人乳头瘤病毒16型 E6蛋白真核表达载体pGADT7-E6的构建与鉴定

目的 构建HPV16 E6基因的真核表达载体,为在酵母菌中表达以及进一步探讨HPV16 E6基因与宫颈癌发生的关系奠定前期实验基础.方法 用PCR扩增含EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的E6基因序列,双酶切pGADT7载体与E6基因PCR产物,纯化回收后,用连接酶将二者连接并转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,并对其进行双酶切和测序鉴定,构建HPV16 E6基因的真核表达载体pGADT7-E6.结果 双酶切pGADT7-E6后,琼脂糖凝胶电泳显示2个片段,分别在约500 bp与8.0 kb处.DNA测序结果经与GenBank登录的序列做BLAST分析,显示重组质粒含有477 bp的目的 基因片段,读码框正确,无碱基错配和移码突变.结论 成功构建了HPV16 E6基因真核表达载体pGADT7-E6.     

家族性肌萎缩侧索硬化症研究中pGBKT7-mSOD1cDNA酵母双杂交表达载体的构建

目的构建能在酵母菌AH109中表达的mSOD1cDNA的穿梭表达质粒pGBKT7-mSOD1cDNA,研究突变SOD1编码蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用。方法通过PCR法以真核表达载pEGFP-mSOD1cDNA为模板,扩增获得了120bp的mSOD1基因的末端及DNA结合域的片段,经过SalⅠ、EcoRⅠ双酶切后,基因重组的方法定向亚克隆于酵母双杂交载体pGBKT7中,构建形成pGBKT7-mSOD1真核表达载体。结果经转化,提取质粒双酶切,核苷酸测序,BALST比对鉴定表明构建成功。结论成功构建穿梭质粒pGBKT7-mSOD1cDNA,为深入研究突变的SOD1基因编码蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用奠定了基础。     

Asp896～Val911缺失的阴离子交换蛋白1C末端表达质粒的构建

目的 构建Asp896-Val911缺失的阴离子交换蛋白1（Anion Exchange1,AE1）C末端表达质粒。方法 利用PCR方法，以pFAST-AE1-C-end为模板，扩增出AE1后16位氨基酸Asp896-Val911缺失的C末端基因，将其克隆至pGADT7载体上。用醋酸锂法将构建好的pGADT7-AE1-c-end-truncation转染酶母菌AH109，观察其在选择性培养基上的表达情况。结果 成功构建了AE1缺失后16位氨基酸的C末端表达质粒。结论 重组质粒pGADT7-AE1-c-end-truncation对酵母无毒性，不能激活检测基因，可作为酵母双杂交系统中的靶基因。     

细菌-酵母穿梭表达质粒pGBKT7-MIF的构建及转化

【目的】构建并转化能在酵母菌AH10 9中表达巨噬细胞游走抑制因子 (MIF)的穿梭表达质粒pGBKT7 MIF。【方法】用RT PCR方法从人T淋巴细胞中扩增MIF基因全外显子片段 ,并定向克隆入细菌 酵母穿梭表达质粒 pGBKT7中 ;用PEG/LiAC法将pGBKT7 MIF转化感受态酵母菌AH10 9。提取转化酵母菌的质粒DNA ,转化大肠杆菌并行质粒的酶切鉴定。【结果】扩增出人MIFcDNA片段 ,限制性内切酶酶切和DNA测序证实获得正确的重组质粒 pGBKT7 MIF ;获得可在色氨酸缺陷培养基 (SD/ trp)上生长含 pGBKT7 MIF的酵母菌克隆。酶切鉴定表明pGBKT7 MIF已转化入酵母菌AH10 9。【结论】成功构建穿梭质粒 pGBKT7 MIF ,并转化入酵母菌AH10 9。     

乙型肝炎病毒前S区不同片段在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测

目的　用含乙型肝炎病毒 (HBV)前 S区不同大小的c DNA片段构建酵母双杂交诱饵载体 ,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用 .方法　PCR扩增含 HBV前 S区不同大小的 c DNA片段 ,分别克隆入 p U C19质粒 ,经测序正确后 ,再分别亚克隆入酵母双杂交诱饵载体 p GBKT7中 .将重组质粒导入酵母菌 AH10 9,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用 .结果　成功获得含 HBV前 S区不同大小的 c DNA片段 ,HBV前 S区不同片段所表达的蛋白对酵母菌 AH10 9无毒性 ,但是对报告基因均有激活作用 .结论　不能利用酵母双杂交 Gal4系统 3来研究与 HBV前 S区相互作用的蛋白 ;证实了 HBV前S区不同片段所表达的蛋白的自激活功能 ,为进一步研究乙型肝炎病毒致病机制打下了基础     

细菌—酵母穿梭表达质粒pGBKT7—LMP1的构建与鉴定

目的 构建能在酵母中表达EBV潜伏膜蛋白1（LMP1）的穿梭表达质粒pGBKT7-LMP1。方法 RT－PCR方法扩增EB病毒LMP1全外显子片段，利用DNA重组技术将其定向插入细菌－酵母穿梭质粒pGBKT7启动子下游。结果 限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实RT－PCR获得的LMP1 cDNA片段与GenBank中的数据完全吻合；LMP1准确克隆入pGBKT7的多克隆位点，未改变读码框架。结论 成功构建了穿质粒pGBKT7-LMP1。     

结核分枝杆菌Rv1246c和Rv1247c假想蛋白间的相互作用

目的 观察结核分枝杆菌Rv1246c和Rv1247c假想蛋白间的相互作用.方法 采用PCR技术克隆结核分枝杆菌Rv1246c和Rv1247c假想蛋白基因, 构建酵母双杂交载体质粒pGBKT7-Rv1247c和pGADT7-Rv1246c, 经酶切分析和DNA测序证实重组质粒构建成功后, 采用醋酸锂法顺序转染酵母菌AH109,检测β半乳糖苷酶活性.结果 共转染GBKT7-Rv1247c和pGADT7-Rv1246c的酵母菌AH109可以在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp营养缺陷培养基上生长,β半乳糖苷酶活性实验阳性.结论 利用酵母双杂交系统证实结核分枝杆菌Rv1246c与Rv1247c假想蛋白可以相互作用.     

Bit1基因在酵母双杂交系统中的表达及对报告基因激活作用的检测

目的:用Bit1基因片段构建酵母双杂交诱饵载体,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用. 方法:运用RT-PCR技术从卵巢癌细胞系Caov-3中扩增出Bit1基因片段,克隆入pUC19质粒,经测序正确后,再克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用. 结果:成功获得Bit1基因片段,Bit1基因表达的蛋白对酵母菌AH109无毒性,对报告基因亦无激活作用. 结论:可以利用酵母双杂交Gal4系统来研究与Bit1相互作用的蛋白.     

细菌-酵母穿梭表达质粒pGBKT7-LMP1 的构建与鉴定

[目的]构建能在酵母中表达EBV潜伏膜蛋白1(LMPl)的穿梭表达质粒pGBKT7-LMP1.[方法]RT-PCR方法扩增EB病毒LMP1全外显子片段,利用DNA重组技术将其定向插人细菌-酵母穿梭质粒pGBKT7的T7启动子下游.[结果]限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实RT-PCR获得的LMP1 cDNA片段与GenBank中的数据完全吻合;LMP1准确克隆人pGBKT7的多克隆位点,未改变读码框架.[结论]成功构建了穿梭质粒pGBKT7-LMP1.     

p65 DNA结合域的克隆、表达及其酵母双杂交自身激活作用检测

目的：获得NF－κB p65亚基DNA结合域cDNA及构建酵母双杂交系统中的靶基因，并检测靶基因的表达和自身激活活性。方法：利用引物二聚体搭桥技术，扩增p65亚基DNA结合域基因片段，并将基克隆入酵母双杂交载体pG-BKT7 DNA-BD。应用醋酸锂法转化酵母细胞AH109，在SD／Trp选择培养基上培养，观察转化株的生长情况。按尿素／SDS法抽提酵母蛋白，用SDS－PAGE电泳和Western-blot鉴定靶蛋白在酵母细胞中的表达。利用液相法和平板法检测阳性转化株β－半乳糖苷酶的活性。结果：获得p65 DNA结合域基因片段，并成功构建酵母双杂交系统中的靶基因。靶基因能在酵母细胞中表达，对酵母细胞无毒性作用，无自身激活活性。结论：NF－κB p65亚基DNA结合域可作为酵母双杂合系统中的靶基因，用于肽库筛选，捕捉与之相互作用的多肽。