ATP对大鼠三叉神经节神经元瞬时外向钾电流(IA)的快速作用

目的 通过大鼠三叉神经节(TG)神经元体外培养及全细胞膜片钳技术, 观察ATP对大鼠TG神经元上电压敏感性钾离子电流IA的调节及可能的机制。方法 雄性SD大鼠TG神经元急性分离,体外培养4 h后进行全细胞膜片钳记录。结果 在TG神经元上ATP可以诱导三种型式的电流, 即T型、S型和B型。ATP可以抑制T型神经元IA(P<0.05),这种作用可以被P2X3受体拮抗剂TNP-ATP拮抗, 在S型神经元上ATP对IA无作用。在ATP未能诱导出内向电流的TG神经元, ATP仍然对IA有抑制作用, 而且这一作用可以被P2Y受体的拮抗剂suramin拮抗。结论 ATP对分离培养的TG神经元上IA可以起到抑制作用, 这一作用可能通过P2X3受体或P2Y受体来完成, 但ATP对IA电流的作用机制目前尚不十分清楚。这一研究将为进一步阐明神经病理性痛的发生机制提供实验依据, 为临床治疗提供理论基础。     

PKA参与ATP对大鼠背根神经节神经元电压门控性钙通道的抑制

目的 探讨ATP对大鼠背根神经节(DRG)神经元的电压门控性钙通道(VGCC)的抑制效应及其信号转导途径.方法 在急性分离的大鼠DRG神经元上应用全细胞膜片钳技术记录ATP诱导的电流以及VGCC电流;应用钙离子成像技术检测胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的变化.结果 ATP能够可逆性地抑制DRG神经元的VGCC电流和VGCC介导的[Ca2+]i升高.用PKA抑制剂H-89预处理DRG神经元,ATP对VGCC电流及其介导的[Ca2+]i升高的抑制被反转;而用PKC抑制剂bisindolylmaleimide(Bis)预处理DRG神经元,ATP对VGCC介导的[Ca2+]i升高的抑制效应则无影响.结论 在大鼠DRG神经元中,PKA参与了ATP对该神经元VGCC的抑制.     

Zn2+对大鼠不同自主神经节分离神经元P2X受体介导ATP诱导电流的调制作用

目的:在大鼠颈上交感神经节(SCG)、结状神经节(NG)和耳副交感神经节(OTG)分离的神经元上,分别比较了Zn2+对P2X受体介导ATP诱导电流的调制作用.方法:用全细胞膜片钳技术观察Zn2+对以上3种大鼠自主神经节分离神经元ATP/αβ-me ATP诱导电流的调制作用.结果:在SCG的所有神经元上,ATP可以诱发一个缓慢型电流,同时给予Zn2+(10μmol/L)可以使其反应增大至(1 442±34)％,而αβ-me ATP没有此作用.在NG的所有神经元上,ATP和αβ-me ATP可以诱发一个类似的缓慢型电流,同时给予Zn2+可以使其反应分别增大至(180±12)％和(262±28)％.在OTG的所有神经元上,ATP可以诱发一个类似的缓慢型电流,同时给予Zn2+(10 μmol/L),对ATP(10 μmol/L)诱发的电流无明显影响;如果将ATP浓度提高至30 μmol/L,同样浓度的Zn2+(10μmol/L)可以抑制ATP电流,而且随着Zn2+浓度的增高(10、100 μmol/L),其抑制作用逐渐增强;如果先给予TNP-ATP(100 nmol/L)阻断电流至未给予TNP-ATP组的(26±2)％,再给予Zn2+(10μmol/L)后,剩余的ATP电流为单独给予TNP ATP的(127±9)％;αβ-me ATP也可以诱发一个类似的缓慢型电流,同时给予Zn2+(10 μmol/L)可使其反应增大至(146±5)％;Zn2+(300μmol/L)对ATP和αβme ATP(30 μmol/L)诱发电流的激活和失活时间常数均无明显影响.结论:(1)Zn2+对P2X受体具有变构性的调节作用,它可以增强大鼠SCG和NG上由P2X2和P2X2/3受体介导的缓慢型电流.(2)大鼠OTG上主要表达P2X2/3和少量P2X2受体,但Zn2+对ATP诱导的电流有轻度抑制作用,提示OTG可能存在着P2X受体家族的新亚型.     

培养大鼠皮层神经元缺氧损伤与蛋白激酶活化关系的研究

目的检测神经元缺氧后膜性PKA(蛋白激酶A)和PKC(蛋白激酶C)活性变化,以及它们的特异性抑制剂对神经元凋亡率的影响.方法建立培养的神经元"缺血"模型,然后用不同浓度的特异性PKA抑制剂Rp-cAMP和特异性PKC抑制剂Calphostin C预孵育培养神经元再进行"缺血"实验,用放射酶分析法测定神经元缺氧后的膜性蛋白激酶活性,各组缺氧神经元的凋亡百分率由TUNEL荧光试剂盒测定.结果随着神经元缺氧时间的延长,神经元膜性PKA和PKC活性均增加;随着Calphostin C浓度的增加,细胞凋亡率显著增加;相反随着Rp-cAMP浓度的增加,细胞凋亡百分率显著减少.结论①PKA和PKC信号转导通路均参与了缺氧神经元损伤;②缺氧后培养神经元PKA和PKC对凋亡的调控功能相反,提示在培养的缺氧神经元中PKA和PKC信号转导属于单相控制系统,可能二者在细胞中的比例决定着缺氧神经元的存亡.     

P2受体介导对大鼠三叉神经节神经元电压门控性钙离子通道的作用

目的应用全细胞膜片钳研究P2受体介导对大鼠的三叉神经节(TG)神经元上电压门控性钙离子通道(VGCC)的作用。方法急性分离大鼠TG神经元细胞,通过全细胞膜片钳记录电压门控性钙离子通道电流,分别灌流腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)及P2X、P2Y受体的激动剂,观察其对VGCC电流的作用。结果 ATP对大鼠TG神经元细胞的VGCC电流有可逆的抑制作用(P<0.05),P2X受体激动剂αβ-meATP能够显著抑制TG神经元的VGCC电流(P<0.05),而P2Y受体激动剂2-MeSADP对VGCC电流无明显作用。结论 P2受体介导对大鼠的TG神经元上VGCC电流有抑制作用。     

不同糖浓度中大鼠DRG神经元相关蛋白表达及Ca2+浓度的测定

目的观察高糖对背根神经节(DRG)中瞬时感受器电位香草酸受体4(TRPV4)和蛋白激酶Cε(PKCε)的表达以及细胞内Ca2+浓度的影响,探讨其在糖尿病大鼠神经病理性疼痛形成中的作用机制。方法培养的新生大鼠DRG神经元分成正常对照组(C组)、中糖组(M组)和高糖组(H组)。48 h后通过蛋白质免疫印迹法测定DRG神经元TRPV4和PKCε的表达水平,并通过共聚焦显微镜测定DRG神经元[Ca2+]i的水平。结果 TRPV4、PKCε蛋白的表达上调且呈浓度依赖性。C组、M组、H组TRPV4蛋白分别为0.33±0.05、3.20±0.40和7.69±0.60;PKCε蛋白分别为0.88±0.04、1.08±0.08和1.97±0.35。在TRPV4激动剂4α-PDD的作用下,与C组比较,H组[Ca2+]i显著升高(P<0.05),且呈浓度依赖。结论高糖可以上调DRG神经元中TRPV4、PKCε蛋白的表达,增加神经元内Ca2+浓度。TRPV4、PKCε对DRG神经元内Ca2+起到了协同调控的作用。     

蛋白激酶A对小鼠皮层神经元酸敏感离子通道的调节

目的 :探讨蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)对小鼠皮层神经元酸敏感离子通道(acid sensing ion channels,ASICs)功能的影响及机制。方法:取原代培养小鼠皮层神经元,通过应用钙影像、全细胞膜片钳、免疫荧光和Western Blot等技术,分别观察PKA激动剂和抑制剂对ASICs功能的影响及机制。结果:(1)在给予PKA激动剂或抑制剂前神经元ASICs电流幅值约为(224.2±17.59)pA(n=15),预孵育PKA激动剂forskolin(10μmol/L)使电流幅值减小为(108±14.67)pA(n=9),与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01),而预孵育PKA抑制剂PKAI(5μmol/L)则使电流幅值增加为(306.3±22.9)pA(n=12),与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01);(2)在给予PKA激动剂或抑制剂前,酸诱导的胞内钙△F/F值为(0.708±0.07)(n=20),PKA激动剂forskolin(10μmol/L)使其减少为(0.140±0.013)(n=17),与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01),PKA抑制剂PKAI(5μmol/L)使其增加为(0.978±0.108)(n=19),与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01);(3)在加入forskolin或PKAI 24 h后,神经元ASIC1总荧光密度无明显改变(P>0.05),但神经元ASIC1膜荧光密度从对照组的(78.58±7.42)(n=32)减少到forskolin孵育后的(31.41±3.38)(n=57),与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01),而PKAI孵育后神经元ASIC1膜荧光密度增加到(118.29±11.50)(n=34),与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 :PKA通过影响ASICs膜分布负性调节小鼠皮层神经元ASICs电流及由酸诱导的胞内钙增加。     

P物质通过蛋白激酶C抑制牛蛙初级感觉神经元的GABA激活电流(英文)

目的　探索P物质对牛蛙背根神经节神经元γ -氨基丁酸激活电流抑制的机制或途径。方法　实验采用的方法是全细胞膜片钳技术 ,实验材料为急性分离的牛蛙背根神经节神经元。结果　P物质在牛蛙背根神经节神经元能引起一缓慢的内向电流 ;并且P物质能明显抑制牛蛙背根神经节神经元γ -氨基丁酸激活电流 ;蛋白激酶C的抑制剂H - 7(5 0ЧM)能阻断此抑制作用。结论　P物质可能通过蛋白激酶C抑制γ -氨基丁酸激活电流     

多巴胺增强培养新生大鼠DRG神经元ATP激活电流

目的 :探讨多巴胺对ATP激活电流的调制作用。方法 :实验在培养的新生大鼠脊髓背根神经节细胞上进行 ,应用全细胞膜片钳技术记录出ATP和多巴胺激活的电流。结果 :在被检的DRG细胞中 ,有 6 2 % (39/ 6 3)的神经元对ATP和多巴胺都敏感。在预加 10 -8,10 -7,10 -6和 10 -5mol/L多巴胺后 ,ATP的激活电流分别增加到 139.7% ,141.5 % ,149.9% ,149.1% ;呈剂量依赖性。用D1的拮抗剂SCH - 2 3390能取消此增强作用 ;在电极中灌注H - 7(PKC ,PKA抑制剂 )也能取消此增强作用。结论 :多巴胺对ATP激活电流的增强作用是多巴胺作用于D1受体 ,通过胞内第二信使 ,使P2X受体通道复合体胞内磷酸化所致。     

大鼠DRG上的P2X3受体在介导外周伤害刺激引起疼痛的作用机制研究

目的探讨P2X3受体在介导外周伤害刺激引起疼痛的作用及作用机制。方法雄性SD大鼠30只,随机分为A、Β、C、D、E组,每组6只。分组：A组正常对照组足底注射生理盐水;B组大鼠足底注射P2X3受体激动剂ATP;C组大鼠足底注射P2X3受体强效激动剂α、β-meATP;D组大鼠足底注射P2X3受体强效激动剂和P2X3受体拮抗剂α、β-meATP＋TNP-ATP,E组大鼠足底注射P2X3受体激动剂和P2X3受体拮抗剂ATP＋TNP-ATP,观察缩脚次数,每5 min作为一个观察单位持续观察一个小时,大鼠DRG急性分离。采用免疫组化的方法分别测定每组DRG上P2X3受体。结果1、大鼠足底注射生理盐水未出现伤害性行为学反应。而ATP、α、β-meATP组大鼠左足底注射约5 min左右出现明显的伤害性行为反应如咬尾、摆尾及缩脚,α、β-meATP组最为明显。两组缩脚次数有显著差异性P〈0.05。而应用抑制剂之后缩脚次数明显减少,A组和D组相比P〈0.05,A组和E组相比P〈0.01。D、E组相比P〈0.05。2、DRG的P2X3受体表达：P2X3在DRG中小神经元细胞的胞体,α、β-meATP组阳性细胞数表达显著占46%、ATP组占35%,生理盐水占28%,TNP-ATP占20%。α、β-meATP组胞浆呈棕褐色,而ATP组胞浆呈棕黄色。A和B组阳性细胞数差异性显著P〈0.05,α、β-meATP组与α、β-meATP-TNP＋ATP组相比阳性细胞数有显著差异P〈0.01。结论DRG上P2X3受体在介导感觉神经的伤害性信息的传递中起重要作用。     

神经病理性痛大鼠背根神经节P2X3受体表达及电生理学特性的改变

目的 观察坐骨神经缩窄性损伤(CCI)致神经病理性痛后大鼠背根节神经元P2X3受体的表达和电生理学特性的变化.方法 应用免疫组化技术观察CCI后不同时间相应节段(L4、L5、L6)脊髓及背根神经节P2X3受体表达的变化;全细胞膜片钳技术观察CCI后不同时间L4、L5、L6节段背根节神经元ATP反应电流的变化.结果 CCI后7、14 d,损伤同侧L4、L5、L6节段背根节P2X3免疫阳性神经元数量明显增加,而且染色加深,相应节段的脊髓背角浅层P2X3免疫反应性亦明显增加.CCI后7、14 d,损伤同侧相应节段背根节产生ATP快反应电流的细胞数量明显增加,电流幅度亦增强.应用非选择性P2X受体拮抗剂Suramin能明显抑制ATP反应电流.结论 坐骨神经缩窄性损伤致神经痛后同侧对应节段的背根节神经元P2X3受体表达明显增加,ATP快反应电流明显增强.     

嘌呤P2X7 受体介导对氯苯丙酸致大鼠 前额皮质蛋白激酶的变化

目的 探讨脑内5- 羟色胺（5-HT）含量下降后大鼠前额皮质受体后信号P38 MAPK、PKC 和 CaMK Ⅱ蛋白和基因表达的变化及P2X7 受体在其中的作用。方法 大鼠分为正常组、对照组、对氯苯丙氨酸 （PCPA）组、P2X7 受体拮抗剂及激动剂干预组。腹腔注射PCPA 使脑内5-HT 合成下降,脑室注射P2X7 受 体拮抗剂和激动剂,采用免疫组织化学、Western blot 和实时荧光定量PCR 检测前额皮质P38 MAPK、PKC 和 CaMK Ⅱ蛋白和mRNA 的表达。结果 与对照组比较,PCPA 组的P38 MAPK 蛋白和mRNA 表达增加,而PKC 和CaMK Ⅱ的蛋白和mRNA 表达水平下降。与PCPA 组比较,P2X7 受体拮抗剂能使P38 MAPK 蛋白和基因 mRNA 表达下降,PKC 和CaMK Ⅱ的蛋白表达水平升高及mRNA 表达水平上升;而P2X7 受体激动剂引起 P38 MAPK 蛋白和mRNA 表达水平升高,PKC 和CaMK Ⅱ的蛋白表达下降和基因mRNA 表达水平下降。结论 P2X7 受体介导了脑内5-HT 下降所致的前额皮质受体后信号P38 MAPK、PKC 和CaMK Ⅱ蛋白和基因表达 的变化。     

多巴胺对大鼠脊髓背根神经节神经元ATP—激活电流的调制作用

目的 :研究多巴胺 (DA)对ATP -激活电流 (IATP)的调制作用。方法 :在大鼠新鲜分离的DRG神经元标本上应用全细胞膜片钳技术 ,记录DA对IATP的影响。结果 :大部分受检细胞 (89.5 % ,77/86 )对ATP敏感 ,10 -6～ 10 -3 mol/LATP可引起剂量依赖性呈明显去敏感的内向电流。在此 77个细胞中 ,预加DA对IATP的影响如下 :在 5 0 .6 % (39/77)的细胞产生抑制作用 ,2 8.6 % (2 2 /77)的细胞产生增强作用 ,其余的无明显作用 (2 0 .8% ,16 /77)。在浓度 10 -7～ 10 -3 mol/L范围DA对IATP的抑制或增强作用依赖于多巴胺的浓度。胞内透析GDP - β -s上述抑制或增强作用可完全被取消。结论 :DA对IATP的抑制作用可能是由于多巴胺受体激活后经G蛋白偶联使ATP(P2X)受体磷酸化所致     

三磷酸腺苷引起大鼠三叉神经节胞内钙离子信号转导机制的研究

目的探讨三磷酸腺苷(ATP)对三叉神经痛大鼠感觉神经元内钙离子浓度([Ca2+]i)的影响及其信号转导机制。方法 SD大鼠眶下神经缩窄造成三叉神经痛模型,造模后1周处死大鼠,取出三叉神经节(TG),分离出完整的小直径神经元(﹤600μm2)用于钙离子成像,通过使用荧光染料来标记相关激动剂,检测毒胡萝卜内酯(Tg,1μmol/L)、咖啡因(Caff,20 mmol/L)和ATP(100μmol/L)作用下TG小直径神经元内[Ca2+]i变化。结果①在正常外液和无钙外液中,在大鼠TG小直径神经元上分别给予Tg、Caff和ATP均能够引起[Ca2+]i不同程度升高;②在无钙外液中,ATP引起的TG神经元[Ca2+]i升高可被Tg可逆性地抑制(n=8,P<0.01);③在无钙外液中,ATP引起的TG神经元[Ca2+]i升高可被P2受体阻断剂苏拉明(suramin,100μmol/L)明显抑制;④在正常外液中,Tg引起TG神经元[Ca2+]i升高,当升高达到最大后再次给予ATP,仍然能引起[Ca2+]i进一步升高。结论在大鼠TG神经元中同时存在IP3敏感钙库和ryanodine敏感钙库。ATP可通过两种途径引起细胞内[Ca2+]i升高,一种途径是激动P2Y受体引起IP3敏感钙库的Ca2+释放,另一种途径是激动P2X受体引起细胞外Ca2+内流。在无钙外液中,ATP引起的TG神经元[Ca2+]i升高是通过IP3敏感钙库释放引起的。     

SKF38393抑制大鼠DRG分离神经元ATP-激活电流

目的 :探讨多巴胺D1受体的选择性激动剂SKF3 83 93HCl对ATP -激活电流的作用。方法 :在大鼠新鲜分离的DRG神经元标本上应用全细胞膜片钳技术 ,记录SKF3 83 93对ATP -激活电流的作用。结果 :大部分受检细胞 ( 87.5% ,77/ 88)对ATP敏感 ,10 - 6 ～ 10 - 3 mol/LATP可引起剂量依赖性呈明显去敏感的内向电流。在此77个细胞中 ,预加SKF3 83 93可引起三类反应 :①外向电流 ( 7.8% ,6/ 77) ;②内向电流 ( 2 6.0 % ,2 0 / 77) ;③无反应( 66.2 % ,51/ 77)。与ATP -激活电流相比 ,SKF3 83 93 -激活电流幅值小 ,无明显去敏感现象。预加SKF3 83 93 3 0～ 60s对ATP -激活电流的影响如下 :在 74.0 % ( 57/ 77)的细胞产生抑制作用 ,15.6% ( 12 / 77)的细胞产生增强作用 ,其余的无明显作用 ( 10 .4% ,8/ 77) ,本文主要针对此抑制作用进行探讨。此种抑制作用与SKF3 83 93本身是否引起或引起的是内向或外向电流无关。在浓度 10 - 9～ 10 - 4mol/L范围SKF3 83 93对 10 - 4mol/LATP -激活电流的抑制作用依赖于SKF3 83 93的浓度。胞内透析H 7上述抑制作用可完全被取消 ,而胞内透析H9此抑制作用依旧存在。结论 :SKF3 83 93对ATP -激活电流的抑制作用可能是由于D1受体激活后经G蛋白偶联及PKC途径使ATP受体磷酸化所致。     

NPA抑制大鼠DRG分离神经元ATP-激活电流

目的　本研究主要探讨多巴胺D2受体的选择性激动剂R(- ) -NPA对ATP -激活电流的调制。方法　在大鼠新鲜分离的DRG神经元标本上应用全细胞膜片钳技术 ,观察了NPA对ATP -激活电流的作用。结果　大部分受检细胞 (87.3% ,48/ 5 5 )对ATP敏感 ,10 -6～ 10 -3 mol/LATP可引起剂量依赖性呈明显去敏感的内向电流。在此45个细胞中 ,预加NPA可引起三类反应 :(1)外向电流 (6 .3% ,3/ 48) ;(2 )内向电流 (2 5 .0 % ,12 / 48)和 (3)无反应 (6 8.8% ,33/ 48)。与ATP -激活电流相比 ,NPA -激活电流幅值小 ,无明显去敏感现象。预加NPA 30～ 6 0s对ATP -激活电流的影响如下 :在 91.7% (4 4/ 48)的细胞产生抑制作用 ,其余的无明显作用 (8.3% ,4/ 48)。此种抑制作用与NPA本身是否引起或引起的是内向或外向电流无关。在浓度 10 -7～ 10 -5mol/L范围NPA对 10 -4 mol/LATP -激活电流的抑制作用依赖于NPA的浓度。胞内透析GDP - β -s上述抑制作用可完全被取消。 结论　NPA对ATP -激活电流的抑制作用可能是由于D2受体激活后经G蛋白偶联及相应胞内转导途径而使ATP受体磷酸化所致。     

木犀草素对人白血病HL-60细胞内蛋白激酶C的抑制作用

目的　观察木犀草素对HL- 60细胞内蛋白激酶C活性的影响。方法　采用台盼蓝拒染法,在不同条件下测定细胞增殖的抑制率。PKC活性通过测定转移到CK2 底物上的[γ 32P]ATP的32P的放射性活度来检测。结果　木犀草素能够显著地抑制HL- 60细胞内PKC的活性并呈剂量依赖性关系,其IC50为2.38μmol/L,作用效果强于阳性对照槲皮素(IC50=2.54μmol/L)。结论　木犀草素作为一种细胞内的PKC抑制剂具有潜在的抗肿瘤临床应用价值。