人AMPKα2基因pEGFP-N1-AMPKα2表达载体的构建和鉴定

目的 构建表达人单磷酸腺苷激活的蛋白激酶催化亚单位α2(AMPKα2)基因的pEGFP-N1-AMPKα2载体,转染SH-SY5Y细胞系,观测其上调AMPKα2基因的效果.方法 PCR法扩增AMPKα2基因片段,克隆到pEGFP-N1质粒载体上.对重组质粒进行DNA序列测定和酶切分析.用质脂体将重组质粒pEGFP-N1-AMPKα2转染到SH-SY5Y细胞系,经G418筛选阳性克隆后,用RT-PCR和Western blot法检测AMPKα2的mRNA和蛋白表达.流式细胞仪检测转染重组质粒细胞内ROS变化.结果 经DNA测序和酶切鉴定表明,pEGFP-N1-AMPKα2表达载体构建成功.重组质粒pEGFP-N1-AMPKα2转染SH-SY5Y细胞系后,细胞中AMPKα2蛋白表达量明显增高.SH-SY5Y细胞转染pEGFP-N1-AMPKα2后,ROS含量增多.结论 成功构建了人AMPKα2基因的pEGFP-N1-AMPKα2表达载体.pEGFP-N1-AMPKα2能有效上调AMPKα2基因在SH-SY5Y细胞系中的表达,为将来应用其研究AMPK在局麻药致细胞损伤中的作用奠定了基础.     

人干扰素α高效表达质粒pEE14.1-IFN-α的构建和表达

目的:构建人干扰素α的高效表达质粒pEE14.1-IFN-α,并在真核细胞中验证其表达。方法:通过PCR获得人IFN-α基因,连入过渡载体pCI-GPI,然后克隆入高效表达载体pEE14.1中,构建重组表达质粒pEE14.1-IFN-α。瞬时转染293T细胞后48 h收获上清,采用ELISA,Western blot分别验证目的基因表达。结果:pEE14.1-IFN-α经酶切和测序分析,与预期设计完全一致,表明重组质粒构建成功。ELISA法检测瞬时转染细胞上清中α干扰素含量,浓度约为3.15 ng/mL,说明表达的蛋白有免疫活性,Western blot检测也显示该重组质粒在上清中分泌表达。结论:成功构建高效表达质粒pEE14.1-IFN-α,为慢性乙肝免疫治疗提供新的备选方案。     

多发性骨髓瘤负性相关基因DAZAP2的真核表达及定位

目的 构建无精症相关蛋白2(DAZAP2)真核表达重组载体, 对基因进行细胞定位. 方法提取1例正常人骨髓单个核细胞总RNA, 以逆转录产物作为模板,PCR扩增DAZAP2的开放阅读框(ORF).采用定向克隆法与真核表达载体pEGFP-N1连接,转染大肠杆菌DH5α,经双酶切及测序证实.脂质体法转染COS7细胞后,运用Western 印迹及免疫定位技术检测表达产物.结果 测序证实真核表达重组质粒的阅读框没有发生改变,转染重组质粒的细胞表达融合蛋白DAZAP2-EGFP,主要在COS7细胞质中表达.结论 成功获得了DAZAP2真核表达重组质粒并有效地表达重组融合蛋白,DAZAP2主要定位在细胞质中的泡状分泌结构上.     

多发性骨髓瘤负性相关基因DAZAP2的真核表达及定位

目的 构建无精症相关蛋白2（DAZAP2）真核表达重组载体, 对基因进行细胞定位. 方法提取1例正常人骨髓单个核细胞总RNA, 以逆转录产物作为模板,PCR扩增DAZAP2的开放阅读框（ORF）.采用定向克隆法与真核表达载体pEGFP-N1连接,转染大肠杆菌DH5α,经双酶切及测序证实.脂质体法转染COS7细胞后,运用Western 印迹及免疫定位技术检测表达产物.结果 测序证实真核表达重组质粒的阅读框没有发生改变,转染重组质粒的细胞表达融合蛋白DAZAP2-EGFP,主要在COS7细胞质中表达.结论 成功获得了DAZAP2真核表达重组质粒并有效地表达重组融合蛋白,DAZAP2主要定位在细胞质中的泡状分泌结构上.     

EGFP-pBABE逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的 构建表达增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的EGFP-pBABE逆转录病毒载体并对其表达进行鉴定.方法 从pEGFP-N3质粒上切下EGFP片段,连接到pBABE载体,构建EGFP-pBABE重组质粒;将该重组质粒转染到PT67细胞后,荧光显微镜下观察EGFP的表达;收集逆转录病毒感染宫颈癌SiHa细胞后荧光显微镜下观察EGFP的表达.结果 成功构建EGFP-pBABE重组质粒.该质粒转染PT67细胞24 h后,荧光显微镜下可观察到EGFP的表达;用该重组质粒包装的逆转录病毒感染宫颈癌SiHa细胞36 h后,在荧光显微镜下可观察到明显的EGFP表达.结论 成功构建表达EGFP的EGFP-pBABE逆转录病毒载体,为进一步利用该载体制备逆转录病毒并观测逆转录病毒感染细胞的效率奠定了良好的实验基础.     

免疫毒素基因DT390真核表达载体的构建及功能研究

目的：构建一种新型免疫毒素DT390-mIP10（白喉杆菌毒素390-小鼠γ干扰素诱导性蛋白10）基因的真核表达质粒,并对其功能进行初步研究.方法：通过RT-PCR扩增mIP10基因,并插入到含有DT390基因片段的真核质粒SRα中,构建重组质粒.以PolyFect脂质体转染NIH3T3细胞,用免疫荧光检测重组质粒的表达;用MTT比色法测定重组免疫毒素质粒的生物学活性.结果：构建了DT390-mIP10的真核表达载体SRα-DT390-mIP10,并在NIH3T3细胞中获得表达.表达的DT390-mIP10在体外能有效地杀伤活化的T细胞.结论：免疫毒素基因重组真核表达载体DT390-mIP10的构建成功并在真核细胞中表达,为其在肿瘤及自身免疫性疾病治疗方面的进一步应用研究奠定了基础.     

PML-RARα/pIRES和PML-RARα/pSecTag重组载体的构建和鉴定

目的 构建PML-RARα基因重组表达质粒,为发展PML-RARα基因疫苗提供实验依据. 方法利用RT-PCR方法从急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞中扩增出465 bp 的位于PML-RARα融合基因的框内结构的片段,克隆至真核表达载体pIRES和分泌载体pSecTag后,经酶切和序列分析鉴定重组质粒的构建情况.结果 经酶切鉴定和序列测定表明,PML-RARα目的基因已正确插入真核表达载体中,构成了目的重组载体. 结论成功构建了PML-RARα/pIRES和PML-RARα/pSecTag重组真核表达质粒,可进一步用于PML-RARα基因疫苗的实验研究.     

EBV特异性CTL相关TCR Vα-pIRES-TCR Vβ重组质粒的构建及体外表达

目的 构建EBV特异性细胞毒T细胞(CIL)相关的TCR Vα-pIRFS-TCR Vβ真核双表达质粒.方法 通过RT-PCR和基因扫描技术分析EBV特异性CTL克隆的T细胞受体(TCR)Vα和Vβ谱系表达情况及T细胞克隆性,确定其优势表达的TCR Vα15和TCR Vβ1亚家族基因的核苷酸序列(包括CDR3互补决定区),PCR扩增出TCR Vα15和TCR Vβ1基因后,分别定向克隆入真核双表达载体pIRES,构建双顺反子重组质粒TCR Vα-pIRES-TCR、Vβ,转基因技术将其转染A549细胞和Molt4细胞,通过RT-PCR、实时定量PCR、流式细胞术和蛋白印迹分析检测TCR Vα15和TCR Vβ1基因的表达.结果 酶切分析和核酸序列测定证实重组质粒构建正确,转染重组质粒的细胞能够表达TCR Vα15和TCR Vβ1的mRNA及蛋白.结论 成功构建了EBV特异性的TCR Vα-pIRES-TCR Vβ双顺反子真核表达质粒,并在体外实现了共表达,为进一步的实验研究奠定了基础.     

PML-RARα/pIRES和PML-RARα/pSecTag重组载体的构建和鉴定

目的 构建PML-RARα基因重组表达质粒,为发展PML-RARα基因疫苗提供实验依据. 方法利用RT-PCR方法从急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞中扩增出465 bp 的位于PML-RARα融合基因的框内结构的片段,克隆至真核表达载体pIRES和分泌载体pSecTag后,经酶切和序列分析鉴定重组质粒的构建情况.结果 经酶切鉴定和序列测定表明,PML-RARα目的基因已正确插入真核表达载体中,构成了目的重组载体. 结论成功构建了PML-RARα/pIRES和PML-RARα/pSecTag重组真核表达质粒,可进一步用于PML-RARα基因疫苗的实验研究.     

pNTAP-PRAK真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的: 构建pNTAP-PRAK真核表达质粒,并建立其稳定表达的HEK293细胞系。方法: 将人的PRAK亚克隆至串联亲和纯化(tandem affinity purification, TAP)载体pNTAP质粒上,构建成重组质粒pNTAP-PRAK,转化该重组质粒至感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆进行PCR、酶切及DNA测序验证正确后,利用PolyFect脂质体介导将其转染至HEK293细胞中,再通过G418筛选建立稳定表达TAP tag-PRAK融合蛋白的HEK293细胞系;利用Western blotting和细胞免疫荧光标记法检测融合蛋白TAP tag-PRAK的表达及细胞内定位情况。结果: 重组真核表达载体构建正确,该重组质粒能在HEK293细胞中稳定表达,表达产物TAP tag-PRAK主要分布在核内。结论: 成功构建pNTAP-PRAK真核表达载体并建立了其稳定表达的HEK293细胞系,TAP标签未对PRAK定位产生明显影响。     

pEGFP-N1-PGC-1α重组质粒的构建及体外表达

目的 构建PGC-1α真核表达载体pEGFP-N1-PGC-1α重组质粒,鉴定及体外表达.方法 通过RT-PCR方法从组织中克隆PGC-1α基因片段,酶切后将其定向插入真核表达载体pEGFP-N1中,构建pEGFP-N1-PGC-1α重组质粒.结果 双酶切法、测序法鉴定表明目的基因正确插入质粒.结论 成功构建了pEGFP-N1-PGC-1α真核表达载体,转染huh-7细胞后,可瞬时、有效表达,为进一步研究PGC-1α调节HBV、HPV生物合成奠定了基础.     

RNAi沉默HIF-10α基因抑制滋养细胞TGF-3β表达的实验研究

目的 构建缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)基因的短发夹状干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒,探讨其在低氧条件下对BeWo细胞转化生长因子3β(transforming growth factor 3β,TGF-3β)基因表达的抑制作用.方法 根据小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)设计原则,针对HIF-1α基因设计并合成两条寡聚DNA片段,退火后克隆入pSilencer2.1-U6-neo质粒,应用脂质体将重组质粒转染BeWo细胞.缺氧培养后,应用Western blot法检测滋养细胞HIF-1α和TGF-3β蛋白表达水平,应用real time PCR法检测滋养细胞HIF-1α和TGF-3βmRNA表达水平.结果 成功构建HIF-1α的shRNA真核表达载体,转染BeWo细胞.低氧条件下,细胞HIF-1α蛋白和mRNA表达下降;同时细胞TGF-3β蛋白和mRNA表达也降低.结论 构建的HIF-1α基因shRNA表达质粒在低氧条件下明显抑制滋养细胞TGF-3β基因的表达.     

小鼠子宫珠蛋白结合蛋白真核表达载体构建及其在COS-1细胞的表达

目的:构建小鼠子宫珠蛋白结合蛋白(mouse uteroglobin binding protein,mUGBP)真核表达载体,观察其在COS-1细胞中的表达和定位.方法:用RT-PCR方法扩增mUGBP的cDNA序列,将其插入pEGFP-N1载体的多克隆位点构建pEGFP-UGBP重组质粒.采用脂质体转染法将重组质粒转染到无内源性mUGBP表达的非洲绿猴肾成纤维细胞株COS-1中,观察其在细胞内的表达,并用Western免疫印迹方法进行验证.结果:pEGFP-UGBP重组质粒经酶切鉴定以及测序证实,插入的目的基因序列完全正确.激光共聚焦显微镜观察发现,转染了pEGFP-UGBP重组质粒的细胞株可见绿色萤光蛋白的表达;Western免疫印迹检测发现细胞膜组分中可检获上述转染了重组质粒的细胞所表达的融合蛋白.结论:成功构建了pEGFP-UGBP重组质粒并进行了真核表达.     

小鼠MIP-1α-DT390重组免疫毒素原核表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠MIP-1α基因和白喉杆菌外毒素DT390基因的原核融合表达载体,诱导并鉴定该蛋白的表达.方法 通过RT-PCR获得mMIP-1α基因,通过PCR扩增质粒SPα-DT390获得DT390基因,酶切、连接,构建原核表达载体pET-32a( )-mMIP1-1α-DT390,重组质粒证实构建成功后,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),通过IPTG诱导融合蛋白表达,并用SDS-PAGE和蛋白免疫印迹法鉴定.结果 成功构建了mMIP-lα与DT390基因的原核融合表达载体pET-32a( )-mMIP-Iα-DT390,重组载体在大肠杆菌中获得了稳定的表达,表达蛋白的相对分子质量与预期值一致,并可被抗mMIP-1α和抗白喉毒素的特异性抗体所识别.结论 获得了mM皿1α与DT390融合基因在原核系统中的稳定表达,为研究其临床应用奠定了基础.     

携带人livin α基因腺病毒载体的构建及其在树突状细胞的表达

目的:本研究旨在利用AdMax系统构建携带人抗凋亡基因livinα的重组腺病毒载体(rAd-livinα),并感染树突状细胞(Dendritic cells,DCs),制成DCs疫苗,为下一步用此疫苗抗肿瘤实验奠定基础。方法:以质粒pIRES2-EGFP-livinα为模板,通过PCR扩增出人livinα基因cDNA序列,再将livinα基因cDNA亚克隆于穿梭质粒pDC316-EGFP-cmv,获得重组质粒pDC316-EGFP-cmv-livinα。将鉴定后的重组穿梭质粒pDC316-EGFP-cmv-livinα与腺病毒辅助质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞,同源重组获得重组腺病毒rAd-livinα。用重组腺病毒rAd-livinα感染人DCs后,Western blot方法分析livinα蛋白表达,流式细胞仪检测DCs的表型变化。结果:在HEK293细胞内能观察到重组腺病毒rAd-livinα绿色荧光蛋白的表达。rAd-livinα经PCR鉴定特异性地扩增出符合预期大小的片段。rAd-livinα感染的DCs中可检测到livinα蛋白的表达,并且感染的DCs与未感染DCs比较,可明显提高了细胞表面分子CD83、CD86和HLA-DR的表达(P<0.05)。结论:通过AdMax系统成功构建了重组腺病毒rAd-livinα,使livinα蛋白有效表达于DCs中,并且重组腺病毒感染的DCs的成熟度得到提高。     

GFP／HBVX融合蛋白重组载体的构建及稳定表达细胞系的建立

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与人乙型肝炎病毒（HBV）X基因的重组表达载体，建立稳定表达HBVX蛋白（HBx）与GFP融合蛋白的HepG2细胞系，以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用。方法应用PCR法从adr亚型HBV质粒pHBVDNA中扩增HBVX基因片段，PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点，转化宿主菌DH5α，采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pGFP-HBx；采用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒、pGFP-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，G418选择抗性细胞克隆，荧光显微镜下观察GFP表达，挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR检测转染细胞HBVX基因的表达。结果经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBVX重组表达载体pGFP-HBx；将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组质粒转染HepG2．，经G418筛选15d获得抗性细胞克隆。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次，细胞仍表达强的荧光蛋白。RT-PCR检测表明转染pGFP-HBx重组体的HepG2／GFP-HBx细胞有HBVX转录、表达。结论成功构建了GFP．HBVX真核重组表达载体pGrP-HBx；获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系，这为进一步研究FIBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础。     

基于辛德毕斯病毒载体的重组丙肝病毒颗粒的制备与鉴定

目的 利用自主研发的辛德毕斯病毒载体构建含有丙型肝炎病毒( HCV)结构蛋白E1E2的重组病毒颗粒.方法 将编码HCV包膜糖蛋白的E1 E2基因克隆至辛德毕斯病毒载体,构建重组质粒pBR-XJE1E2和pVA-XJE1E2,转染BHK-21细胞后获得重组丙肝病毒颗粒.并通过RTPCR、间接免疫荧光和Western Blot方法鉴定表达E1E2蛋白的重组病毒颗粒.结果 酶切、PCR和测序分析表明重组质粒构建成功.RT-PCR、间接免疫荧光和Western-Blot鉴定结果表明重组质粒转染细胞后能包装出表达E1E2的丙肝病毒颗粒.结论 以辛德毕斯病毒载体为基础构建的重组质粒可在真核细胞中包装出重组丙肝病毒颗粒,这为进一步研究其在动物体内免疫反应奠定了基础.     

重组小鼠质粒pEGFP-NGB的构建和在培养神经胶质细胞中表达的实验研究

目的：构建重组小鼠质粒pEGFP-NGB并研究其在培养神经胶质细胞中的表达。方法：采用RT-PCR从小鼠脑组织总RNA中扩增出该基因的全序列cDNA,并克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体中,构建重组质粒pEGFP-NGB表达载体。采用GeneJamer转染试剂和pEGFP-NGB重组子混合后转染至培养神经胶质细胞中,观察NGB在培养神经胶质细胞中mRNA以及蛋白表达。结果：阳性克隆测序结果显示所测序列与Genbank序列一致。RT-PCR和Western-blot结果表明转染重组质粒pEGFP-NGB培养神经胶质细胞NGB mRNA和蛋白均有较高的表达。荧光显微镜下观察发现, 培养神经胶质细胞中有较多绿色荧光蛋白表达。结论：(1)成功构建pEGFP- NGB重组子;(2)构建的pEGFP-NGB重组子可在培养神经胶质细胞中表达。     

细胞内趋化因子重组突变体SDF-1α/54/KDEL的构建及其对CXCR4受体在细胞膜表面表达的抑制作用

构建人基质细胞衍生因子(SDF-1)突变体SDF-1α/54/KDEL重组真核表达质粒,并考察其对T细胞性白血病细胞株Molt-4细胞表面受体CXCR4表达的影响,为尝试表型敲除肿瘤细胞CXCR4以抑制肿瘤的转移提供理论和实验依据.以SDF-WT-Gly×4-Dec/PET30a( )质粒为模板,用PCR法扩增出SDF-1α/54并将其亚克隆至真核表达质粒pEGFP-C3构建成真核表达载体pEGFP-C3/SDF-1α/54/KDEL.经酶切及测序验证后,脂质体介导转染入COS-7细胞,通过Western blot检测SDF-1α/54/KDEL的表达.电穿孔法将重组载体瞬时转染CXCR4高表达的Molt-4,并用流式细胞仪检测CXCR4含量的变化.DNA测序证明:读码框完全正确,重组真核表达载体含有SDF-1α/54基因和编码4肽KDEL的基因,Western blot证明融合蛋白能在COS-7细胞表达.电穿孔转染Molt-4细胞后发现,SDF-1α/54/KDEL可以显著降低胞膜表面CXCR4表达量.由此提示: KDEL介导的SDF-1α/54对Molt-4细胞CXCR4具有表型敲除作用,且此效应不受SDF-1α C端α螺旋缺失的影响.