌标本中观察到８例发生了ｃ－Ｈａ－ｒａｓ基因第１２位密码子点突变，突变率为７７．８％。上肺癌病例中８例取到癌旁组织，发现１例发生了该点突变，２例兼有突变与未突变杂交带。结合临床、病理资料分析结果提示：ｃ－Ｈａ－ｒａｓ基因第１２位密码子占突变至少三部分肺癌病例中并非细胞恶变过程中的起始事件，但可能为早期事件，该闰突变在不同病理类型中未见显著性差异，与ＴＮＭ     

p53和ras基因突变及HPV感染与喉鳞癌的关系

①目的　探讨人乳头瘤病毒 16 ,18型 (HPV16 ,18)感染 ,抑癌基因p5 3和癌基因ras突变与喉鳞癌的关系 ,并初步分析 3种致癌因素的相互关系。②方法　应用聚合酶链反应 (PCR)和限制性片段长度多态性 (RFLP)分析技术 ,检测 40例喉鳞状细胞癌组织中 p5 3基因第 5 ,7外显子及ras基因 (N ras ,K ras,H ras)第 12密码子的突变情况 ,同时用PCR技术检测 40例标本中HPV16 ,18的感染情况。③结果　 40例标本检出HPV16阳性标本 14例 ,HPV18阳性标本 4例。 4例标本 p5 3基因第 5外显子第 143密码子发生突变 ,其中 1例HPV16阳性 ,p5 3基因第 7外显子未发现突变。 9例标本ras基因发生突变 (N ras 6例 ,K ras 2例 ,H ras 1例 ) ,其中 2例HPV16阳性 ,但未见 p5 3与ras基因同时发生突变者。HPV阳性和阴性标本中p5 3基因突变率、ras基因突变率的差异均无显著性(χ2 =0 .10 1,1.392 ,P >0 .0 5 )。④结论　HPV感染、p5 3和ras基因突变与喉鳞癌的发生密切相关 ,三者之间的关系尚待进一步探讨。     

ras和c-erbB癌基因在特发性肺间质纤维化中的表达

采用原位分子杂交技术和免疫组织化学方法，对8例临床与肺组织学确诊的特发性肺间质纤维化（IPF）病人的肺活检组织及7例正常肺组织进行了ras和c－erbB癌基因及其产物的检测。结果：ras癌基因产物P21在6／8例IPF肺组织中呈阳性反应；5／8例IPF肺组织c－erbB－2显免疫阳性反应，而在7例正常肺组织P21及c－erbB－2均无明显表达，原位杂交结果显示IPF肺组织没有明显ras和c－erbB癌基因的DNA扩增提示IPF的病变过程与ras和c－erbB－2癌蛋白表达增强有关。     

携带k-ras和c—Myc基因逆转录病毒载体的构建及其转导正常卵巢细胞效能的研究

目的：构建携带k—ras和c—Myc基因的逆转录病毒载体，研究其转导正常小鼠卵巢上皮细胞（mouse ovarian surface epithelial cell，MOSE）的效能。方法：用基因克隆的方法将k—ras和c—Myc基因插入到载体pI，PCX和pI，HCX中，构建真核表达质粒pLPC—mMyc和pI。HC—kras。将pLPC—mMyc或pLHC—kRas通过脂质体法转导包装细胞Ecotropic Pheonix细胞，提取含有携带目的基因的重组病毒上清，转染MOSE，获取携带c—Myc和k—ras基因的MOSE细胞株，分别命名为MOSE—Myc细胞和MOSE—Ras细胞，同时拮抗Puromycin和Hygromycin的MOSE细胞株，命名MOSE—RM细胞。用RT-PCR和Western blot检测目的癌基因和蛋白质在MOSE细胞的表达。将MOSE、MOSE-Myc、MOSE-Ras、MOSE—RM被分别注射到CDl裸鼠腹腔，60d后处死所有裸鼠，解剖检查，观察成瘤情况和生存时间，并进行免疫组织化学染色。结果：RT—PCR能检测到目的基因c—Myc（943bp）和k—ras（620bp）mRNA特异的条带，Western blot在转基因细胞株中能检测到cMyc（67ku）和k-ras（21ku）基因蛋白质的表达。MOSERM和MOSE—Ras组在裸鼠体内均能形成肿瘤，而MOSE和MOSE—Myc在实验结束时均未能形成肿瘤。免疫组织化学染色显示MOSERas和MOSE—RM组k—ras蛋白均呈强阳性，定位于细胞膜；MOSE—RM组c—Mye蛋白呈强阳性，位于细胞核。结论：真核表达质粒plPC—mMyc和plHC—kras能够通过逆转录病毒将k—ras和c—Myc高效导人正常小鼠卵巢上皮细胞MOSE，表达目的蛋白。     

PCR-SSP法和基因测序检测人胰腺癌细胞株Patu 8988 K-ras基因第12位密码子点突变及其方式

目的检测人胰腺癌细胞株Patu 8988 K-ras基因点突变及其突变方式，明确基因治疗靶点的碱基序列。方法针对K—ras基因第12位密码子点突变方式（CGT、GTT、GAT）设计顺序特异性引物（SSP），对人胰腺癌细胞株Patu 8988进行聚合酶链反应（PCR），扩增产物经12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后判断该细胞株有无K-ras基因点突变及其突变方式。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增人胰腺癌细胞株Patu 8988 K—ras基因，扩增产物直接进行基因序列测定。结果PCR—SSP法检测人胰腺癌细胞株Patu 8988存在K—ras基因点突变，突变方式为GGT→GTT，其结果与基因序列测定完全相符。结论明确了人胰腺癌细胞株Patu 8988 K-ras基因第12位密码子点突变方式（GGP→GTT），为胰腺癌的下一步基因治疗研究打下了坚实的基础；PCR—SSP方法检测K-ras基因点突变简便、快速、经济且特异性高，有望在临床上成为早期诊断和鉴别诊断胰腺癌的实用检测方法。     

痰标本检测P53和K—ras基因突变在非小细胞肺癌早期诊断中的价值

目的：研究P53和K-ras基因在非小细胞肺癌（NSCLC）患痰中突变率及其在NSCLC早期诊断中的意义。方法：研究组为经病理证实的非小细胞肺癌患45例，对照组为明确诊断的慢支、 肺 结核等良性病变患15例。两组患均留取痰标本，痰处理后行PCR扩增，扩增物变性后聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳，溴化锭中染色，紫外灯下观察。统计突变与未突变例数,x^2检验，分析结果。结果；研究组和对照组的 P53基因突变率分别为48．8％和20％（P＜0．05），K-ras基因突变率分别为55．6％和26．7％（P＜0．05），P53和K－ras基因同时突变率分别为5％和0（P＜0．05）。结论：研究组P53和K－ras 基因突变率明显高于对照组，研究组P53和K－ras基因同时突变率显高于对照组。P53和K-ras基因突变可以作为NSCLC的早期诊断指标，两联合检测意义更大。     

肺癌K-ras基因第12位密码子点突变的研究

应用PCR技术及限制性片段长度多态性分析方法研究了30例非肿瘤支气管肺病,22例癌旁正常肺组织和60例原发性支气管肺癌组织中K—ras基因第12位密码子点突变。结果显示,K—ras基因点突变只发生在非小细胞肺癌中,与患者性别、年龄、肿瘤分化程度及非小细胞肺癌分型无关。     

胃癌与幽门螺杆菌感染及p53、ras 基因突变的关系

目的 探讨幽门螺杆菌(Hp) 感染和p53、ras 基因突变在胃癌发生中的作用.方法 采用聚合酶链反应- 单链构象多态性分析法(PCR-SSCP) 进行p53( 外显子7) 及ras( 第12 密码子) 进行基因突变分析,并应用快速尿素酶试验(RUT) 法和HE 染色法检测Hp 感染.结果 83 例胃癌组织中,p53 基因与ras 基因发生突变阳性率分别为67.47%、63.86%,男女无差异,有远处转移中二者阳性率更高,而对照组中均无p53 与ras 突变发生.胃癌组织中Hp 感染率为71.08%,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01),且Hp 阳性感染组织中p53 和ras 的突变率明显高于Hp 阴性组织,差异均具有统计学意义(P<0.01 ;P<0.05).结论 Hp 感染和p53、ras 基因突变可能是胃癌的发生机制之一,Hp 感染可导致多基因联合突变.用PCR-SSCP 法联合检测胃黏膜组织中p53、ras 基因的突变将有助于胃癌诊断和预测胃癌远处转移.     

胰腺癌K-ras基因12密码子突变率的研究

目的阐明中国胰腺癌患者Ｋ－ｒａｓ基因１２密码子突变频率，为临床应用打下基础。方法两轮ＰＣＲ－ＲＦＬＰ技术对３２例石蜡包埋胰腺癌标本和１５例阴性对照作基因分析。结果３２例胰腺癌标本中３０例检测到Ｋ－ｒａｓ基因１２密码子突变，阳性率为９３．８％，而１５例阴性对照无１例检测到突变。结论中国胰腺癌患者Ｋ－ｒａｓ基因１２密码子突变率高达９０％左右，该突变的有无可作为在基因水平上鉴别诊断胰腺癌的一个可靠标志。     

散发性大肠癌K—ras基因点突变研究及其临床病理意义

目的观察散性大肠癌K—ras基因12、13密码子点突变情况,探讨其与临床病理特征的关系。方法对2005～2009年问浙江省肿瘤医院确诊的140例大肠痛进行回顾性分析,并提取石蜡标本中癌组织DNA,经PCR扩增后应用焦磷酸测序技术检测K—ras基因第12、13密码子点突变情况。结果K—ras基因突变率397％（55／140）,12密码子突变率78．2％（43／55）,13密码子突变率21．8％（12／55）。共发现7种突变类型,包括12密码子（GGT→AT、GGT→AGT、GGT→TGT、GGT-→GTT、GGT→CGT、GGT→GCT）和13密码子（GGC→GAC）,以12密码子（CGT→GAT）最常见,占突变总数41．8％（23／55）。K—ras基因突变与性别、年龄、大体类型、瘤体、原发部位、病理亚型、组织学分级、浸润深度、转移、Duke’S分期、脉管侵犯均无相关性（P〉0．05）;第12与13密码子突变在原发部位、淋巴结转移上差异有统计学意义（P〈0．05）。结论散发性大肠癌中K—ras基因突变率为39．7％,12密码子（GGT→GAT）突变是最常见类型。特定位点的突变与一些临床病理参数密切相关,其中12密码子突变在结肠癌中的发生率高,并易出现淋巴结转移。通过K—ras基因检测有助于指导临床开展大肠癌个体化治疗。     

四种癌基因在急性髓细胞性白血病中转录水平的分析

用滤膜原位杂交方法，对M2、M3、M5和M6四型共18例急性髓细胞性白血病外周血和／或骨髓细胞中c－myc、c—fos、c—sis和c－N－ras4种癌基因的转录水平进行分析．结果表明：①c-myc在M2、M3、M5和M64型井13例中表达．②6例M3中，3例同时检测到c－myC和c－N－ras表达。③7例M5中，检测到3例c-fos表达。     

人胃癌移植瘤裸小鼠Ki-ras基因突变的检测

目的：检测人胃癌裸小鼠移植瘤Ki—ras基因的突变情况。方法将人胃癌细胞SGC-7901于裸小鼠脾包膜下移植，12周后处死，采用PCR-DNA测序法检测Ki—ras基因第12、13密码子的突变情况。结果：共检测29例裸鼠移植瘤，DNA经扩增后20例为阳性，其中12例进行DNA测序，未发现第12、13密码子的突变。结论：人胃癌移植瘤裸小鼠Ki—ras基因第12、13密码子有无突变尚不能肯定。     

多重PCR和DNA测序技术检测胃癌APC基因15外显子突变

目的 探讨APC基因突变在胃癌发生中的作用及微卫星DNA不稳的关系。方法 采用多重PCR、DGGE电泳和DNA测序技术检测APC15外显子突变,采用PCR为基础的方法检测微卫星DNA不稳。结果68例胃癌中检出APC基因15外显子突变15例（22．1％）,APC基因突变在肠型胃癌的检出率显著高于弥漫型胃癌（P＜0．05）,而与肿瘤大小、分化程度、浸润深度和临床病理分期无显著相关。至少有1个位点发现MSI者17例（25．0％）。将MSI分为高频率MSI（MSI－H,≥2个位点）8例、低频率MSI（MSI－L,仅为1个位点）9例和MSI阴性（MSS）51例3组,结果APC基因突变均发生于MSI－L和MSS组,而MSI－H未见有突变者。结论 APC基因可能是肠型胃癌的易感基因,APC基因突变可能参与了LOH病理途径,而与MSI途径无关。