IL-2重组逆转录病毒载体的构建及介导的肝癌特异性基因治疗研究

将小鼠白细胞介素２（ｍＩＬ－２）ｃＤＮＡ全序列克隆到逆转录病毒载体ｐＭＮＳＭ的ＰＬ位点，使其转录受ＳＶ４０早期启动子驱动，构建ｐＭＮＳＭ－ＳＶ４０－ｍＩＬ－２。用小鼠白蛋白增强子／启动子（Ａｌｂｅ／ｐ）置换ｐＭＮＳＭ－ＳＶ４０－ｍＩＬ－２中ＳＶ４０启动子，构建ｐＭＮＳＭ－Ａｌｂｅ／ｐ－ｍＩＬ－２。经酶切鉴定符合要求。将重组体用磷酸钙共沉淀法导人逆转录病毒包装细胞ｐＡ３１７中，用所得的重组病毒在８μｇ／ｍｌＰｏｌｙｂｒｅｎｅ存在条件下体外感染小鼠肝癌细胞（ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ、ＢＮＬＩＭＥ）、黑色素瘤…     

逆转录病毒介导的肿瘤坏死因子肝癌特异性基因治疗实验研究

为探讨肿瘤坏死因子基因对肝癌的治疗作用，分别构建ＳＶ４０早期启动子和白蛋白增强子／启动子调控小鼠肿瘤坏死因子基因的逆转录病毒载体ＭＮＳＴ和ＭＮＡＴ，以及ＳＶ４０早期启动子和人甲胎蛋白增强子／ＳＶ４０启动子调控的逆转录病毒载体ＬＴＳＮ和ＬＴＡＳＮ。构建物导入ＰＡ３１７细胞中包装成重组病毒，感染肿瘤细胞，证明白蛋白增强子／启动子和甲胎蛋白增强子均能使肿瘤坏死因子基因在肝癌细胞中高效特异表达。ＭＮＡＴ病毒和ＰＡ３１７／ＭＮＡＴ产病毒细胞ｉｎｖｉｖｏ法基因治疗有特异抗肝癌效果。提示组织特征蛋白“持家基因”转录调控序列在肿瘤组织特异性免疫基因治疗研究中有重要意义。     

逆转录病毒载体介导的人白细胞介素10在大鼠心肌细胞的表达

目的：建立一个在大鼠心肌细胞表达人白细胞介素１０（ＨｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１０,ｈＩＬ１０）的重组逆转录病毒载体基因转移系统,为下一步的研究工作做准备。方法：将构建的表达人白细胞介素１０的逆转录病毒重组体ｐＬＸ（ｈＩＬ１０）ＳＮ经ＰＡ３１７细胞包装,Ｇ４１８筛选,ＮＩＨ３Ｔ３细胞进行病毒滴度测定,选滴度最高的克隆（６×１０５ＣＦＵ／ｍｌ）作为感染大鼠心肌细胞的感染细胞;用重组逆转录病毒感染大鼠心肌细胞,应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）及反转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）检测转染大鼠心肌细胞ＤＮＡ及ｍＲＮＡ,应用ＥＬＩＳＡ测定ｈＩＬ１０在心肌细胞的表达。结果：外源性ｈＩＬ１０基因已整合到心肌细胞染色体ＤＮＡ并有效地转录和翻译,表达水平最高达１７５５ｎｇ／（１０６ｃｅｌｓ·２４ｈ）。结论：外源性ｈＩＬ１０基因可以转移到大鼠心肌细胞并稳定表达,为今后研究ｈＩＬ１０的作用机制及在治疗疾病中的应用打下了基础。     

逆转录病毒载体介导IL-2基因转染人肝细胞的建立及其部分生物学性状

目的　　建立ｈＩＬ－２基因修饰的人肝细胞株并探讨对其生物学活性的影响。　方法应用重组逆转录病毒载体ｐＬＮＣＩＬ－２，将ｈＩＬ－２基因导入人肝细胞系Ｌ－０２，观察其形态及克隆形成率的变化，检测细胞培养上清中ｈＩＬ－２的含量，以及进行转染细胞基因组ＤＮＡ　ＮｅｏＲ基因片段的ＰＣＲ扩增。结果Ｌ－０２／ＩＬ－２细胞的增殖速度和克隆形成率低于Ｌ－０２／Ｎｅｏ细胞和Ｌ－０２细胞。Ｌ－０２／ＩＬ－２细胞的培养液中ｈＩＬ－２的含量达３２　０００　ｐｇ／１０６ｃｅｌｌｓ·ｄ，并可持续表达１０　ｗｋ以上。从Ｌ－０２／ＩＬ－２细胞和Ｌ－０２／Ｎｅｏ细胞基因组ＤＮＡ中，均扩增到ＮｅｏＲ基因片段（７９０　ｂｐ）。结论应用重组逆转录病毒载体成功地建立了Ｌ－０２／ＩＬ－２细胞株，为进一步进行肝细胞移植动物实验奠定了基础。     

γ干扰素cDNA在胃癌细胞中的表达研究

实验用构建的正向连入人ＩＦＮ－γｃＤＮＡ片段的重组表达载体ｐＭＡＭｎｅｏ－γ－ＩＦＮ，以Ｌｉｐｏ－ｆｅｃｔｉｎ介导法将重组载体转染入胃癌细胞７９０１中，挑选出Ｇ４１８抗性克隆，地塞米松诱导其分泌ＩＦｔＩ－γ经活性测定筛选出高分泌ＩＦＮ－γ的细胞株ＲＰＭ７９０１－７（１７２５ＩＵ／ｍｌ），Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实ＩＦＮ－γｃＤＮＡ确已导入该细胞株中。体外培养过程中，ＲｐＭ７９０１细胞与转染了对照质粒ｐＭＡＭｎｅｏ的细胞ｐＭ７９０１及野生型７９０１细胞在形态，生长能力等方面无明显差别，而经地塞米松诱导的ＲpＭ７９０１细胞则与之有显著差异。裸鼠体内接种显示，经诱导的ＲｐＭ７９０１细胞在致瘤性上显著低于野生型７９０１细胞及ｐＭ７９０１细胞。经基因转移后可高分泌ＩＦＮ－γ的肿瘤细胞为肿瘤的基因治疗提供了资料。     

人IFN—γcDNA逆转录病毒载体的构建及其在Lewis肺癌细胞的稳…

应用分子克隆技术构建了含８４３ｂｐ的全长人ＩＦＮ－γｃＤＮＡ的逆转录病毒表达载体Ｎ２／ＩＦＮ，采用磷酸钙共沉淀方法转染包装细胞ΨＣＲＥ和ΨＣＲＩＰ，并能得到较高滴度的含病毒颗粒上清。然后应用ΨＣＲＩＰ细胞培养上清的复制缺陷性病毒颗粒感染Ｌｅｗｉｓ肺癌细胞（ＬＬＣ），经过Ｇ４１８筛选克隆得到了一株能稳定分泌ＩＦＮ（６４００Ｕ／ｍｌ）的克隆，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹证实ＩＦＮ－γ基因已插入ＬＬＣ基因组。结     

复制缺陷型人IL-2重组腺病毒的制备与鉴定

目的将人ＩＬ－２的重组腺病毒载体与Ａｄ５腺病毒ＤＮＡ末端肽复合物同源重组，高效制备人ＩＬ－２的复制缺陷型重组腺病毒，并进行体外表达和活性检测。方法将含全部编码序列的人ＩＬ－２ｃＤＮＡ置于真核表达载体ｐＣＩｃｃ的ＣＭＶ启动子下游，切出含ＣＭＶ启动子、人ＩＬ－２ｃＤＮＡ和ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ信号肽序列的ＣｌａＩ片段，插入Ｅ１区替代的腺病毒载体ｐＡｘｌｏｗ，选择左向转录的人ＩＬ－２重组腺病毒载体ｐＡｘｌｃｗ．ＣＩｈＩＬ－２与经ＥｃｏＴ２２Ⅰ酶切的Ａｄ５腺病毒ＤＮＡ－末端肽复合物共转染２９３细胞；通过同源重组获得人ＩＬ－２的复制缺陷型重组腺病毒；体外转染人宫颈癌ＨｅＬａ细胞、人Ｔ细胞淋巴瘤Ｈｕｔ７８细胞和原代人皮肤成纤维细胞。结果扩增到的病毒滴度达２．１×１０９ＰＦＵ／ｍｌ；体外转染的人肿瘤细胞均检测到ＩＬ－２的表达（４００～２６００Ｕ／１０６细胞／２４小时）。结论所制备的复制缺陷型重组腺病毒能有效介导人ＩＬ－２的基因转移，可望用于肿瘤基因治疗的临床研究。     

IL-4基因转染诱导肝母细胞瘤分化及抑制端粒酶活性

目的 研究人白细胞介素４（ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－４,ｈＩＬ－４）基因转染对肝母细胞瘤细胞的诱导分化和对端粒酶活性的影响。方法 以逆转录病毒载体（ＰＬ－ＩＬ－４－ＳＮ）将ｈＩＬ－４基因导入人肝母细胞瘤细胞系Ｈｅｐ Ｇ２细胞。台盼蓝拒梁,放射免疫测定,流式细胞仪细胞周期分析,原位杂交,ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ等方法检测基因转染后细胞形态,甲胎蛋白合成,原癌基因的表达及端粒酶活性变化。     

人血小板生成素cDNA转染COS-7细胞及表达产物对小鼠骨髓巨核细胞的作用

将克隆全长１．１ｋｂ血小板生成素（ＴＰＯ）ｃＤＮＡ构建重组ＰＣＩｎｅｏＴＰＯ表达载体，利用ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ介导转染ＣＯＳ－７细胞中，对阳性克隆ＣＯＳ－７细胞的ＤＮＡ、ｍＲＮＡ和培养上清分别进行ＰＣＲ扩增Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ、斑点杂交和ＴＰＯ夹心ＥＬＩＳＡ检测，观察表达产物对小鼠骨髓巨核细胞的作用。结果表明：全长１．１ｋｂＴＰＯｃＤＮＡ转染ＣＯＳ－７细胞获得表达，最高表达量可达４８．２８Ｕ／ｍｌ，其产物使骨髓巨核细胞集落形成单位（ＣＦＵ－ＭＫ）集落数增加４倍，巨核细胞增大至４２．１０±６．７０μｍ（Ｐ＜０．０１）；动态观察骨髓ＣＦＵ－ＭＫ集落数于实验第８天达最高峰，约持续２ｄ，第１０天后开始下降。提示ＴＰＯｃＤＮＡ转染ＣＯＳ－７细胞表达产物对骨髓巨核细胞生成有刺激活性     

T细胞产生的一种新型细胞因子：人IL—17

从ＣＤ４＾＋Ｔ细胞文库中克隆出人ＩＬ－１７（ｈＩＬ－１７）。外周血ＣＤ４＾＋Ｔ细胞在刺激状况下表达高水平的ｈＩＬ－１７。ｈＩＬ－１７基因由哺乳动物表达载体ｐＤＣ４０９携带转染ＣＤ１／ＥＢＮＡ细胞后，可表达为糖基化及非糖基化两种形式。ｈＩＬ－１７Ｆｃ融合蛋白及转染ｈＩＬ－１７的细胞培养上清可诱导产生ＩＬ－６和ＩＬ－８，并且还可促进人或纤维细胞表面细胞间粘附分子－１（ＩＣＡＭ－１）的表达。     

突变型人白细胞介素18 cDNA的克隆

目的:获得人白细胞介素18 cDNA。方法:从1名健康献血者的外周血单个核细胞(PBMC)中提取总RNA,通过PT-PCR扩增出人白介素18(hIL-18)的cDNA,与PUCmT载体连接,构成重组质粒,进行测序及同源性分析。结果:已获得hIL-18的编码序列,且与Ushio等报道的序列相比存在3处有意义突变。结论:克隆了突变型hIL-18 cDNA。     

人白细胞介素18cDNA编码区存在基因变异

目的：为了获得中国人白细胞介素１８ｃＤＮＡ。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ方法从中国人７种组织标本中获取ＩＬ－１８ｃＤＮＡ。结果：７种组织中有６种组织标本ＩＬ－１８ｃＤＮＡ序列与报道序列存在有意义突变。结论：ＩＬ－１８基因在人体多种组织表达，且存在多态性。     

Retrovirus-mediated gene transfer into human hematopoietic stem cells

 Human hematopoietic stem cells genetically modified by retroviral-mediated gene transfer may offer new treatment options for patients with genetic disease. The potential of gene-modified hematopoietic stem cells as vehicles for gene delivery was first illustrated by the demonstration that hematopoietic systems of lethally irradiated mice can be reconstituted with retroviral vector transduced syngeneic bone marrow, and that these cells can in turn provide genetically marked progeny which persist in blood and marrow over extended time periods [1–4]. In contrast, hematopoietic stem cells from large animals prove difficult to transduce with retroviral vectors and are consequently less likely to function as vehicles for long-term gene therapy. Indeed, clinically relevant levels of gene transfer into large animal and human hematopoietic stem cells has not been widely achieved. The need for improved retroviral vector systems and for understanding the biology of hematopoietic stem cell gene transfer continue to fuel intense research activity. Preliminary results from human stem cell gene marking and gene therapy trials currently underway are encouraging. This contribution reviews the underlying concepts relevant to retroviral-mediated gene transfer into hematopoietic stem cells. We survey the evolution of approaches for gene transfer into hematopoietic stem cells, from murine and large animal models to the first human clinical trials. Finally, we discuss new strategies which are currently being pursued. Received: 12 March 1997 / Accepted: 21 July 1997     

带绿色荧光蛋白标签的人era真核表达载体的构建及人Era对细胞形态和细胞周期的影响

目的:构建人era真核表达载体并初步研究这一人类新基因对体外培养细胞形态和细胞周期的作用。方法:构建带绿色荧光蛋白(EGFP)标签的人era真核表达载体,转染体外培养细胞NIH3T3,用荧光显微镜观测和流式细胞仪进行分析。结果:无论EGFP融合于人Era的C端或N端,融合蛋白均表达于细胞浆接近核膜处,细胞形态无明显变化,细胞周期检测S期细胞所占百分数降低。结论:人era可能参与细胞周期调控,为阐明人era的功能提供了资料。     

端粒酶基因在人肿瘤组织中的表达

目的 探讨端粒酶基因表达与肿瘤恶性表型及其与端粒酶活性的关系;评价端粒酶基因表达检测在肿瘤诊断中的价值。方法 用原位杂交的方法检测端粒酶基因ｈＴＲ和ｈＴＲＴ在７８例人觉癌组织,２０例癌前病变,２８例良性病变中的表达及分布情况。结果 ７８例癌中ｈＴＲ阳性率为８５％（６６／７８）,ｈＴＲＴ阳性率为８２％（６４／７８）;在癌旁组织中ｈＴＲ、ｈＴＲＴ的表达阳性率分别为３％（２／７８）、５％（４／７８）;２     

人胚胎脐血间质干细胞生物学特性研究

目的:研究人中期胚胎脐血间质干细胞生物学特性,探讨其在自体宫内基因转移/治疗(IUGT)领域的应用前景。方法: 采用L-DMEM完全培养液培养中期胚胎脐血间质干细胞(MSC);流式细胞仪技术检测细胞表面标记;地塞米松/胰岛素等作为脂肪细胞诱导液,β-甘油磷酸钠/抗坏血酸等作为成骨细胞诱导液分别诱导细胞分化;将携带有绿色荧光蛋白的重组腺病毒转染MSC,荧光显微镜下检测MSC表达转基因特性;F344新生大鼠肝内注射MSC,免疫荧光检测6周后不同组织器官中人MSC存在;非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷性小鼠(NOD/SCID)皮下注射MSC,病理切片检测第30 d细胞体内成瘤性。 结果:3 mL人中期胚胎脐血可以分离、培养出MSC,细胞均一地表达CD29、CD44、CD59、CD105、CD166,不表达CD34、CD45、CD80、CD86、CD42a、HLA-DR分子,体外培养中具有成脂、成骨能力;细胞表达转基因产物绿色荧光蛋白阳性率高达56.32%±3.28%;在新生大鼠体内,人中期胚胎脐血来源的MSC能向多个不同组织器官迁移,在NOD/SCID小鼠内不具有成瘤性。结论:人中期胚胎脐血MSC适合中、晚期胚胎自体IUGT靶细胞。     

人胎盘血间质干细胞分离培养

目的：分离培养人胎盘血间质干细胞（hMSC），为hMSC探寻新来源。方法：采用羟乙基淀粉（HES）方法分离、富集胎盘血有核细胞；DMEM培养液体外培养、纯化、扩增hMSC；流式细胞仪检测细胞表面标记；地塞米松、IBMX、胰岛素和吲哚美辛定向诱导hMSC样细胞向脂肪细胞分化。结果：胎盘血来源有核细胞,在DMEM体外培养条件下，生长出具有塑料粘附特性的梭形细胞，阳性获得率29.17%（7/24），该细胞传代培养达6个月以上；流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD59、CD90、CD105、CD166表达阳性，CD14、CD34、CD45、CD80、CD86表达阴性；加入脂肪细胞诱导剂，细胞在形态上向脂肪细胞转化，胞内出现脂滴、脂泡，油红O阳性。结论：人胎盘血可以分离培养出hMSC，是hMSC的重要来源。     

重组人胰岛素原基因在培养的大鼠肝癌细胞中基因转移和表达

目的： 探讨含有葡萄糖反应元件的重组人胰岛素原基因在培养的大鼠肝癌细胞中基因转移及表达情况。方法: 将含有3点突变及2点突变的人胰岛素原基因转染至大鼠肝癌CBRH7919细胞，测定不同葡萄糖浓度下瞬时及用G418筛选稳定表达后胰岛素的分泌量，并检测基因整合情况。结果： ① 转染后38 h及1个月，不同葡萄糖浓度下，含有3点突变胰岛素原基因的肝癌细胞胰岛素分泌量不同; 含有2点突变胰岛素原基因的肝癌细胞，只有在25 mmol/L的葡萄糖浓度培养液中，才能测出胰岛素分泌量；② 阳性克隆细胞基因组扩增出特异目的电泳条带，未转染细胞无此条带。结论: ①用逆转录病毒为载体能将重组人胰岛素原基因转染到肝癌细胞中,并使之稳定表达。② 所构建的重组人胰岛素原基因能指导靶细胞随葡萄糖浓度的变化调节胰岛素分泌。     

人类肿瘤表达细胞因子基因的临床意义

目的:探讨IL-2,IL-4,IL-6,IL-10,IL-13和IFNγ在肿瘤发生发展及治疗诊断中作用。方法:用RTPCR技术或RNA点杂交技术检测183份肿瘤细胞或肿瘤组织中上述6种细胞因子的基因表达状况。结果:在183份不同的肿瘤细胞或组织中Th2类细胞因子的表达显著增加,其中IL-4,IL-6,IL-10和IL-13的表达率达65％,70.5％,83.6％和61.7％,而Th1类细胞因子IFNγ和IL-2的表达率仅达12.6％和22.9％。结论:Th1/Th2漂移与肿瘤的发生发展密切相关,有可能造成机体的免疫抑制,有利于肿瘤细胞的免疫逃逸。