TWEAK蛋白对肝癌细胞增殖的影响

目的 观察TWEAK蛋白对肝癌细胞系增殖的影响,探讨TWEAK对肝癌细胞增殖的作用.方法构建PAVU6-TWEAK siRNA干涉质粒,转染HepG2和QGY7703肝癌细胞株,MTT法检测抑制TWEAK蛋白表达对肝癌细胞增殖的影响,并于培养体系中加入TWEAK蛋白,检测肝癌细胞增殖活性.结果成功构建PAVU6-TWEAK siRNA干涉质粒,转化肝癌细胞后肝癌细胞增殖受抑.肝癌培养体系中加入TWEAK蛋白后,肝癌细胞增殖活性有所增强.结论 TWEAK蛋白可促进肝癌细胞的增殖活性,抑制TWEAK表达,一定程度上可抑制肝癌细胞增殖.     

preS2反义RNA肝癌特异性表达载体的构建及相关特性研究

目的 构建针对preS2基因的肝癌特异性反义RNA表达载体，并对其特异性和有效性进行研究。方法 PCR扩增preS2(3203—340)基因，克隆至含甲胎蛋白启动子的EB病毒表达载体pEBAF，构建反义RNA表达载体pEBAF-as—preS2。脂质体转染肝癌细胞和ECV304细胞，3d后Northern blot检测preS2 mRNA的表达，ELISA检测HBV抗原，荧光定量PCR检测HBV DNA。结果序列分析表明，pEBAF-as-preS2构建成功，Northern blot证实反义RNA仅在AFP阳性的肝癌细胞中表达，pEBAF-as-preS2转染3d后，可显著抑制HepG2．2．15细胞HBV复制和抗原表达，对HBsAg、HBeAg表达的抑制率分别为33．4％和41．5％；对HBV复制抑制率为86％。结论 反义RNA表达载体pEBAF-as-preS2仅在肝癌细胞中特异表达、并可有效抑制HBV，有良好的开发应用前景。     

RNA结合蛋白HuR的研究进展及其在肝细胞癌发生发展中的作用

<正>转录后事件,特别是 RNA翻转和翻译的改变,是哺乳动物细胞在应激反应中控制基因表达的主要机制。mRNA稳定性和翻译的变化主要是通过特定mRNA序列(顺式元件)与两种主要的反式作用因子——RNA结合蛋白(RNA-binding protein,RBP)和微小RNA(microRNA,miRNA)相互作用而启动的过程来控制的^[1]。RBP参与RNA代谢的各个环节,包括RNA剪接、多聚腺苷酸序列编辑、RNA转移、维持RNA的稳定和降解、细胞内定位和翻译调控等。     

绿色荧光蛋白逆转录病毒载体的构建及其表达

目的：实现绿色荧光蛋白（GFP）报告基因在组织工程化细胞中的高效、稳定、长久表达。方法：构建重组逆转录病毒表达载体RV－GFP，通过PT67包装细胞克隆，经G418筛选、扩增，获得大量含GFP基因的病毒液，并直接感染靶细胞。结果：转染细胞于48h后，在荧光显微镜蓝光激发波长下，可发出明亮的绿色荧光，转染率达20％－50％。感染靶细胞内GFP的有效表达可持续2个月。结论：构建的重组逆转录病毒GFP载体，可作为组织工程化细胞标记，用于细胞动态研究，其方法简便、灵敏、可靠。     

RNA结合蛋白对大鼠胰岛β细胞株RINm凋亡的保护作用

目的:探讨RNA结合蛋白Tristetraprolin(TTP)对大鼠胰岛β细胞RINm凋亡的影响。方法:取培养增殖期的NR8383巨噬细胞,分别转染不同载体,设为空载体组(pcDNA 3.1组)、TTP过表达载体组(pcDNA 3.1-TTP组)、TTP抑制载体组(si-TTP组)、阴性对照组(si-NC组)和空白对照组(NC组),于转染后12h,更换新鲜培养基,继续培养至36h,取各组巨噬细胞和部分上清,采用RT-qPCR和Western bloting检测其TTP和白细胞介素-6(IL-6)mRNA及其蛋白表达水平。取各组剩余上清液加入体外培养大鼠胰岛β细胞株,形成与前述对应的pcDNA 3.1+RINm组、pcDNA 3.1-TTP+RINm组、si-TTP+RINm组、si-NC+RINm组和NC+RINm组,再培养24h,采用流式细胞术检测各组胰岛RINm细胞凋亡率。结果:(1)pcDNA 3.1-TTP组TTP mRNA和蛋白水平较pcDNA 3.1组明显升高(P<0.01),IL-6 mRNA和蛋白水平较pcDNA 3.1组明显降低(P<0.01);si-TTP组TTP mRNA和蛋白水平较pcDNA 3.1组显著降低(P<0.01),IL-6 mRNA和蛋白水平较pcDNA 3.1组显著升高(P<0.01)。pcDNA 3.1组、si-NC组和NC组间TTP、IL-6 mRNA和蛋白水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。(2)pcDNA 3.1-TTP+RINm组胰岛RINm细胞凋亡率较pcDNA 3.1+RINm组明显降低(P<0.01);si-TTP+RINm组胰岛RINm细胞凋亡率较pcDNA 3.1+RINm组明显升高(P<0.01)。pcDNA 3.1+RINm组、si-NC+RINm组和NC+RINm组间胰岛RINm细胞凋亡率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:过表达TTP可能通过抑制巨噬细胞分泌炎性因子,进而抑制胰岛β细胞凋亡。     

RNA干扰SHBG基因表达对滋养细胞增殖的影响

目的探讨RNA干扰技术抑制SHBG基因表达对滋养细胞增殖的影响。方法在体外通过RNA干扰技术,将SHBG si RNA转染至原代培养的人绒毛滋养细胞中,MTT法检测滋养细胞增殖情况。结果成功将SHBG si RNA转染人绒毛滋养细胞;转染后24、48、72h,SHBG si RNA转染组的细胞生长速度显著减缓,正常对照组(未经转染的细胞)、空白对照组(只转染脂质体,无si RNA)和阴性对照组(转染非特异性si RNA)的组间比较差异均无统计学意义(P0.05);转染组(SHBG si RNA-I,SHBG si RNA-II,SHBG si RNA-III)之间差异均无统计学意义(P0.05),各转染组分别与各对照组的组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论 si RNA可以有效干扰人绒毛滋养细胞SHBG基因的表达,抑制滋养细胞增殖的增殖活性。     

Ad-siRNA-FoxO1腺病毒载体的构建及对人肝癌细胞系增殖的影响

目的 利用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制肝癌细胞系中FoxO1基因的表达,观察其受抑制后对细胞增殖能力的影响.方法 设计针对FoxO1基因的siRNA,构建于腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,转染包装细胞293细胞,获得含Ad-siRNA-FoxO1的重组腺病毒.体外感染人肝癌细胞系HepG2,Western印迹检测Ad-siRNA-FoxO1对FoxO1蛋白的抑制效率.与PEPCK.luc共转染HepG2细胞,检测FoxO1表达水平对PEPCK启动子活性的影响,并观察FoxO1表达水平的改变对肝癌细胞系增殖的影响.结果 成功构建3个针对FoxO1的siR-NA重组腺病毒载体,重组腺病毒均能显著抑制HepG2细胞中FoxO1蛋白的表达,并抑制PEPCK启动子的活性和显著促进细胞增殖.结论 肝癌细胞系中FoxO1参与了细胞增殖的调节.     

慢病毒载体介导RNA结合蛋白-5对肺腺癌细胞系H1299的增殖和凋亡的影响

目的 探讨慢病毒载体介导RNA结合蛋白-5（QKI-5）对肺腺癌细胞凋亡的影响。方法 应用GV358（过表达）和GV248（抑制表达）载体分别构建针对QKI-5基因的慢病毒过表达载体和抑制表达载体,转染293T细胞产生慢病毒颗粒,收集并测定慢病毒滴度。将经测序鉴定的QKI-5过表达的慢病毒或抑制表达的慢病毒转染到肺腺癌细胞H1299,Real-time PCR检测QKI-5 mRNA表达,集落形成实验检测H1299细胞增殖情况,膜联蛋白V（annexin V）、碘化丙啶（PI）检测H1299细胞凋亡情况,Western blotting检测促凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-8表达。结果 成功构建QKI-5过表达慢病毒载体和抑制表达慢病毒载体,与对照组比较,QKI-5过表达后,QKI-5 mRNA表达增加,细胞集落形成减少,肺腺癌细胞早期凋亡增加,促凋亡蛋白Caspase-8表达增加;QKI-5抑制表达后,QKI-5 mRNA表达降低,细胞集落形成增加,但肺腺癌细胞凋亡无明显变化,然而促凋亡蛋白Caspase-8表达减少。结论 慢病毒介导 QKI-5抑制增殖,可能通过Caspase-8促进肺腺癌细胞系H1299的凋亡。     

DHRS4反义RNA结合蛋白的高通量检测与分析

目的 DHRS4是细胞内NADP(H)依赖性视黄醇脱氢/还原酶家族成员4的编码基因。与人类DHRS4基因以头对头形式存在的反义转录本AS1DHRS4,可以调控DHRS4基因的转录。本研究高通量检测分析DHRS4反义RNA结合的蛋白以探讨DHRS4反义转录本调控正义基因表达的作用机制。方法采用甲醛交联细胞内的核酸-蛋白复合物,然后通过生物素标记的奇数组和偶数组寡核苷酸作为探针pull-down AS1DHRS4结合的蛋白,LCMS/MS鉴定后数据库比对分析DHRS4反义RNA结合的蛋白。结果奇数组和偶数组探针pull-down后分别鉴定得到650种和508种蛋白,两组探针检测的共同蛋白434种。大部分蛋白为结合蛋白并与RNA的加工和修饰相关。结论 DHRS4反义RNA结合的蛋白的检测和分析为今后进一步研究反义RNA功能和机制提供了线索和基础。     

丙型肝炎病毒N′-核心蛋白RNA结合区的定位

目的 对丙型肝炎病毒核心蛋白的RNA结合区进行详细定位，为制备缺失RNA结合活性突变体做准备。方法 构建GST融合丙型肝炎病毒核心蛋白不同区域片段表达质粒，在大肠杆菌中表达相应蛋白并用glutathione sepharose 4B进行纯化，利用二次电泳法检测RNA的结合活性，利用时相差电泳法比较不同区域RNA结合活性的强弱。结果 核心蛋白第1－132位氨基酸（AA）之间的片段得到了良好的表达和纯化，表达的蛋白经Western blot得到确认。二次电泳后的放射自显影结果显示，第1－10AA、19－45AA、80－132AA片段无RNA结合活性，而含有10－16AA，45－80AA的片段可结合单链和双链RNA。1－29AA与38－90AA2个片段对RNA的结合强度基本相同。结论 丙型肝炎核心蛋白中存在2个RNA结合区，分别定位于10－16AA及45－80AA。2个结合区都具有较强的RNA结合活性。制备RNA结合活性缺陷突变体须同时对2个结合区进行突变。     

乙醇刺激HepG2细胞分泌VASN蛋白的生物学功能研究

目的：探究乙醇对HepG2细胞VASN蛋白表达与分泌水平的影响,及其对HUVEC细胞迁移的影响。方法乙醇刺激HepG2细胞,定量PCR （ qPCR）检测HepG2细胞VASN mRNA水平的变化, Western印迹检测HepG2细胞与细胞上清中VASN蛋白水平的变化。划痕愈合实验检测细胞共培养条件下,乙醇刺激的HepG2细胞培养上清对HUVEC细胞迁移的影响。结果 qPCR结果显示,乙醇可上调HepG2细胞VASN mRNA水平。 Western印迹结果显示,细胞VASN蛋白表达与分泌水平升高。划痕愈合实验结果表明乙醇刺激HepG2细胞VASN蛋白的分泌增加,可以促进HUVEC细胞的迁移。结论乙醇刺激导致HepG2细胞VASN蛋白表达水平和分泌水平升高,并可促进与其共培养的HUVEC细胞迁移。     

索拉非尼对顺铂诱导肝癌HepG2细胞凋亡的影响

目的探讨索拉非尼对顺铂抑制肝癌细胞HepG2增殖的影响及其可能机制。方法分别及联合应用两药后以MTT法检测HepG2细胞的增殖抑制．用流式细胞术检测细胞凋亡，用RT-PCR检测MDR-1的mRNA表达。结果索拉非尼及DDP单药对HepG2均有抑制作用，两药联合具有协同或相加作用。联合用药细胞凋亡率明显高于单药组（P〈0．05）。单药顺铂组与联合组MDR-1的mRNA表达高于对照组及索拉非尼单药组，其中单药顺铂组表达最高（P〈0．05）。结论索拉非尼联合顺铂对肝癌HepG2细胞有更强的抑制及促凋亡作用，其机制可能与增加HepG2细胞的凋亡，索拉非尼下调MDR-1．增强顺铂对HepG2细胞的诱导凋亡作用有关。     

光敏化姜黄素对人肝癌细胞HepG2的增殖影响

目的：研究姜黄素的光敏化效应并探讨光敏化姜黄素对人肝癌细胞株HepG2细胞的增殖和凋亡的影响。方法：采用人肝癌细胞株HepG2进行研究。细胞用不同浓度的姜黄素（2.5μmol/L,5μmol/L,10μmol/L,20μmol/L,40μmol/L,80μmol/L,160μmol/L）孵育2 h后,用0.4 J/cm2剂量的紫光照射,光照的功率为10 mW。利用MTT法测定不同浓度的姜黄素对HepG2细胞的抑制作用,观察其紫光光敏化效应。在选择的姜黄素剂量下,分别用不同剂量的紫光照射,检测能量密度改变后光敏化姜黄素对细胞的杀伤作用。最终选定在20μmol/L浓度下,姜黄素用0.2 J/cm2紫光照射其对细胞的杀伤作用。利用Hoechst33342染色从形态学上在观察光敏化姜黄素对HepG2细胞的促凋亡效应,采用流式细胞仪定量检测光敏化姜黄素的凋亡率。结果 ：姜黄素在紫光下具有光敏化效应,IC50从单独作用的92.49μmol/L降到27.06μmol/L,且这种效应在低浓度姜黄素低剂量的能量密度下更加明显。形态学和流式细胞仪检测到光敏化姜黄素的促凋亡效应,且凋亡率是同剂量姜黄素作用的3倍。结论：紫光照射可明显增强低剂量姜黄素对HepG2的细胞毒性,并可显著诱导细胞凋亡。     

Transgelin基因真核表达载体的构建及其对胃腺癌AGS细胞增殖的影响

目的 构建人肌动蛋白凝胶蛋白(Transgelin)基因编码区序列(cDNA)的真核表达载体,并观察其对胃腺癌细胞增殖的影响.方法 从健康人肠组织中提取总RNA,应用RT-PCR方法扩增TransgelincDNA的全长序列后克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A质粒中,构建成Transgelin基因的真核表达载体,然后转染入AGS细胞中,新霉素筛选稳定转染细胞克隆,通过MTT实验,研究转染Transgelin基因后细胞增殖的变化.结果 重组载体经酶切鉴定和测序证实目的 基因正确尤误,Western印迹检测结果显示Transgelin融合蛋白在AGS细胞中具有良好的表达,而转染空载体及未转染细胞对照则未见有此融合蛋白质条带;RT-PCR结果显示Transgelin基因在其稳定转染的AGS细胞克隆中表达上调,与空载体稳定转染及未转染细胞比较,差异具有统计学意义(P＜0.05).Transgelin表达上调的稳定克隆组,AGS细胞的增殖活性明显降低,MTT结果显示其增殖活性显著低于空载体稳定转染组及未转染亲代细胞组,差异具有统计学意义(P＜0.05),而后两者之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 Transselin表达上调可导致胃腺癌细胞增殖降低.     

Genistein调节肝癌HepG2细胞Caspase3蛋白表达诱导凋亡的作用研究

目的探讨三磷酸肌醇（IP3）和Caspase3蛋白表达变化在genistein诱导肝癌细胞凋亡中的作用。方法以肝癌HepG2细胞培养72h为对照组,实验各组以60μmol/L的genistein作用于HepG2细胞不同时间后,应用同位素试剂盒检测细胞IP3含量,Westernblotting分析细胞Caspase3蛋白表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果Genistein作用于肝癌HepG2细胞12、24、48、72h,各时相IP3含量显著低于对照组[（12.0±1.4）pmol/10^6cells、（7.5±0.8）pmol/10^6cells、（5.6±0.5）pmol/10^6 cells、（4.3±0.6）pmol/10^6 cellsvs（29.2±0.6）pmol/10^6 cells,P〈0.01];24h后Caspase3蛋白的RI显著高于对照组（2.7±0.2,7.4±0.5,7.4±0.5,30.7±1.6vs0.24±0.06,P〈0.05）;24h后各时相细胞凋亡率为显著高于对照组[（2.7±0.2）%、（7.4±0.5）%、（20.5±2.0）%、（30.7±1.6）%vs（2.6±0.1）%,P〈0.01]。结论Genistein能减少IP3生成,上调Caspase3蛋白表达,诱导肝癌细胞凋亡。     

基质刚度对肝癌细胞增殖及糖代谢的影响

目的研究不同基质刚度对肝癌细胞HepG2增殖和糖代谢的影响,探究细胞外基质(extracellular matrix,ECM)刚度对肝癌细胞代谢和生物学行为影响的相关性。方法采用CCK8和细胞计数法检测培养在不同刚度基质上HepG2细胞增殖的变化,利用2-(N-7-硝基-2,1,3-苯并恶二唑-4-氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖(2-NBDG)并通过流式细胞术检测基质刚度对HepG2葡萄糖摄取的影响,利用荧光定量RT-PCR检测基质刚度对HepG2葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1,Glut1)表达的影响,并利用糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2-DG)阻断糖酵解途径后检测基质刚度对HepG2细胞增殖的影响。结果随基质刚度增加,HepG2细胞增殖能力、葡萄糖摄取和Glut1表达都显著增加。糖酵解途径被阻断后,不同刚度基质上HepG2细胞增殖能力基本相同。结论肝癌细胞所处力学微环境对肝癌细胞的增殖有重要影响;较大的基质刚度可能通过调控糖代谢途径促进肝癌细胞的增殖。研究结果为肝癌的临床治疗以及糖代谢为治疗靶点的药物开发提供相应的实验依据。     

Sirt1基因shRNA干扰载体构建及其对细胞增殖和凋亡的影响

本实验目的在于构建Sirt1 shRNA干扰载体,探讨Sirt1对HepG2、A549和293T细胞增殖和凋亡的影响。设计并合成Sirt1的shRNA序列,重组到pGenesil-1.0质粒载体中筛选出pGenesil-1.0-Sirt1阳性克隆并测序。将构建好载体转染HepG2、A549和293T细胞,用RT-PCR、Western blot检测各细胞中Sirt1表达水平,MTT测细胞增殖活性,加入阿霉素处理三组细胞后,用MTT检测细胞凋亡情况。结果表明成功构建Sirt1 shRNA干扰载体,各细胞株中Sirt1表达水平明显下降,Sirt1 shRNA克隆细胞株增殖能力降低,阿霉素处理后,各细胞株抗凋亡能力明显减弱,Sirt1在维持细胞增殖及抗细胞DNA损伤凋亡方面发挥重要作用,为进一步研究提供理论依据。     

可溶性血管内皮生长因子受体1真核克隆表达及其对血管内皮细胞增殖的影响

本研究旨在构建可溶性血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)受体1(soluble fmslike tyosine kinase-1,sFlt-1)的真核表达质粒pcDNA3.1-sFlt-1,并观察sFlt-1对血管内皮细胞增殖的影响。提取人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)总RNA,扩增Flt-1基因胞外1-3结构域,构建真核表达质粒pcDNA3.1-sFlt-1,测序鉴定基因序列。将重组质粒转染Lewis肺癌细胞,采用RT-PCR和SDS-PAGE检测sFlt-1在基因及蛋白水平的表达情况。MTT法检测sFlt-1对VEGF诱导的HUVECs生长的影响。结果显示:①插入片段序列正确;②sFlt-1在基因水平成功表达且转染后的Lewis肺癌细胞能分泌表达sFlt-1;③含sFlt-1的细胞上清液可明显抑制VEGF诱导的HUVECs增殖。本研究成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1-sFlt-1,sFlt-1,在基因和蛋白水平均获得有效表达,且表达的蛋白可明显抑制由VEGF诱导...     

Wnt2在肝细胞肝癌中的表达及对HepG2细胞增殖的影响

 目的 探讨Wnt2在原发性肝细胞肝癌(HCC)中的表达及转染靶向Wnt2的siRNA对人肝癌HepG2细胞的抑制效果。方法 实时荧光定量PCR法和免疫组化法检测Wnt2在肝癌组织,癌旁组织及正常肝组织的表达差异;使用siRNA沉默人肝癌HepG2细胞Wnt2的表达后,检测Wnt2基因和蛋白的表达变化,并检测细胞的增殖和周期变化。结果 1）在上述组织中,Wnt2在癌内表达最高,癌旁次之,正常肝最低。2）使用siRNA沉默人肝癌HePG2细胞Wnt2后,Wnt2基因和蛋白表达下调,细胞增殖受抑制,其生长主要停滞在G0/G1期,而S期细胞所占比例下降。结论 肝细胞肝癌中存在Wnt2的高表达;siRNA可抑制HepG2细胞Wnt2的表达,并抑制HepG2生长,Wnt2基因可能是调控肝癌基因表达的新的靶基因。