香烟提取物和腺病毒E1A基因对肺泡上皮细胞ICAM-1表达的影响

目的:探讨香烟提取物(CSE)致肺泡上皮细胞细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达的作用及腺病毒E1A基因的影响.方法:通过脂质体转染的方法将腺病毒E1A基因转染A549细胞,获取E1A阳性表达A549细胞,不同浓度的CSE活化,测定细胞ICAM-1的表达.结果:CSE显著增加A549细胞ICAM-1表达,且呈浓度依赖性;与未转染和对照质粒转染A549细胞相比较,CSE活化后E1A阳性表达A549细胞ICAM-1表达显著增加.结论:CSE能够诱导肺泡上皮细胞ICAM-1表达,而腺病毒E1A基因显著增加CSE所致的肺泡上皮细胞ICAM-1表达,提示腺病毒潜伏感染放大吸烟所致的气道炎症反应.     

白细胞介素-34/集落刺激因子-1R在转化生长因子-β1诱导A549细胞上皮-间质转化中的表达

目的探讨白细胞介素-34/集落刺激因子-1受体(IL-34/CSF-1R)在转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导A549细胞发生上皮-间质转化(EMT)中的表达。方法体外培养A549细胞;CCK 8法检测不同浓度TGF-β1在不同时间点对A549细胞增殖的影响;选用5μg/L TGF-β1刺激A549细胞(0、12、24、48h),提取细胞蛋白和RNA,Western blotting法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏连蛋白(E-Cad)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)蛋白的变化;Real-time PCR法检测IL-34、CSF-1R、MMP-2、MMP-9基因表达的变化。结果 TGF-β1对A549细胞的增殖无明显影响(P0.05)。TGF-β1刺激A549细胞后,间质细胞标志性蛋白α-SMA表达升高,上皮细胞标志性蛋白E-Cad表达下降,纤维化相关的MMP-2蛋白表达升高,MMP-9蛋白表达先升高后下降,TIMP-1蛋白早期出现短暂性增高后,呈持续降低趋势(P0.01)。IL-34mRNA表达逐渐升高,CSF-1R mRNA、MMP-2 mRNA、MMP-9 mRNA表达先升高后下降(P0.01)。结论 TGF-β1诱导A549细胞的EMT过程中,存在IL-34/CSF-1R的动态表达。     

Thy-1表达水平对肺腺癌细胞A549迁移性及部分相关基因表达的影响

目的 验证Thy-1(CD90)基因与肺癌细胞迁移潜能的关系,并探讨其作用机制. 方法 利用真核表达载体pcDNA3.0构建包含Thy-1基因全长序列的重组表达质粒载体,转染A549细胞,G418筛选获得稳定克隆,采用RT-PCR及免疫荧光技术检测重组质粒转染后细胞内Thy-1 mRNA及蛋白表达水平的改变;通过体外Transwell迁移实验研究外源性Thy-1对A549细胞迁移能力的影响. 结果 构建了pcDNA3.0-Thy-1真核细胞表达载体;成功建立了稳定表达外源性人Thy-1蛋白的肺癌A549细胞株.Trenswell实验提示,表达外源性Thy-1蛋白的A549细胞较对照组细胞体外迁移能力下降(P<0.0001);基因芯片结果提示,Thy-1基因在肺癌细胞中表达后,影响了25个细胞迁移相关基因的表达,在检测基因表达差异时,RT-PCR与基因芯片能够得到基本一致的结果. 结论 Thy-1基因的过表达能降低肺癌细胞系A549细胞的迁移能力,并改变A549细胞多个细胞迁移相关基因的表达,提示Thy-1在肺癌组织的表达状态可能影响肺癌的转移性.     

天龙咳喘灵提取物抑制A549细胞上皮-间质转化中的微RNA表达变化

目的探讨天龙咳喘灵提取物抑制转化生长因子B1（TGF-β1）诱导A549细胞上皮-间质转化（EMT）过程中微RNA（miRNA）的表达变化。方法体外培养A549细胞,TGF—β1刺激A549细胞60min后加入天龙咳喘灵提取物,应用相差显微镜观察A549细胞形态学变化。反转录-PCR、免疫印迹法检测a-平滑肌肌动蛋白（a-SMA）mRNA和蛋白表达。miRNA芯片检测A549细胞EMT前后miRNA表达的变化。结果细胞形态学观察、反转录-PCR及免疫印迹检测均显示,5μg/LTGF-β1可以诱导A549细胞EMT且可以被50mg／L天龙咳喘灵提取物抑制或逆转。miRNA芯片检测显示,与未处理的A549细胞比较,A549细胞EMT后有41种miRNA表达出现显著改变,其中26种表达上调2倍以上,15种表达下调2倍以上;与未处理的A549细胞比较,50mg／L天龙咳喘灵提取物抑制TGF—β1诱导A549细胞EMT后有46种miRNA的表达出现显著变化,其中25种表达上调2倍以上,21种表达下调2倍以上;与TGF-β1诱导A549细胞EMT比较,50mg／L天龙咳喘灵提取物抑制A549细胞EMT时有17种miRNA差异表达,其中13种表达下调2倍以上,4种表达上调2倍以上。结论天龙咳喘灵提取物可以抑制TGF-β1诱导的A549细胞EMT,并参与调控miRNA的差异表达,可能有助于阻止慢性肺部纤维化疾病的进展。     

FOXP3 基因沉默抑制肺腺癌 A549 细胞上皮-间质转化和改善 5-氟尿嘧啶耐药性

目的：探究叉头蛋白3(FOXP3)基因沉默对肺腺癌上皮-间质转化（EMT）及5-氟尿嘧啶（5-FU）耐药性的影响。方法：构建2段特异性针对FOXP3基因的siRNA片段，并将其通过脂质体介导转染至肺腺癌A549细胞，同时设立转染无义序列的阴性对照组。将转染后的A549细胞分为3组：si-NC组（阴性对照）、si-FOXP3-1组和si-FOXP3-2组。qRT-PCR和Western blot检测各组细胞中FOXP3的表达水平，Western blot检测各组细胞中E-钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）以及N-钙黏蛋白（N-cadherin）表达水平，Transwell检测各组细胞迁移和侵袭能力，ELISA检测各组细胞上清液中基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9蛋白浓度。qRT-PCR和Western blot检测5-FU处理A549细胞后FOXP3表达水平，CCK-8检测各组细胞对5-FU的敏感性，Western blot检测各组细胞中P-糖蛋白（P-gp）表达水平。结果：与si-NC组相比，si-FOXP3-1和si-FOXP3-2组中FOXP3在...     

土荆皮乙酸通过PI3K/AKT通路抑制肺腺癌细胞A549上皮-间质转化

目的:探讨土荆皮乙酸(PAB)对TGF-β1介导的人肺癌细胞A549上皮-间质转化(EMT)及侵袭能力的影响及作用机制.方法:采用Transwell小室实验检测PAB对A549细胞迁移、侵袭能力的影响.免疫荧光法检测上皮标志蛋白E-钙黏蛋白(E-Cad)表达.Western blot检测上皮相关标志物E-Cad、α-连...     

pcDNA3.1-Smac真核表达载体的构建及表达

目的:构建人的smac基因真核表达载体pcDNA3.1-Smac,并在肺腺癌A549细胞中表达.方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人睾丸组织中扩增到smac基因,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Smac.酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至肺腺癌A549细胞中.采用RT-PCR、Western blot法检测外源基因smac的表达,MTT法检测细胞生长抑制率.结果:PCR扩增片段与预期片段大小相符,插入片段测序结果与GenBank公布的一致,表明人smac基因克隆及真核表达载体peDNA3.1-Smac构建成功.在mRNA水平和蛋白水平,转染后的细胞中外源基因smac表达均明显增加.转染smac质粒72 h后,细胞的生长抑制率较转染空质粒组显著增加.结论:成功构建重组真核表达载体peDNA3.1-Smac,并在肺癌A549细胞中进行了表达;验证了转染后对肺癌细胞生长有抑制作用.     

低氧通过上调乙酰辅酶A羧化酶1促进肺腺癌A549细胞迁移

目的 探讨低氧通过乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)促进入肺腺癌A549细胞迁移的机制.方法 低氧(5％O2)处理肺腺癌A549细胞,应用Transwell迁移实验检测细胞迁移能力,Western blotting检测ACC1表达及上皮-间质转化(EMT)相关蛋白的表达水平.结果 与常氧(对照组)相比,低氧处理促进了A54...     

独特型TCR Vα1-pIRES-TCR Vβ8表达载体构建及体外表达

目的:构建Jurkat细胞株独特型TCR Vα1-pIRES-TCR Vβ8表达载体,转染后了解其体外表达情况.方法:根据聚合酶链反应-基因扫描(PCR-Genescan)检测Jurkat细胞株TCR Vα及Vβ亚家族表达情况,分别将其所表达的单克隆性的TCR Vα1及TCR Vβ8亚家族基因片段克隆至质粒pIRES的多克隆位点A(MCS A)和多克隆位点B(MCS B)中.通过限制性酶切分析、序列分析、RT-PCR、间接免疫荧光、流式细胞术(FCM)手段鉴定重组表达载体的正确性以及转染A549和Molt4细胞后基因及蛋白的表达情况.结果:构建了2组TCR Vα1-pIRES-TCR Vβ8表达载体,该表达载体转染A549和Molt4细胞后,在mRNA和蛋白水平检测到了TCR Vα1和TCR Vβ8的表达.结论:成功构建了2种独特型Vα1-pIRES-TCR Vβ8真核表达载体,为利用特异性TCR基因修饰T细胞的研究提供方法学依据.     

脂多糖刺激巨噬细胞获得的外泌体促进TGF-β1诱导的人A549细胞上皮间质转化

目的探索炎性环境下巨噬细胞来源外泌体对转化生长因子β1 (TGF-β1)诱导的肺脏上皮间质转化(EMT)的影响。方法采用透射电镜鉴定外泌体形态, Western blot法检测外泌体特异性标志物肿瘤易感基因101(TSG101)、附属蛋白质凋亡关联基因α相互作用蛋白X(ALIX)、 CD81、 CD9蛋白及外泌体不含有的钙连蛋白(calnexin)对THP-1巨噬细胞来源的外泌体进行鉴定。利用TGF-β1诱导肺泡上皮A549细胞发生EMT,比较脂多糖(LPS)刺激和未刺激THP-1细胞来源外泌体对A549细胞间质化特征的影响。结果成功建立TGF-β1诱导A549细胞发生EMT模型和获得THP-1巨噬细胞来源的外泌体。与未经LPS处理巨噬细胞来源外泌体比较, LPS刺激THP-1细胞来源的外泌体能显著促进TGF-β1诱导A549细胞EMT,包括显著下调上皮钙黏蛋白(E-cadherin)表达水平,上调波形蛋白(vimentin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、TGF-β1/SMAD家族成员2/3(Smad2/3)通路Smad2/3蛋白和磷酸化的Smad2/3(p-Smad2/3)和1型胶原蛋白(Col1)等细胞间质化相关的信号蛋白表达。结论 LPS刺激巨噬细胞来源的外泌体通过激活TGF-β/Smad2/3信号,上调A549细胞中vimentin、α-SMA和Col1等细胞间质化相关蛋白的表达,促进A549细胞发生EMT。     

p38促进尼古丁诱导的大鼠血管平滑肌细胞的细胞外基质表达

目的 探讨尼古丁对大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)的细胞外基质(ECM)表达的影响及可能的机制.方法 用终浓度为100μmol/L的尼古丁作用于体外培养的大鼠VSMCs 24 h,以不加尼古丁的细胞为对照组,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、免疫印迹(Western blotting)方法检测ECM包括Ⅰ型胶原、纤维黏连蛋白和膜受体整合素表达的差异,以及可能参与信号转导的蛋白激酶p38的活性变化.结果 与对照组相比,尼古丁刺激组细胞的两种细胞外基质包括I型胶原和纤维黏连蛋白及膜受体整合素β1的表达均升高,分别为对照组的1.8倍、1.7倍和1.6倍,差异显著(P<0.05);尼古丁刺激组的蛋白激酶p38的活性比对照组高1.95倍,差异极其显著(P<0.01);p38的活性被特异抑制剂SB202190抑制后,尼古丁诱导的I型胶原的表达也随之下降.结论 p38参与尼古丁诱导的细胞外基质的高表达.     

5-氟尿嘧啶抑制TGF-β1诱导人肝内胆管上皮细胞间质化

目的探讨5-氟尿嘧啶对TGF-β1诱导人肝内胆管上皮细胞间质化的抑制作用,并探讨其作用机制。方法原代培养人肝内胆管上皮细胞,角蛋白19荧光染色鉴定;细胞分为:对照(normal)组,TGF-β1(TGF-β1)组,5-氟尿嘧啶(TGF-β1+5-FU)组;免疫荧光染色观察CK-19、E-cadherin、vimentin和α-SMA标记蛋白;Western blot检测细胞标记蛋白及TGF-β1表达量;Real-time PCR检测细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF-β1 mRNA含量。结果原代培养的人肝内胆管上皮细胞呈多边形或者锥形,CK-19荧光染色为胞质着色;TGF-β1诱导72 h后,胆管上皮出现间质化表现,与正常组比较,vimentin、α-SMA和TGF-β1表达明显增强(P0.05),CK-19和E-cadherin表达显著减弱(P0.05),Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGF-β1 mRNA含量显著升高(P0.05);5-FU抑制胆管上皮间质化,与TGF-β1组比较,CK-19和E-cadherin表达增强(P0.05),vimentin、α-SMA和TGF-β1表达明显减弱(P0.05),TGF-β1 mRNA和Ⅲ型胶原mRNA含量明显降低(P0.05)。结论 5-FU通过下调TGF-β1的表达抑制胆管上皮细胞间质化。     

体外肺癌上皮-间充质转化三维模型的建立及其对顺铂抵抗的机制研究

目的:探索转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导三维培养肺癌细胞发生上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)及对顺铂抵抗的相关机制.方法:用荧光倒置显微镜、扫描电镜及激光共聚焦观察人非小细胞肺癌细胞系95D在...     

异丙肾上腺素诱导的大鼠肥厚心肌组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达

目的 探讨Ⅰ、Ⅲ型胶原在肥厚心肌组织中的变化特征.方法 SD大鼠60只,分为对照组和实验组,两组分别再分为1、4、8周组,每组10只.对照组背部皮下注射生理盐水4ml/(kg·d);实验组背部皮下注射异丙肾上腺素4mg/(kg·d).两组分别注射1、4、8周,然后测定各组大鼠体重(BW)、心脏湿重(HW)、左室湿重(LVW),计算出HW/BW、LVW/BW;心肌组织冷冻切片,利用图像分析软件,测量心肌细胞横径(TDM)和心肌细胞截面积(CA).免疫组织化学法检测各组心肌组织Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达.Western blotting方法检测心肌肥厚大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达及其含量.结果 免疫组织化学结果显示,注射异丙肾上腺素1周后,Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白表达明显增加,4周后有所下降.Western blotting结果显示,实验各组Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达均多于对照组(P＜0.01);实验1周时Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达量最高,4周和8周均下降.实验4周和8周组与1周组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 心肌肥厚发生1周左右是Ⅰ、Ⅲ型胶原增加的高峰期,以后趋于稳定.心肌肥厚主要引起胶原量的变化,不破坏胶原纤维的网络结构.     

转化生长因子β及其信号转导分子Smad4在肾小球硬化中的作用研究

目的：探讨转化生长因子β（TGF-β1）及其信号转导分子Smad4在肾小球肾炎中的表达及其意义。 方法： 以20例正常肾组织为对照组,对38例各种不同组织学类型肾小球肾炎的肾活检标本,分别行免疫组化方法观察TGF-β1、Smad4、胶原Ⅰ（collagen type Ⅰ）在肾小球中的染色强度,并对其检测结果作图像分析处理;以体外培养的人系膜细胞为对象，观察TGFβ1对系膜细胞表达Smad4、胶原Ⅰ的影响，Smad4、胶原Ⅰ的基因表达用RT-PCR检测，蛋白表达用Western blotting检测。 结果： 所有增生、硬化病理类型肾炎中病变肾小球TGFβ1、Smad4、胶原Ⅰ蛋白表达均高于对照组（P<0.05）,且TGFβ1、Smad4两者在肾小球中的表达与胶原Ⅰ在肾小球中的堆积呈多重相关（P<0.05）；外源性TGFβ1刺激人肾系膜细胞后，细胞的Smad4基因表达和蛋白表达增高（P<0.05）；胶原Ⅰ的基因表达和蛋白表达也相应增高（P<0.05）。 结论： TGFβ1及其信号转导分子Smad4可能参与病变肾小球ECM的过量堆积，在肾小球硬化过程中起重要作用。     

护肝合剂对肝星形细胞的活化及胶原表达的作用和机制

目的观察护肝合剂对肝损害模型大鼠血清TGF-β1的影响及护肝合剂含药血清对HSC—T6细胞的增殖、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达的影响,探讨该复方对肝纤维化的可能作用及其机制。方法设立正常组、护肝合剂组、模型组,采用卡介苗和脂多糖进行肝损害造模,然后观察3组ALT、AST和血清TGF-β1的变化。制备各组大鼠的血清,进行HSC-T6细胞的培养,采用MTT方法观察该细胞的增殖情况．并用RT—PCR的方法观察Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达。结果模型组造模前后的ALT、AST及TGF-β1都显著升高（P〈0．01）,护肝合剂组上述指标较模型组显著下降（P〈0．01）,护肝合剂组的HSC-T6细胞增殖较模型组显著下降（P〈0．01）,且没有Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达。结论护肝合剂能在一定程度上通过改善肝功能、降低TGF-β1水平抑制肝星形细胞的增殖,改善肝纤维化程度。     

创伤后应激障碍模型大鼠内侧前额皮质磷酸化细胞外信号调节激酶1/2及EM>c-fos/EM>的变化

目的 探讨创伤后应激障碍（PTSD）模型大鼠内侧前额皮质（mPFC）磷酸化细胞外信号调节激酶1/2（pERK1/2）和c-fos的表达变化。 方法 将30只成年健康雄性Wistar大鼠随机分为对照组（15只）和PTSD模型组（15只）,采用无连续单一应激（SPS）方法制备PTSD模型。用免疫组织化学和免疫印迹法检测mPFC pERK1/2的表达变化,RT-PCR检测c-fos mRNA表达变化。 结果 免疫组织化学分析显示,对照组和模型组pERK1/2阳性细胞数分别为10.4±2.07、48.8±10.08,阳性信号吸光度值分别为24.955±3.691、110.810±10.643,差异有统计学意义（P<0.01）;免疫印迹分析显示,对照组和模型组pERK/2相对表达量分别为0.510±0.052和1.109±0.106,差异有统计学意义（P<0.01）;RT-PCR分析结果显示,对照组和模型组c-fos mRNA相对表达分别为0.267±0.067和1.049±0.131,差异有统计学意义（P<0.01）。 结论 mPFC pERK1/2和c-fos表达增高,可能参与了PTSD模型大鼠的病理生理过程。     

Ac-SDKP suppresses epithelial–mesenchymal transition in A549 cells via HSP27 signaling

The synthetic tetrapeptide N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline (Ac-SDKP) has been shown to be a modulator of molecular aspects of the fibrosis pathway. This study reveals that Ac-SDKP exerts an anti-fibrotic effect on human type II alveolar epithelial cells (A549), which are a source of myofibroblasts once exposed to TGF-β1, by decreasing the expression of heat shock protein 27 (HSP27). We used A549 cells in vitro to detect morphological evidence of epithelial–mesenchymal transition (EMT) by phase-contrast microscopy. Immunocytochemical and western blot analysis determined the distributions of cytokeratin 8 (CK8), α-smooth muscle actin (α-SMA), and SNAI1. Confocal laser scanning microscopy revealed a colocalization of HSP27 and SNAI1 on TGF-β1-induced A549 cells. These results also demonstrated that A549 cells became spindle-like when exposed to TGF-β1. Coincident with these morphological changes, expression levels of CK8 and E-cad decreased, while those of vimentin and α-SMA increased. This process was accompanied by increases in levels of HSP27, SNAI1, and type I and type III collagen. In vitro transfection experiments demonstrated that the inhibition of HSP27 in cultured A549 cells could decrease the expression of SNAI1 and α-SMA while increasing the expression of E-cad. A noticeable reduction in collagen types I and III was also evident. Our results found that Ac-SDKP inhibited the transition of cultured A549 cells to myofibroblasts and attenuated collagen synthesis through modulating the expression of HSP27.