甲基丙烯酸环氧丙酯致人支气管上皮细胞恶性转化过程中P16基因的甲基化状态

目的 分析甲基丙烯酸环氧丙酯(glycidyl methacrylate,GMA)致人支气管上皮16HBE细胞恶性转化过程中不同时点P16基因甲基化状态的差异,探讨GMA诱导16HBE细胞发生恶性转化相关DNA甲基化机制.方法 收获GMA转化早期(染毒结束)、转化前期(第10代)、转化后期(第30代)的16HBE细胞,采用甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation-specific PCR,MSP)检测该基因组P16基因启动子区的甲基化状态,并与未转化的16HBE细胞及同期培养的DMSO溶剂对照细胞进行比较.结果 转化早期及转化前期,正常对照组及DMSO溶剂对照细胞中该基因启动子区均表现为非甲基化,而GMA组细胞中表现为不同程度的甲基化,阳性对照表现为甲基化;转化后期,正常对照组细胞中该基因启动子区表现为非甲基化,而DMSO溶剂对照组及GMA组细胞中均表现为部分甲基化,阳性对照表现为甲基化.结论 在GMA诱导16HBE细胞恶性转化早期及前期P16基因的甲基化状态具有特异性,故可将其作为GMA诱导16HBE细胞发生恶性转化的一个早期敏感指标.     

甲基丙烯酸环氧丙酯致人支气管上皮细胞染色体损伤的研究

目的研究甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)对人支气管上皮(16HBE)细胞染色体损伤的情况,探讨其潜在致癌性。方法 GMA染毒16HBE细胞后,收获不同染毒剂量(4、8、12、16、20μg/ml)、染毒次数(1、2、3次)、转化代数(10、30代)的细胞进行染色体畸变分析。结果在4～20μg/ml剂量范围内,随染毒剂量的增加,染色体畸变率(3%、6%、7%、11%、14%)升高,并呈剂量-反应关系;随着染毒次数增加,3次染毒的细胞染色体畸变率(6%、7%、10%)显著增高;转化第10代细胞表现为染色体结构畸变,而转化第30代细胞主要表现为染色体数目畸变。结论 GMA能够诱导16HBE细胞染色体畸变,且畸变类型由早期的结构畸变转变为数目畸变。     

甲基丙烯酸环氧丙酯致人支气管上皮细胞早期遗传损伤效应研究

目的 研究甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)对人支气管上皮细胞(16HBE)染毒早期的遗传损伤效应及去除暴露因素后的恢复效应.方法 1、2、4、8、16、32 mg/L质量浓度的GMA短时间(3 h)染毒16HBE(染毒组);另选细胞经上述染毒后,于染毒结束时继续恢复1个细胞周期(染毒恢复组),利用胞质阻滞微核试验观察细胞遗传损伤效应.结果 染毒组的双核细胞微核率(MN)和双核细胞核芽率(NBUD)随染毒剂量的增加逐渐升高,并存在剂量-效应关系(决定系数分别为0.887、0.558,P＜0.01),剂量达8 mg/L时核分裂指数(NDI)降低;但双核细胞核质桥率随染毒剂量增加变化趋势不明显,没有明显的剂量-效应关系.染毒后染毒恢复组的MN在低剂量时变化不明显,剂量增加后才逐渐升高,但上升速度较慢;NDI随剂量变化不明显;NBUD在4、8 mg/L时甚至出现下降.结论 GMA在染毒早期即对细胞有明显的遗传损伤效应,但暴露因素去除后损伤有被修复的趋势,细胞修复机制的及时启动在维持遗传稳定性方面发挥了关键作用.     

甲基丙烯酸环氧丙酯对人支气管上皮细胞周期及凋亡影响的研究

目的探讨甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)对人支气管上皮细胞周期及凋亡的影响。方法人支气管上皮细胞(16HBE)经1~16μg/ml剂量的GMA染毒不同次数后,应用流式细胞仪(FCM)检测细胞周期及凋亡率的改变,同时测定细胞分裂指数(MI)。结果经1次染毒处理后,随着染毒剂量的增加,G0/G1期细胞显著减少(P<0.01),S期和G2/M期细胞显著增加,凋亡细胞数增多,细胞分裂指数下降;随着染毒次数的增加,各剂量组细胞周期均明显阻滞于G0/G1期,但高剂量组细胞仍表现出S期和G2/M期增多现象;经3次染毒后,高剂量组细胞出现凋亡率下降、分裂指数升高现象。结论经GMA染毒处理后,16HBE细胞周期由G0/G1期向S期和G2/M期移动而呈现增殖性改变。     

长链非编码RNA LINC00310在甲基丙烯酸环氧丙酯诱导人支气管上皮细胞恶性转化中的表达改变

目的探讨LINC00310在甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)诱导人支气管上皮细胞16HBE恶性转化中的表达改变。方法复苏成功的16HBE细胞使用1μg/mL二甲基亚砜作为溶剂对照,终浓度为8μg/mL GMA为染毒组,每次染毒72 h,间隔24 h后再次染毒,重复染毒3次后,分别进行传代培养。取第10、20和30代(前、中和后期)GMA染毒组和溶剂对照组的细胞进行长链非编码RNA芯片分析,观察LINC00310在不同时期的表达改变,同时利用NCBI、cBioPortal生物信息学数据库寻找可能作用靶点,实时荧光定量PCR检测LINC00310和可能作用靶点的相对表达量。结果芯片结果显示,与同时期溶剂对照组相比,第10、20、30代的GMA染毒组LINC00 310分别下调2.02倍、上调6.17倍和上调2.03倍。实时荧光定量PCR的验证结果中,三个时期的LINC00310相对表达量变化趋势与芯片分析的结果基本一致,分别下调2.76倍、上调2.68倍和上调3.09倍,可能作用靶点C-Myc相对表达量在第20、30代分别上调3.52倍和下调1.49倍,差异具有统计学意义(P<0.05)...     

甲基丙烯酸环氧丙酯诱导人胚肺细胞恶性转化机制的研究

[目的 ]研究甲基丙烯酸环氧丙酯 (GMA)诱导人胚肺成纤维细胞恶性转化的机制。 [方法 ]本研究在建立GMA体外诱导的人胚肺成纤维细胞 (HELF)恶性转化模型的基础上 ,采用mR NA差异显示 (DD PCR)技术 ,对恶性转化细胞同正常细胞之间基因的差异表达状况进行比较分析。 [结果 ]实验结果显示 ,两种细胞在基因表达方面存在明显差异。在转化细胞中克隆到的 5个差异表达基因片段 ,其中 3个高表达基因片段 (cDNA)分别与人核糖体蛋白 (RP)L41、RPL15、RPS16基因高度同源 ;2个差异表达基因片段分别与人促分裂原活化的蛋白激酶激酶激酶 11(MAPKKK 11)和转化生长因子 β诱导的蛋白 (TGFBI)基因高度同源 ,它们在转化细胞中分别呈明显的上调和下调表达。[结论 ]包括上述RP、MAPKKK11和TGFBI多个基因的激活与失活可能与GMA诱导的细胞恶性转化过程有关。GMA在诱导人胚肺成纤维细胞恶性转化过程中。使MAPK及TGF β信号传导通路功能异常 ,这些结果为进一步研究GMA诱导细胞转化及其潜在致癌机制提供了新的线索     

甲基丙烯酸环氧丙酯诱导哺乳类细胞转化的实验研究

用人胚肺成纤维细胞的体外转化实验检测出甲基丙烯酸环氧丙酯可诱导人胚肺成纤维细胞形态学改变，转化细胞核浆比例增大，排列紊乱，交叉重叠生长。从转化集落分离的细胞可被较低浓度的刀豆凝集素Ａ凝集，在半固体琼脂内非贴壁依赖生长。转化细胞的染色体发生结构和数目改变。上述结果表明：甲基丙烯酸环氧丙酯具有诱导人胚肺成纤维细胞恶性转化的作用，预示它可能对人具有潜在的致癌危险性。     

亚砷酸钠致人支气管上皮细胞恶性转化过程中氧化应激指标变化

目的探讨在亚砷酸盐致人支气管上皮(HBE)细胞恶性转化过程中氧化应激指标的变化趋势,初步探讨其对细胞恶性转化的作用。方法用1μmol/L亚砷酸钠连续染毒HBE细胞。通过形态学观察、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)以及软琼脂克隆实验鉴定细胞恶性转化情况,分别于暴露1、8、15、22、29、36、43代,以流式细胞仪检测细胞活性氧(ROS)水平,检测细胞丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果亚砷酸钠长期染毒HBE细胞至43代时,细胞生长速度明显加快,且呈浸润型生长,MMP-9分泌量升高,细胞集落数量增多。与正常对照(0代)比较,22代及以前HBE细胞内ROS、MDA及SOD的水平均呈先升高后下降的波浪形趋势;29代及以后,ROS、MDA水平逐渐下降,且以ROS表现更为明显,而SOD水平呈逐渐升高趋势。结论细胞内氧化-抗氧化平衡失调可能在低剂量砷化合物诱导HBE细胞恶性转化过程中发挥重要作用。     

甲基丙烯酸环氧丙酯对BALB/c 3T3细胞恶性转化的实验研究

利用建立的 BALB/c 3T3细胞转化系统进行甲基丙烯酸环氧丙酯(GMA)的细胞转化和裸鼠诱癌的实验研究。实验结果表明:GMA 可诱导 BALB/c 3T3细胞形态转化,并呈剂量-反应关系;从转化灶分离扩增细胞,经电镜扫描观察到转化细胞表面形态改变,可被植物凝集素 ConA凝集,并在半固体琼脂生长,在同品系裸鼠皮下形成了肿瘤,病理组织检查结果为分化程度较低的纤维肉瘤。GMA 有很强的诱导细胞恶性转化的能力,提示 GMA 有潜在的致癌危险性。     

甲基丙烯酸环氧丙酯对金仓鼠胚胎细胞的转化作用

应用金仓鼠胚胎（ＳＨＥ）细胞的转化试验的结果表明：当甲基丙烯酸环氧丙酯（ＧＭＡ）浓度在０．９～１４．２ｍｇ／Ｌ时，可诱发细胞的形态学转化，转化率范围是（０．８４～２．１８）×１０－５，最高的转化率与阳性对照３－甲基胆蒽（ＭＣＡ）转化率相近并呈剂量－效应关系；转化细胞对刀豆素凝集反应的能力增强；有在软琼脂中形成集落的能力。形态学转化的细胞已获得恶性转化的特征，提示ＧＭＡ可能具有致癌性     

JWA对N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍诱导人支气管上皮细胞恶性转化的影响

目的 探讨JWA对烷化剂N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱导人支气管上皮细胞(HBE)恶性转化的影响及可能机制.方法 建立JWA高表达HBE细胞株,用MNNG诱导HBE细胞恶性转化,用噻唑蓝(MTT)法检测MNNG诱导后细胞生长状况,用软琼脂集落试验检测细胞非锚着依赖生长能力,用Western blot法检测P53蛋白的表达变化规律.结果 经MNNG处理的正常HBE细胞恶性转化后生长速度明显快于高表达JWA的HBE细胞和未经MNNG处理的HBE细胞,差异有统计学意义(P＜0.05).经MNNG处理的JWA高表达的HBE细胞和未用MNNG处理的HBE细胞的克隆形成率(8.06%和10.14%)明显低于MNNG处理的恶性转化的HBE细胞(26.80%),差异有统计学意义(P＜0.01).MNNG诱导正常的HBE细胞恶性转化过程中,P53蛋白逐渐增加;而在JWA高表达HBE细胞,经MNNG处理后,P53蛋白早期(第1～2代)有一过性的表达增高,此后,随着传代数增加,P53表达则逐渐下降,细胞最终未显示恶性转化表型特征.结论 JWA可能通过P53蛋白表达调节MNNG诱导HBE细胞的恶性转化.     

甲基丙烯酸环氧丙酯诱导细胞转化的部分相关cDNA的克隆

在甲基丙烯酸环氧丙酯 (GMA)体外诱导建立人胚肺成纤维细胞 (HEL F)恶性转化模型的基础上 ,采用 m RNA差异显示 PCR(DD- PCR)技术 ,对恶性转化细胞与正常细胞之间基因的差异表达进行比较分析。结果显示 ,两种细胞在基因表达方面存在明显差异。已克隆到的 3个差异表达的基因片段分别与人乳腺癌转录因子 (ZABC1)、Tbx3和小鼠 E2基因高度同源 ,并在转化细胞中均呈明显的上调表达。结果提示 ,包括 ZABC1、Tbx3和 E2在内的多个基因的激活与失活可能与 GMA诱导的细胞恶性转化过程有关     

氯化镉诱发人支气管上皮细胞系恶性转化

目的研究氯化镉诱发SV40 LargeT抗原永生化的人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化作用。方法体外用不同浓度氯化镉多次处理16HBE细胞,软琼脂集落形成和裸鼠成瘤试验鉴定转化细胞的恶性度。结果细胞培养至35代,发现氯化镉可诱导16HBE恶性转化。转化细胞排列紊乱、重叠生长,在软琼脂中的集落形成率显著高于对照组(P<0.01),并呈时间—剂量依赖关系;转化细胞在裸鼠体内成瘤,组织学证实为低分化鳞状细胞癌。结论氯化镉有较强的诱导16HBE恶性转化能力;该转化模型为镉致癌机制的分子水平提供了理想的研究系统。     

氟维司群对亚砷酸钠致人支气管上皮细胞恶性转化的抑制作用研究

目的 研究雌激素受体拮抗剂氟维司群对亚砷酸钠致人支气管上皮细胞恶性转化的抑制作用,为探讨雌激素受体在砷致肺癌发生中的作用提供实验依据。方法 单纯以2.5 μM亚砷酸钠对人支气管上皮细胞株16-HBE持续染毒者设为对照组,自染毒30代起加入不同剂量（10-11、10-9、10-7M）氟维司群与砷联合处理者设为低、中、高剂量拮抗剂组,同时设置溶剂对照组（DMSO）。各组细胞继续培养至60代时,利用qPCR和Western Blot测定氟维司群干预下细胞ERα、ERβ mRNA和蛋白的相对表达水平,软琼脂克隆形成实验和划痕实验分别测定氟维司群对细胞克隆形成能力和迁移能力的影响。结果 培养至60代时,各剂量拮抗剂组细胞ERα mRNA和蛋白表达均低于对照组和溶剂对照组(P＜0.05);中、高剂量拮抗剂组细胞ERβ mRNA表达均低于对照组和溶剂对照组(P＜0.05),各剂量拮抗剂组细胞ERβ 蛋白表达水平均低于对照组和溶剂对照组(P＜0.05)。各剂量拮抗剂组的软琼脂克隆形成数和细胞24 h迁移距离均低于对照组和溶剂对照组(P＜0.05)。结论 氟维司群通过下调雌激素受体表达抑制了亚砷酸钠诱导的人支气管上皮细胞株16-HBE恶性转化,雌激素受体可能参与了砷致细胞恶性转化。     

云锡矿粉诱导人肺上皮细胞转化和成纤维细胞活化过程中的相互作用

目的 探讨云锡矿粉诱导人肺上皮细胞转化及成纤维细胞活化过程中的相互作用.方法 常规培养永生化人支气管上皮细胞(BEAS-2B)及人胚肺成纤维细胞(WI-38),每6天传代1次;100μg/ml的云锡矿粉隔代诱导BEAS-2B及WI-38至第9代,共诱导5次,自第11代分组共培养至第40代.刀豆凝集素A及锚着独立性生长实验检测细胞恶性转化,流式细胞术检测细胞周期变化,免疫细胞化学法检测成纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达.结果 (1)与正常BEAS-2B细胞相比,矿粉诱导的BEAS-2B细胞单独培养至第28代细胞形态开始出现改变;与WI-38细胞共培养后,细胞形态改变提早至第20代;与矿粉诱导的WI-38细胞共培养后,细胞形态改变进一步提早至第16代.矿粉诱导的BEAS-2B细胞培养至第26代时凝集实验出现阳性;与WI-38细胞及矿粉诱导的WI-38细胞共培养后,细胞凝集时间缩短.与WI-38细胞共培养的矿粉诱导BEAS-2B及与矿粉诱导WI-38细胞共培养的矿粉诱导的BEAS-2B细胞分别在第26及第36代锚着独立性生长实验出现阳性,第36代的克隆形成率分别为6.00‰±1.00‰和15.33‰±2.52‰,且差异有统计学意义(P<0.05).矿粉诱导的各组上皮细胞S期细胞所占比例随培养代数增加逐渐升高,细胞发生恶性转化.(2)100 μg/ml矿粉诱导的成纤维细胞培养至第26代出现α-SMA表达;与上皮细胞共培养后,成纤维细胞α-SMA表达增强,且随培养代数的增加,阳性表达细胞数明显增多,着色程度增强.结论 个旧矿粉能诱导支气管上皮细胞恶性转化及成纤维细胞活化;肺上皮细胞是矿粉诱癌的主要靶细胞;肺上皮细胞的转化和成纤维细胞的活化相互影响,相互促进.