黄芩茎叶总黄酮对Aβ25-35致大鼠学习记忆损伤及海马抗氧化酶活性的影响

目的 : 探讨黄芩茎叶总黄酮（scutellaria baicalensis stem-leaf total flavonoid, SSTF）对大鼠海马注射 Aβ_25-35 致大鼠学习记忆损伤及海马抗氧化酶活性的影响。方法：给大鼠灌胃（ig）SSTF 100,50,25 mg• kg^-1 剂量 , 采用双侧海马注射 Aβ_25-35 制作大鼠痴呆模型,Morris 水迷宫实验测定大鼠学习、记忆能力;HE 染色观察大鼠海马 CA1 区神经元形态;检测海马组织中超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）活性及丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量。结果：模型组大鼠寻找平台潜伏期较对照组大鼠明显延长（P<0.01）,2 min 内在平台象限所游路程与总路程的比值明显低于对照组（P<0.01）,SSTF 100,50 mg• kg^-1 剂量组及维生素 E 组的大鼠寻找平台潜伏期较模型组明显缩短,所游路程比值明显高于模型组;模型组大鼠海马 CA1 区神经元损伤明显,SSTF100,50 mg• kg^-1 剂量组及维生素 E 组大鼠海马神经元损伤较模型组明显减轻;SSTF 100 mg• kg^-1 剂量组海马组织中 SOD、GSH-Px 活性较模型组明显升高,MDA 含量明显减少。结论：黄芩茎叶总黄酮能减轻大鼠海马注射 Aβ_25-35 引起的海马神经元损伤,改善学习记忆能力,其机制可能与提高组织中抗氧化酶活性有关。     

雌激素受体介导的柚皮苷抗Aβ25-35损伤PC12细胞凋亡作用研究

目的 探讨雌激素受体介导的柚皮苷(NG)抗β淀粉样蛋白25-35(Aβ_25-35)诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞的凋亡作用及其与雌激素受体(ER)信号通路的关系。方法 实验分为空白组、Aβ_25-35组、E2+Aβ_25-35组、NG+Aβ_25-35组、ICI182780+E2+Aβ_25-35组、ICI182780+NG+Aβ_25-35组。实验采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率;蛋白免疫印迹法(WB)检测细胞Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达;RT-qPCR法检测细胞凋亡因子mRNA的表达。结果 Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术结果显示,与空白组相比,Aβ_25-35组细胞凋亡率升高(P<0.01);与Aβ_25-35组相比,NG+Aβ_25-35组细胞凋亡率降低(P<0.01);与NG+Aβ_25-35组相...     

蛇床子素对AD大鼠神经元凋亡及细胞周期的影响

目的：观察蛇床子素对阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)模型大鼠神经元凋亡及细胞周期的影响,探讨蛇床子素的神经保护作用及其作用机制。方法：采用一次性侧脑室注射聚集态β淀粉样肽(β-amyloid peptide,Aβ_25-35)建立AD大鼠模型,腹腔注射12.5,25.0 mg·kg^-1蛇床子素进行干预,观察大鼠认知功能、神经元凋亡及细胞周期变化。结果：蛇床子素能明显改善AD模型大鼠空间学习记忆能力,减少神经元凋亡,增加S期细胞百分率,促进G₂/M期细胞进一步分裂,增强细胞增殖活性,调节细胞周期,有利于维持神经元正常的生理功能。结论：蛇床子素可通过减少神经元凋亡、调节细胞周期,具有神经保护作用,这可能是其改善AD大鼠学习记忆障碍的作用机制之一。     

NF-κB对Aβ1-42诱导神经元KATP亚基Kir6.2/SUR1表达的影响

目的 研究神经细胞核转录因子-κB(NF-κB)对β-淀粉样蛋白(Aβ1-42)诱导原代培养皮层及海马胆碱神经元ATP敏感性钾通道(KATP)亚基Kir6.2/SUR1蛋白表达的影响,探讨NF-κB的可能作用。方法 实验分为空白对照组、Aβ1-42组、Aβ1-42+SN50组和SN50组。运用细胞原代培养的方法培养大鼠皮层及海马胆碱神经元并进行鉴定,用Western blotting法检测药物干预后的Kir6.2/SUR1蛋白及NF-κB亚基p65蛋白表达的变化。结果 加入药物处理神经细胞72h后,与空白对照组相比,Aβ1-42组的p65蛋白和Kir6.2/SUR1蛋白表达均显著升高(P均<0.05);与Aβ1-42组相比,Aβ1-42+SN50组的Kir6.2/SUR1蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论 NF-κB信号通路在Aβ1-42诱导神经元Kir6.2/SUR1蛋白的表达中起保护作用。     

鹿茸多肽联合GDNF基因修饰的雪旺细胞对Aβ25-35诱导脊髓神经元凋亡的保护作用

目的：探讨鹿茸多肽（VAP）联合胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）基因修饰的雪旺细胞（SCs）对β淀粉样蛋白25-35（Aβ_25-35）诱导的脊髓神经元凋亡的保护作用,阐明其作用机制。方法：制备胎鼠脊髓细胞,取对数生长期的脊髓神经元,采用Aβ_25-35诱导脊髓神经元凋亡,将脊髓神经元分为正常细胞组（正常脊髓神经元）、诱导凋亡组（Aβ_25-35诱导凋亡后的脊髓神经元）、SCs组（Aβ_25-35诱导凋亡后的脊髓神经元+SCs）、GDNF组（Aβ_25-35诱导凋亡后的脊髓神经元+GDNF）、SCs+GDNF组（Aβ_25-35诱导凋亡后的脊髓神经元+GDNF转染的SCs）和VAP联合组（Aβ_25-35诱导凋亡后的脊髓神经元+VAP联合GDNF转染的SCs）。流式细胞术检测各组脊髓神经元凋亡率,免疫组织化学染色检测各组脊髓神经元中caspase-3阳性细胞数。结果：胎鼠脊髓神经元悬液接种后初始脊髓神经元大多为圆形。流式细胞术检测,与诱导凋亡组比较,SCs组、GDNF组、SCs+GDNF组和VAP联合组脊髓神经元凋亡率降低（P<0.05）;与SCs+GDNF组比较,VAP联合组脊髓神经元凋亡率明显降低（P<0.05）。免疫组织化学检测,各组脊髓神经元中均有caspase-3表达,SCs组、GDNF组和SCs+GDNF组细胞着色差异不明显,脊髓神经元中caspase-3阳性细胞数差异不大,但与诱导凋亡组比较明显减少（P<0.05）。结论：VAP联合GDNF转染的SCs对脊髓神经元凋亡有保护作用,该作用通过下调脊髓神经元中caspase-3表达来实现。     

金钗石斛生物碱抗老年痴呆基础研究

研究目的：探究金钗石斛生物碱（Dendrobium nobil Lindl Alkaloids,DNLA）抗老年痴呆作用及作用机制。方法：采用右侧脑室注射脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）或Aβ25-35 制备大鼠学习记忆功能减退模型、APP/PS1 转基因阿尔茨海默病模式小鼠动物模型,以及Aβ25-35 或氧糖剥夺诱导的大鼠原代神经元损伤细胞模型,通过行为学、组织形态学、免疫荧光、PCR、Western blot等技术手段,围绕学习记忆改变、炎症、tau 蛋白磷酸化、Aβ清除、自噬等评价DNLA 的抗老年痴呆作用及作用机制。结果：在LPS 诱导的大鼠学习记忆减退模型,预防性给予DNLA（20,40,80 mg·kg-1）,大鼠逃避潜伏期和搜索距离缩短,神经元坏死凋亡显著改善,其机制可能与降低海马caspase3/8 mRNA 表达、减少Aβ1 -42 产生、减轻海马Tau 蛋白磷酸化有关,值得注意的是DNLA
（80 mg·kg-1）的作用与甾体类抗炎药布洛芬相似,提示DNLA 的改善记忆作用与抗炎作用有关,后续研究发现DNLA 可抑制p-p38 MAPK 和NF-κB 通路降低炎症因子TNF-α及其受体TNFR1 的表达。在Aβ25-35 诱导的大鼠痴呆模型,给予DNLA 后可改善大鼠空间学习成绩,明显减少海马组织Aβ1-42 的含量,降低β- 淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）和BACE1 蛋白在海马组织的表达,另外,DNLA 可预防Aβ25-35 诱导的小鼠海马神经元及其突触缺失,该效应至少与增加其海马与皮质脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子及睫状神经营养因子等有关。在APP/PS1 转基因阿尔茨海默病模式小鼠,DNLA 可通过诱导神经元自噬改善模式小鼠空间学习记忆能力。离体细胞实验发现DNLA 抑制氧糖剥夺诱导的大鼠神经元细胞活力降低,减轻细胞凋亡,降低细胞膜通透性,改Aβ25-35 诱导的神经元轴突变性,作用机制与降低［Ca2+］i、增高MMP水平、下调caspase-3/12 基因表达、诱导自噬有关。结论：DNLA 可改善LPS 或Aβ25-35 诱导的大鼠学习记忆功能减退模型、APP/PS1 转基因阿尔茨海默病模式小鼠的学习记忆功能,作用机制与抗炎、抗凋亡、诱导自噬,减少Aβ沉积和tau 蛋白磷酸化等有关。     

Aβ1-42海马注射对大鼠海马细胞的影响及黄精多糖的干预研究

目的：探讨Aβ1-42海马直接注射对大鼠海马细胞的影响及黄精多糖干预的作用。方法：将45只SD雄性大鼠
分为3组：假手术组、Aβ模型组(Aβ组)和黄精多糖干预组(PP组)。Aβ组直接注射Aβ1-42于大鼠海马组织；PP组用16%
黄精多糖溶液给予大鼠连续灌胃45 d。采用HE和甲醇刚果红染色观察Aβ及黄精多糖干预对海马组织细胞的影响。结
果：海马的形态学在大鼠的假手术组没有显著变化，在PP组大鼠基本正常，Aβ组的锥体细胞层明显减少，细胞排列
稀疏、不规则地变小，可见核固缩、空泡变性细胞。Aβ组相比于PP组，海马组织细胞出现明显Aβ沉积；Aβ组大鼠的
阳性斑块数量高于PP组大鼠。结论：Aβ海马注射可以模拟大鼠海马组织阿尔茨海默病病理改变；黄精多糖可显著改
善阿尔茨海默病大鼠海马的病理改变。     

腺病毒介导的NEP基因对Aβ25-35诱导的SK-N-SH细胞凋亡的抑制作用

目的    研究脑中性内肽酶(NEP)基因外源表达对神经毒性物质β-淀粉样肽(Aβ25-35)诱导损伤的SK-N-SH细胞凋亡的抑制作用。方法    用脂质体法将含NEP的腺病毒载体转染高代次293细胞,制备高滴度病毒载体,感染Aβ25-35处理的外源损伤的人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH细胞),采用MTT法检测细胞存活率,采用流式细胞术分析细胞凋亡状态和细胞内活性氧水平,采用RT-PCR和Western blot法检测凋亡相关基因bcl-2及bax的表达情况。结果    细胞存活率及流式细胞术检测结果显示,NEP高表达可明显减轻Aβ25-35诱导的细胞凋亡及减低细胞内活性氧水平,RT-PCR和Western blot结果显示,NEP对Aβ25-35诱导的细胞凋亡的抑制作用可能是通过减少促凋亡基因bax的表达以及降低细胞内活性氧水平来实现的。结论    NEP对Aβ25-35诱导的神经细胞损伤具有一定保护作用,其作用机制可能与凋亡相关基因有关。     

二苯乙烯苷经GSK-3β途径对干预tau蛋白磷酸化机制研究

目的：观察二苯乙烯苷(TSG)如何经GSK-3β途径干预Aβ_25-35致拟痴呆大鼠模型的tau蛋白磷酸化过程。方法：选用24月龄雄性SD大鼠36只,随机分为正常组、假手术组、模型组及TSG低、中、高剂量组(TSG分别为0.033、0.1、0.3 g/kg),每组各6只。模型组、TSG各剂量组按大鼠脑立体定位图谱选择海马区域注射Aβ_25-35溶液致痴呆模型(假手术组注射等体积生理盐水)。经Aβ_25-35海马区造模筛选后开始灌胃给药,每组每日灌胃给药1次,连续4周。各组灌胃4周相应药物后,采用HE染色观察大鼠海马和皮层区神经细胞的结构;IHC检测各组大鼠脑组织PKC、PKA蛋白的表达;实时荧光定量PCR检测GSK-3β、PKA、PI3K、PKB、PKC m RNA表达情况;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测GSK-3β、PI3K、PKB、p-tau蛋白表达情况。结果：与正常组比较,模型组大鼠神经细胞的数量较少,排列较稀疏无序;GSK-3β、PKA m RNA表达水平呈上调趋势(P<0.05);PI3K、PK...     

Research of Quercetin’s Estrogen-Like Action on Central Nervous System and Its Mechanisms

目的：大量临床和流行病学数据表明,女性更年期雌激素水平下降可能诱发阿尔茨海默病（Alzheimer's disease,AD）,雌激素有提高神经元活力和减少Aβ聚集的作用,可通过多种方式对神经元发挥保护作用。但绝经后妇女的临床试验数据显示,雌激素疗法存在不良反应,使其临床应用受限。植物雌激素（Phytoestrogen）与雌激素化学结构类似,被称为选择性雌激素受体调节剂,具有雌激素样神经保护作用,同时减轻因雌激素替代疗法产生的副作用。研究表明,槲皮素（quercetin,Que）作为植物雌激素,对大脑缺血再灌注、β-淀粉样蛋白和重金属导致的神经元损伤都具有一定的保护作用。本课题组的前期研究也证实槲皮素可以通过结合雌激素α受体表现出雌激素样作用,促进人乳腺癌MCF-7细胞系的增殖。此研究延续前期研究,继续探讨槲皮素雌激素样作用对脑神经元的保护作用及其作用机制。方法：利用原代培养的大鼠海马神经元细胞、皮层神经元细胞,以及老化的Aβ25-35处理的PC12细胞,分别观察使用不同浓度的槲皮素进行药物干预24小时的作用。通过MTT实验检测槲皮素对神经元、PC12细胞活性的影响;通过免疫荧光染色比较槲皮素对海马、皮层神经元突触形态的影响;通过蛋白免疫印迹法检测PC12细胞模型中相关受体和蛋白的表达变化。并通过使用雌激素受体拮抗剂ICI182,780、雌激素受体α拮抗剂MPP和雌激素受体β拮抗剂PHTPP,深入探讨槲皮素发挥雌激素样神经保护作用的机制。结果：MTT实验结果显示,槲皮素可以提高大鼠海马神经元的活性（P<0.05）,且槲皮素对海马神经元的保护作用呈剂量依赖性增加。在低密度海马神经元中25μmol•L-1槲皮素对海马神经元有保护作用（P<0.05）。当雌激素受体拮抗后,50μmol•L-1槲皮素仍能提高海马神经元细胞的活性（P<0.05）,延长作用时间后三组不同浓度的槲皮素都可以提高海马神经元的活性。在PC12细胞的研究中,随着Aβ25-35作用浓度的增加,细胞活力所受抑制程度逐渐加强,与对照组相比Aβ25-3510μmol•L-1作用细胞24h后能够显著降低细胞存活率（P<0.01）。与模型组相比,三个不同浓度的槲皮素组的细胞存活率均显著增强（P<0.05）。免疫荧光染色结果显示,槲皮素可以提高海马神经元的突触数目和长度（P<0.05）,促进突触发生。槲皮素（50,100μmol•L-1）组明显促进皮层神经元突触形成,大部分神经元胞体饱满,神经元突触明显增粗,增长并连接成致密的神经网络。雌激素受体完全拮抗后,槲皮素仍可提高海马神经元的突触数目和长度（P<0.05）。槲皮素可以提高雌激素受体β拮抗后海马神经元的突触数目和长度,高于雌激素受体α拮抗（P<0.05）。Western blot结果显示,槲皮素可以提高雌激素受体α蛋白的表达。与模型组相比,槲皮素提高ERα和p-ERK1/2蛋白表达量（P<0.05）,对于ERβ蛋白表达量虽有增加但无显著性差异（P>0.05）。并且在PC12细胞实验中,Western blot结果显示,实验组凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax表达比值增加,Caspase-3蛋白表达下降（P<0.05）。当槲皮素雌激素受体受到ICI182,780抑制后,p-ERK1/2蛋白表达下降（P<0.05）,Bcl-2/Bax比值下降及Caspase-3蛋白表达增加（P<0.05）。当U0126作用于槲皮素后,Bcl-2/Bax比值下降及Caspase-3蛋白表达增加（P<0.05）。结论：槲皮素可上调雌激素受体α蛋白的表达,增加神经元突触的数目及长度,促进突触的生长及发生,从而改善神经元细胞的生长率和存活率,对大鼠海马和皮层的神经元发挥保护作用;槲皮素对Aβ25-35诱导的PC12细胞损伤的AD模型也具有保护作用,主要提高雌激素受体α蛋白的表达,通过经典的雌激素受体通路发挥其雌激素样神经保护作用,并可通过ERα介导激活MAPK信号通路,减轻凋亡。因此,槲皮素雌激素样作用对脑神经元和拟AD损伤具有保护作用,主要作用机制与调控雌激素受体α有关,并可影响ERα介导的MAPK信号通路。     

抗呆Ⅰ号对体外模拟脑缺血再灌注损伤海马神经元凋亡调控基因表达的影响

采用免疫细胞化学法,观察体外模拟脑缺血再灌注损伤对原代培养海马神经元凋亡调控基因bcl-2和bax的表达及抗呆Ⅰ号(由天麻素等中药提取物组成)的影响.结果发现,脑缺血再灌注损伤可引起海马神经元bcl-2表达减少和bax表达增加,抗呆Ⅰ号可上调神经元bcl-2的表达和下调bax的表达,表明抗呆Ⅰ号能通过调节缺血再灌注损伤神经元凋亡调控基因的表达,对缺血再灌注损伤神经细胞起到一定的保护作用.     

NS398对原代培养海马神经元Aβ肽损伤的作用

目的:研究NS398对β淀粉样蛋白(Aβ25~35)诱导的原代培养海马神经元损伤的保护作用及其可能机制。方法:以原代培养的SD大鼠海马神经元为研究对象,随机分为空白对照组、Aβ肽损伤模型组、尼莫地平阳性对照组、NS398实验组。以10μmol/L Aβ25~35造海马神经元损伤模型,通过四唑盐(MTT)比色试验测定细胞存活率,免疫细胞化学法测定Cox-2的表达,硫代巴比妥酸比色法测定培养液上清丙二醛(MDA)含量,观察NS398对Aβ25~35诱导的原代培养海马神经元损伤的保护作用。结果:与Aβ肽损伤模型组比较,NS398使神经元细胞存活率明显增高,Cox-2的表达下降,MDA含量减少,差异具有显著性(P<0.05)。结论:NS398可通过抑制Cox-2的表达,抑制细胞膜脂质过氧化对原代培养海马神经元损伤起保护作用。     

中药更年春含药血清对β淀粉样蛋白诱导的PC12细胞凋亡的影响

目的：研究大鼠更年春含药血清对β淀粉样蛋白25-35（amyloid beta protein 25-35,Aβ_（25-35））导致的大鼠肾嗜铬细胞瘤细胞（pheochromocytoma cell,PC12）损伤的抗凋亡作用。方法：通过对去势雌性大鼠灌服中药更年春制备含药血清,细胞计数试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）检测不同浓度含药血清对PC12细胞存活率的影响;不同浓度Aβ_（25-35）作用于PC12细胞,建立阿尔茨海默病细胞模型,CCK-8法检测含药血清对损伤细胞的保护作用,流式细胞术检测PC12细胞在Aβ_（25-35）和含药血清共同培养下的细胞凋亡率;蛋白印迹法检测各组细胞Bcl-2、Bax和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3（caspase-3）的蛋白表达情况。结果：与空白血清相比,20%含药血清培养PC12细胞24 h或48 h后可促进其增殖（P〈0.05）。Aβ_（25-35）对PC12细胞有细胞毒性,并呈剂量依赖性地降低细胞存活率（P〈0.05）,导致细胞凋亡。CCK-8法和流式细胞术检测均显示,20%更年春含药血清对Aβ_（25-35）诱导的PC12细胞损伤有保护作用（P〈0.05）,其作用效果类似于阳性对照药神经生长因子。蛋白印迹法检测显示,与模型组比较,含药血清组Bax和Bcl-2蛋白表达的比值和caspase-3蛋白表达均降低。结论：更年春含药血清可提高Aβ25-35损伤的PC12细胞的存活率,并减少PC12细胞凋亡。其机制可能与调控Bcl-2家族蛋白的表达而实现抗凋亡作用有关。     

机械牵张力对血清饥饿诱导的成骨细胞凋亡的作用研究--caspases，bcl-2及bax的差异表达

目的：细胞凋亡参与了机械力作用下骨组织的适应性改建。本研究的目的是观察机械牵张力对体外培养成骨细胞凋亡的影响,并通过检测caspases,bcl-2和bax的表达来探讨其相关机制。 方法：使用Flexcell 4000TM细胞应变加载系统对新生SD大鼠颅顶骨成骨细胞施加不同大小的牵张力,细胞培养于含10%胎牛血清或无血清的MEM培养液中。运用流式细胞技术检测成骨细胞的凋亡,Elisa检测caspase-3活性,Real-time RT-PCR检测细胞caspase-8,caspase-9,bcl-2和bax的基因表达。 结果：在含10% 胎牛血清的培养液中,牵张力对成骨细胞的凋亡无影响。无血清培养时,成骨细胞凋亡率和caspase-3活性增加,同时caspase-9和 bax表达也增加。6%牵张力对无血清培养诱发的成骨细胞凋亡有抑制作用,同时caspase-3活性和caspase-8表达下降,并伴随bcl-2表达升高。而12%牵张力作用于无血清培养的成骨细胞时,细胞凋亡率增加,并伴随caspase-3活性、caspase-8和bax表达升高。Caspase-9的表达在张应变刺激作用下无明显变化。 结论：机械牵张力通过caspase-8引发的caspase级联反应调控成骨细胞的凋亡。轻力上调bcl-2 的表达来抑制无血清诱导的成骨细胞凋亡,而重力通过上调bax的表达促进细胞凋亡。     

降低海马NO含量对凋亡相关因子的调节作用

目的探讨降低海马NO含量对凋亡相关因子的调节作用。方法体内和体外实验均分为4组:生理盐水对照组(NS组),海人酸致痫组(KA组),氨基胍预处理+海人酸组(AG+KA组)和氨基胍组(AG组)。采用免疫细胞化学法显示体外培养的海马神经元在不同处理因素作用24h和48h后bcl-2、bax的免疫反应性。采用Western blot法或半定量RT-PCR法检测各组大鼠造模后24h、48h时bcl-2、bax蛋白及Apaf-1mRNA的表达情况。结果在体外实验中,KA组bcl-2的免疫反应较NS组减弱而bax的免疫反应增强;AG+KA组bcl-2的免疫反应较KA组增强而bax的免疫反应减弱;AG组与NS组相比无明显差异。体内实验中,Western blot检测显示大鼠海马组织中bcl-2和bax蛋白的表达水平呈负相关,其趋势与体外实验结果一致;半定量RT-PCR检测显示Apaf-1mRNA的含量在造模后24h和48h时间点,KA组明显高于NS组(P<0.05),而AG预处理则明显拮抗KA诱导的Apaf-1mRNA高表达。结论降低NO含量可以上调bcl-2蛋白的表达,下调bax和Apaf-1mRNA的表达。