重组人白细胞介素24蛋白对胰腺癌细胞生长的影响

目的构建人白细胞介素24(IL-24)基因的表达载体并在大肠杆菌中诱导表达,观察纯化后的IL-24融合蛋白导致人胰腺癌细胞(Panc-1)生长抑制的作用。方法用限制性内切酶从质粒pET30b-IL-24中酶切获取人IL-24cDNA片段。并将该片段与pET42a原核表达载体基因重组,在大肠杆菌中实现重组基因的表达,提取并纯化rhIL-24蛋白。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)和Westernblot对表达产物进行鉴定。以不同浓度的重组蛋白IL-24与胰腺癌细胞Panc-1、正常肝胚细胞CCC-HEL-1共培养48h,同时设立相应浓度梯度的HIS-GST融合蛋白组对照组。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞的生长抑制情况。结果酶切结果证实,成功构建了pET42a-IL24原核表达载体,并在大肠杆菌中获得稳定的表达。rhIL-24蛋白以浓度依赖性的关系抑制Panc-1细胞的生长,抑制率明显高于HIS-GST蛋白。结论rhIL-24蛋白对胰腺癌细胞Panc-1生长有抑制作用。     

sCR1在原核中表达、纯化、复性及活性鉴定

目的采用原核表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中获得高表达、高活性的重组人sCR1融合蛋白。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入原核表达载体pET28a中,构建含人sCR1的重组质粒(pET28a-sCR1),经测序鉴定正确,转化入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行复性及生物学活性鉴定。结果获得原核表达载体pET28a-sCR1,经PCR鉴定及测序鉴定,得到重组E.coli BL21(DE3)克隆菌株,经IPTG诱导含有pET28a-sCR1的E.coli BL21(DE3)克隆菌,表达出重组人sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr大于29000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化、复性后得到高纯度的sCR1融合蛋白表达及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

胸腺素α1-胸腺五肽在大肠杆菌中的表达及表达条件优化

目的探讨胸腺素α1-胸腺五肽(Tα1-TP5)在大肠杆菌中的表达及表达条件优化。方法将化学合成的Tα1-TP5基因与原核表达载体pGEX-4T-1融合并转化至E.coliBL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。利用SDS-PAGE电泳和AlphaEase凝胶电泳图像分析系统研究培养基组成、诱导时机、诱导温度、诱导剂浓度及诱导时间等条件对融合蛋白表达量的影响。融合蛋白经GST琼脂糖珠亲和色谱纯化及重组肠激酶切割后,电喷雾质谱鉴定Tα1-TP5。结果选用TB培养基,在菌体对数生长中后期加入终浓度为0.05 mmol/L的IPTG,37℃诱导5 h,GST融合蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的35.8%,且主要以可溶形式表达。Tα1-TP5的分子质量与理论值相似。结论 Tα1-TP5成功在E.coli中表达,并确定了最佳表达条件。     

人SMYD3基因原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

构建人SMYD3基因原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达。通过PCR方法从重组质粒pcD-NA-SMYD3中扩增得到SMYD3基因,将其克隆入pGEX-6P-1原核表达载体。将重组质粒转化入E.coli Rosetta(DE3)中,以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定。酶切鉴定和测序结果证明成功构建了重组表达载体pGEX-SMYD3。SDS-PAGE及Western blotting鉴定结果表明人SMYD3基因在大肠杆菌中获得了良好的表达。实验成功地构建了SMYD3基因原核表达载体并在大肠杆菌中获得良好表达,为进一步研究SMYD3蛋白功能奠定了基础。     

血管基膜衍生多功能肽在大肠杆菌中的表达及抗肿瘤活性的测定

目的 构建血管基膜衍生多功能肽(VBMDMP)原核表达载体、诱导表达GST-VBMDMP融合蛋白,观察其对Lewis肺癌自发转移瘤模型的影响。方法 人工合成VB-MDMP DNA序列(人源性IgG3上游铰链区连接肽连接的Tumstatin的两个功能区获得性肽基因序列),构建克隆载体PUC19-VBMDMP,亚克隆到pGEX-4T-1原核表达载体上,经测序和酶切分析鉴定获得了未发生移码突变的PGEX-4T-1-VBMDMP融合载体质粒。转化入大肠杆菌后,用 IPTG诱导表达融合蛋白。Glutathione sepharose 4B层析柱纯化蛋白表达产物。采用Lewis肺癌自发转移瘤模型,检测VBMDMP的抗肿瘤作用。结果 成功的构建pUC19-VB-MDMP克隆和pGEX-4T-1-VBMDMP表达载体,在大肠杆菌获得稳定表达,用Glutathione sepharose 4B层析柱获得纯化的GST-VBMDMP融合蛋白。VBMDMP(GST-VBM-DMP 10、6、2 mg·kg~(-1))对小鼠Lewis肺癌原发瘤具有抑制作用(瘤重抑制率分别为95.5％,80.4％,60.05％)。VBMDMP(GST-VBMDMP 10,6,2 mg·kg~(-1))对小鼠Lewis肺癌自发性肺转移具有抑制作用(自发性肺转移瘤结节抑制率分别为94.8％,86.4％,73.9％)。结论 VBM-DMP对小鼠Lewis肺癌原发瘤和肺转移具有抑制作用。     

谷胱甘肽-S-转移酶-人表皮生长因子融合蛋白基因的表达及其产物的生物活性

目的　通过融合蛋白的表达使人表皮生长因子(hEGF)易于纯化。方法　构建基于tac启动子的pGEX 4T-1-hEGF原核表达载体,转化大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ,以异丙基 1 硫代-β-D半乳糖苷诱导,表达谷胱甘肽 S 转移酶(GST) hEGF融合蛋白。结果　表达产物占细菌总蛋白的3 4%。部分为可溶性的,部分形成包涵体。菌体裂解上清液经GlutathioneSepharose 4B纯化后,SDS PAGE电泳出现一条3 2ku蛋白条带,与GST hEGF融合蛋白的计算分子量相符。菌体裂解液中的可溶性GST hEGF的产率为63mg·L- 1 。将其添加到培养的HEK-2 93细胞中,能明显促进该细胞的分裂和生长。结论　成功地构建并表达了GST-hEGF融合蛋白基因,其表达产物GST hEGF显示良好的促细胞增殖活性     

GST-TMPRSS4融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的构建带有谷胱甘肽S-转移酶标签的TMPRSS4载体(GST-TMPRSS4)原核表达载体,并诱导表达。方法以T7-TMPRSS4真核表达载体为模版,用聚合酶链反应(PCR)方法扩增TMPRSS4编码序列,定向插入pGEX-5X-1载体中。构建原核表达质粒进行酶切鉴定并命名为GST-TMPRSS4。融合载体转化BL-21感受态细菌中,经异丙基硫代β-D半乳糖苷(IPTG)大量诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹法。结果成功构建了原核表达质粒GST-TMPRSS4,并用Western blot方法证实了GST-TMPRSS4融合蛋白的表达。结论成功构建了GST-TMPRSS4原核表达载体,并证实了融合蛋白表达,为纯化TMPRSS4及研究其结构与功能提供了研究基础。     

异源性Th表位修饰的CTLA4-Ig—msBlys构建及融合蛋白表达

目的构建异源性Th表位修饰的CTLA4-Ig-msBlys的原核表达质粒,并在EcoliBL21中诱导融合蛋白表达,初步检测蛋白特性。方法采用PCR法从质粒pCMV-sBlys扩增sBlys片段,将与卵清蛋白（ovalbumin,OVA）Th表位重组后的msBlys连接CTLA4-Ig片段,克隆入pGEX-KG原核表达载体,用LB固体培养基抗生素筛选、酶切并经琼脂糖凝胶电泳鉴定;将质粒pGEX—KG-CTI。A4-Ig—msBlys转入E．coliBL21菌株中,实现插入基因的融合表达,用SDS-PAGE和Western-blot检测表达产物。结果pGEX—KG—GTLA4-Ig—msBlys构建正确且最终转人E．coliBL21,得到融合蛋白的表达;CTLA4-Ig-msBlys融合蛋白在E．coli中获得表达,表达产物的相对分子质量同预期值一致。结论成功构建原核表达质粒pGEX-KG-CTLA4-Ig-msBlys,并在E．coliBL21表达CTLA4-Ig-msBlys融合蛋白,为下一步探讨Blys在自身免疫性疾病患者的治疗作用奠定了基础。     

重组人内皮抑素在大肠杆菌中表达及其生物学活性鉴定

目的 利用大肠杆菌原核表达系统表达重组人内皮抑素Endostatin，并对其进行生物学活性鉴定。方法 采用RT—PCR方法从人胚肝中钓取人内皮抑素cDNA，将其克隆入pGEM—T Easy克隆载体中；经全自动序列分析仪测序确证后，将人内皮抑素cDNA亚克隆入原核表达载体pWR450—1，构建含人内皮抑素cDNA的重组质粒；将该重组质粒转化入大肠杆菌TG1中进行诱导表达，表达产物经SDS-PAGE鉴定；表达产物初步纯化复性后以鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验和小鼠伤口愈合实验对其进行生物学活性鉴定。结果 成功获得549bp 人 endostastin基因，测序证实序列正确。经IPTG诱导的重组原核表达质粒表达出重组人内皮抑素的融合蛋白，此蛋白在SDS-PAGE凝胶上显示出一条约75KD的阳性条带。重组人内皮抑素融合蛋白的初纯物在体外能抑制鸡胚尿囊膜血管生成及延长小鼠伤口愈合时间。结论 人内皮抑素融合蛋白在大肠杆菌原核表达系统中高水平表达，并具有抗血管生成活性，为采用抗血管生成方法治疗恶性实体肿瘤的研究奠定了基础。     

线虫抗凝血蛋白AcaNAP7基因克隆、表达及抗凝活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达犬钩虫线虫抗凝血蛋白NAP7(AcaNAP7)成熟蛋白,并鉴定表达产物的抗凝活性。方法根据AcaNAP7的核苷酸序列设计引物,从克隆质粒pUCm-T/AcaNAP7中扩增编码AcaNAP7成熟蛋白的基因;扩增产物经双酶切定向克隆到原核表达载体PET-32a中;构建的重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达;表达产物经镍琼脂糖凝胶FF纯化后,用凝血酶原时间(PT)和活化的部分凝血活酶时间(aPTT)检测体外抗凝血活性。结果克隆了编码AcaNAP7成熟蛋白的基因并构建了重组表达质粒pET-32a/AcaNAP7;在大肠杆菌BL21(DE3)中高效地表达了融合有硫氧还蛋白(Trx)的目的蛋白,产物主要以可溶形式存在;镍琼脂糖凝胶亲和纯化获得了纯度高达92%的目的蛋白;纯化产物能明显延长PT及aPTT,其延长PT比延长aPTT更有效。结论在大肠杆菌中成功表达了AcaNAP7融合蛋白,表达产物具有抗凝活性。该实验为进一步研究AcaNAP7的功能及应用奠定了基础。     

核心蛋白聚糖原核表达体系的构建

目的通过克隆核心蛋白聚糖(decorin,DCN)基因,构建原核表达体系并表达DCN蛋白。方法利用特异引物,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增编码DCN分子的外显子序列,与表达载体pET-21a(+)重组,构建原核表达体系pET-21a(+)-DCN的重组质粒。经双酶切、测序鉴定基因序列,将重组质粒转入E.coliBL21(DE3)中,用IPTG37℃诱导获得DCN融合蛋白。结果克隆了hDCN基因,成功构建了pET-21a(+)-DCN重组质粒,获得了稳定的pET-21a(+)-DCN原核表达体系,并得到了纯化的融合蛋白。结论建立了pET-21a(+)-DCN稳定的原核表达体系,表达并纯化了DCN。     

抗AFP重链可变区单域抗体融合蛋白的构建、表达及初步鉴定

目的 构建抗甲胎蛋白(AFP)重链可变区(VH)单域抗体融合蛋白基因在大肠杆菌中的表达,并初步鉴定表达产物的活性.方法 从已构建的抗AFP单链抗体(ScFv)的载体中,经PCR扩增出VH 单域抗体基因,再克隆到融合蛋白表达载体pET32a( )中进行表达;用SDS-PAGE及Western-blot鉴定表达产物;并通过竞争抑制ELISA分析TrxA-VH融合蛋白的结合活性;细胞免疫组化染色分析其内化及结合情况.结果 VH 单域抗体基因全长339 bp,将其克隆到pET32a( )中,转化大肠杆菌可获得高效表达,Western-blot证实在相应分子质量处,有TrxA-VH融合蛋白的显色条带.经初步纯化和复性后,获得抗AFP的VH单域抗体融合蛋白.竞争抑制ELISA及细胞免疫组化证明,表达产物具有与AFP特异结合的活性.结论 成功构建了抗AFP的VH单域抗体融合蛋白,为临床的应用研究奠定了基础.     

大鼠谷氨酸受体2抗体制备及其与Caspase 3相互作用分析

目的克隆大鼠谷氨酸受体2(GluR2)基因片段,构建重组表达质粒,在原核系统诱导表达,制备多克隆抗体,分析GluR2与caspase3的相互作用。方法从大鼠脑组织提取总RNA,实时聚合酶链反应(RT-PCR)扩增GluR2基因抗原性较强的一段,定向克隆入表达载体pGEX-4T1,构建GST-GluR2融合蛋白表达质粒,转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达GluR2蛋白。用SDS-PAGE方法分离目的蛋白,免疫家兔,制备抗血清。用Western Blot方法鉴定抗体的特异性,用Co-IP实验分析GluR2和caspase3的相互作用。结果SDS-PAGE显示GST-GluR2融合蛋白诱导表达成功;Western Blot显示制备的多克隆抗体具有较高的特异性;Co-IP显示大鼠脑组织中GluR2和caspase3存在相互作用。结论成功获得兔抗鼠GluR2特异性抗血清;脑组织中GluR2和caspase3存在相互作用,为进一步研究神经毒作用导致GluR2下调的分子机制奠定基础。     

IL-13融合蛋白表达载体与非融合蛋白表达载体的构建与比较

采用RT－PCR技术直接从激活的健康人外周血单个核细胞中扩增得到hIL－13的基因片段，通过DNA重组技术分别将其插入到含有PRPL启动子的高效表达载体pBV220及含tac启动子、lac1阻遏蛋白基因及凝血酶识别位点的融合蛋白表达载体pGEX－4T－2中，成功地构建了hIL－13的原核非融含蛋白表达菌株hIL－13－PBV220／DHS5a及融合蛋白表达菌株hIL－13－PGEX－4T－2／TG1，分别经42℃热诱导及异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）化学诱导后，SDS－PAGE结果表明IL－13仅以GST融合蛋白的形式在E.coli中获得了表达，表达量约占菌体蛋白总量的10％～30％。IL-13的蛋白单体在原核细胞中表达量很低。     

pET15b-pep-1-p27mt的构建、表达及意义

构建细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)PEP-1和细胞周期抑制蛋白p27mt的重组体,并在大肠杆菌中表达。将已构建的表达细胞周期抑制蛋白p27mt的基因,克隆入pET15b-pep-1原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内,以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定。结果:成功地构建PEP-1-p27mt融合蛋白原核表达载体,并在IPTG诱导下获得特异性的表达。PEP-1-p27mt融合蛋白表达载体的构建,为体内应用细胞周期抑制蛋白诱导肿瘤细胞凋亡提供了理论基础。     

Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白 ROP16的基因克隆表达及生物信息学分析

目的：构建弓形虫Chinese 1基因型TgCtWh3（以后均简称Wh3）株棒状体蛋白（ rhoptry protein ,ROPs）16的原核和真核重组表达质粒及其3D结构。方法参照ROP16序列分别设计引物,采用PCR从弓形虫Chinese 1基因型Wh3株基因组DNA中扩增出编码ROP16的基因片段,克隆至pMD18-T载体;经PCR及测序分析鉴定;阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2,分别转化大肠杆菌BL21和DH5α,PCR和酶切鉴定转化菌落插入的序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达;将构建的真核重组质粒经脂质体转染293T细胞,观察其在细胞中表达;采用生物信息学方法分析构建了蛋白的3 D结构。结果各组均PCR扩增出约2．1 kb ROP16基因的特异片段,序列检测结果均正确;分别亚克隆到原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2中,成功构建了Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白ROP16的原核表达质粒和真核表达质粒;原核表达质粒在大肠杆菌中表达了ROP16的融合蛋白;真核表达质粒在293T细胞中成功表达,成功构建出ROP16基因的3D结构图。结论以pET-28a和pEGFP-C2为载体,分别成功构建并表达了ROP16的原核和真核重组质粒,并构建出其3D结构图。     

谷胱甘肽-S转移酶-中期因子融合蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

目的 构建谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和中期因子(MK)融合蛋白的原核表达质粒,并表达和纯化蛋白,制备多克隆抗体.方法 通过RT-PCR技术从人胃癌组织中扩增入MK编码序列,克隆入表达载体pGEX-1λT中,获得表达质粒pGEX-MK,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中经IPTG诱导表达,通过亲和层析纯化表达的GST-MK融合蛋白,并以重组蛋白免疫兔子.结果 成功构建了GST-MK融合蛋白的原核表达载体,经诱导表达纯化得到GST-MK融合蛋白.免疫兔子后取多抗血清以间接ELISA检测效价达1∶64 000,Western blotting分析显示多克隆抗血清对MK蛋白特异结合.结论 MK在大肠杆菌中成功表达及其多克隆抗体的获得,为研究MK生物功能奠定了基础.     

鲶鱼抗菌肽Parasin Ⅰ原核表达载体的构建与鉴定

目的 构建鲶鱼抗菌肽(Parasin Ⅰ)原核表达载体.方法 根据Parasin Ⅰ氨基酸序列及大肠埃希菌偏爱密码原则设计并合成Parasin Ⅰ基因寡核苷酸片段,将其与表达载pGEX-4T-1经限制性核酸内切酶双酶切后连接,转化至大肠杆菌BL21,挑取阳性菌落,抽提重组质粒并鉴定,IPTG诱导表达融合蛋白,亲和层析纯...     

分泌人共刺激分子B7-2的重组卡介苗的构建及表达与鉴定

目的构建分泌表达人共刺激分子B7-2（hB7-2）的重组卡介苗（rBCG）。方法采用聚合酶链反应（PCR）以含hB7-2的质粒为模板扩增出hB7-2活性序列,利用基因重组技术插入pYL-MCS质粒构建出分泌型卡介苗穿梭表达载体pYL—hB7-2。用电穿孔方法将该质粒转入卡介苗得到rBCG,利用PCR扩增和测序检测其hB7-2的DNA表达,分别SDS-PAGE和ELISA法测定rBCG上清液中和菌内hB7-2蛋白。结果酶切鉴定、PCR扩增和DNA测序均表明rBCG含有的hB7-2DNA与文献结果一致,SDS—PAGE检测出有相应蛋白表达,ELISA法测定rBCG上清液中分泌的B7-2蛋白为3．8U／ml。结论构建的重组BCG可以分泌表达人共刺激分子hB7-2,能够提供激活免疫反应的共刺激信号,将会成为膀胱肿瘤免疫治疗的一种新型方法。     

波形蛋白基因的构建、表达及鉴定

文章进行波形蛋白(VIM)基因重组质粒的构建,并进行表达与鉴定,为开辟新的肝癌诊断方法奠定基础。从人宫颈癌细胞(HELA)中提取总RNA并采用PR-PCR及PCR技术克隆VIM基因,经酶切连接等构建带有GST标签的PGEX-4T-1-VIM重组表达质粒,在大肠杆菌DH5α菌中扩增重组质粒,并在BL21菌中进行诱导表达,通过SDS-PAGE及Western blotting等进行鉴定。重组及表达蛋白Vimentin的融合蛋白,为建立一种新的肝癌早期诊断方法奠定基础。