不同年龄大鼠坐骨神经损伤后睫状神经营养因子对脊髓组织中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达的影响

背景天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3是一种促进细胞凋亡的半胱氨酸蛋白酶,睫状神经营养因子具有多种生物活性,能保护损伤后多种神经元特别是运动神经元,减少神经细胞损伤的发生.目的观察睫状神经营养因子对天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3在坐骨神经损伤后不同年龄大鼠脊髓组织中的表达以及在不同年龄阶段的变化规律和调控特点.设计随机对照动物实验.单位解放军第三军医大学野战外科研究所大坪医院超声科、第五研究室.材料实验于2000-04/2001-12在解放军第三军医大学野战外科研究所完成.Wistar大鼠,体质量30～100 g的幼年大鼠(鼠龄20 d)、200～350 g的成年大鼠(鼠龄4个月)、400～800 g的老年大鼠(鼠龄18～24个月)各270只,雌雄不限,共810只.方法[1]实验动物分组各年龄组大鼠随机分为正常组(n=18)、睫状神经营养因子组(n=126)和生理盐水组(n=126),睫状神经营养因子组和生理盐水组分为术后1 d、3 d、1周、2周、4周、8周、12周组.[2]动物模型制作睫状神经营养因子组和生理盐水组切除2mm右侧坐骨神经,用硅胶管连接近、远侧神经残端制作神经再生小室,睫状神经营养因子组再生小室内注入25 mg/L重组睫状神经营养因子15 μL,生理盐水组再生小室内注入生理盐水15μL.[3]待测标本的制作及检测分别取各组动物6只,取脊髓L3-5节段,进行天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3免疫组织化学检测、天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性检测和Western blotting检测.主要观察指标[1]免疫组织化学检测的各组大鼠脊髓天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3的表达.[2]Western blotting检测脊髓天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3的分布与表达强度变化.[3]天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性变化.结果810只大鼠进入结果分析.[1]免疫组织化学检测各组大鼠脊髓天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3的表达损伤后各年龄组生理盐水组伤侧神经元天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3染色表达增强,伤后2周、4周明显增多、增强,8周、12周较少神经元表达阳性;睫状神经营养因子组损伤后各年龄组天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达增强,伤后2周、4周最为明显.[2]Western blotting检测脊髓天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3的分布与表达强度变化各年龄正常组天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达差异无显著性意义(P＞0.05).与同龄正常组及对侧未伤侧比较,各年龄组生理盐水组及睫状神经营养因子组损伤后1周、2周、4周天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达增强,差异有显著性意义(P＜0.05～0.01);睫状神经营养因子组天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3幼年于损伤后1周、2周、4周,成年于2周、4周,老年于4周表达较生理盐水组减弱,差异有显著性意义(P＜0.05～0.01).各组对侧未伤侧与正常组比较,差异无显著性意义(P＞0.05).[3]天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性变化幼年、成年、老年生理盐水组伤侧脊髓天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性升高,各时相点幼年大鼠天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性高于老年组及成年组(P＜0.05～0.01),幼年、成年、老年组睫状神经营养因子组天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性低于生理盐水组(P＜0.05～0.01).损伤后生理盐水组及睫状神经营养因子组对侧未伤侧天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性,除幼年伤后12周较正常组低外(P＜0.05),其余各组与正常组比较,差异无显著性意义(P＞0.05).结论坐骨神经损伤后不同鼠龄大鼠脊髓组织中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3蛋白表达及活性增高,外源性睫状神经营养因子可减少脊髓神经元中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3蛋白表达及活性,起保护脊髓神经细胞的作用,其作用在幼年组、成年组及老年组依次减弱.     

不同年龄大鼠脊髓组织中天冬氨酸特异酶切半胱氨酸蛋白酶3的活性及坐骨神经损伤后的表达变化

目的:观察不同年龄大鼠脊髓组织中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达情况及其在坐骨神经损伤后的表达变化,并分析其与脊髓细胞凋亡的关系。方法:实验于2004-03/09在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所完成。选择Wistar大鼠324只,成年、幼年、老年大鼠各108只。不同年龄组动物均随机分为对照组和手术组,对照组12只为非手术组;手术组共96只,分为术后1d,3d,1周、2周、3周、4周、5周、6周8个时间组,每组12只。各手术组大鼠均在戊巴比妥钠麻醉后,切除股方肌下缘约6mm的坐骨神经。大鼠脊髓细胞凋亡情况采用原位缺口末端标记法及流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双标检测法,原位缺口末端标记阳性细胞及AnnexinⅤ阳性细胞即凋亡细胞;大鼠脊髓组织中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达情况应用免疫组化法检测;大鼠脊髓组织中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性应用ActivityAssay试剂盒检测。结果:所有大鼠全部进入结果分析,无脱失。①脊髓细胞凋亡情况的原位缺口末端标记及流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双标检测结果:正常成年及老年大鼠未见明显标记的阳性细胞,正常幼年大鼠可见个别阳性标记细胞,坐骨神经损伤诱导脊髓神经细胞凋亡的高发时间为伤后2～4周,老年大鼠细胞凋亡持续时间较长。各手术组正常侧与对照组相比差异无显著性意义(P>0.05)。不同年龄大鼠AnnexinⅤ阳性细胞出现时间均早于原位缺口末端标记阳性细胞。②天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性及表达情况比较:幼年正常组天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达及天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性均高于成年及老年大鼠(P<0.01),损伤后各年龄组均有明显变化,幼年正常组损伤后1d天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3开始升高,升高时间早于成年及老年组。各手术组正常侧与对照组相比差异无显著性意义(P>0.05)。结论:脊髓细胞凋亡情况与天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性测定结果有较好的相同改变趋势,提示天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3的活化是细胞凋亡的早期生物化学指标。不同年龄大鼠正常时脊髓组织中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达以其在坐骨神经损伤后的表达变化存在差异,说明针对不同年龄段发生的周围神经损伤,其促进神经再生调控时期不同。     

不同年龄大鼠脊髓组织中天冬氨酸特异酶切半胱氨酸蛋白酶3的活性及坐骨神经损伤后的表达变化

目的：观察不同年龄大鼠脊髓组织中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达情况及其在坐骨神经损伤后的表达变化，并分析其与脊髓细胞凋亡的关系。 方法：实验于2004-03／09在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所完成。选择Wistar大鼠324只，成年、幼年、老年大鼠各108只。不同年龄组动物均随机分为对照组和手术组，对照组12只为非手术组；手术组共96只．分为术后1d，3d．1周、2周、3周、4周、5周、6周8个时间组，每组12只。各手术组大鼠均在戊巴比妥钠麻醉后，切除股方肌下缘约6mm的坐骨神经。大鼠脊髓细胞凋亡情况采用原位缺口末端标记法及流式细胞仪Annexin V／PI双标检测法，原位缺口末端标记阳性细胞及Annexin V阳性细胞即凋亡细胞；大鼠脊髓组织中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达情况应用免疫组化法检测；大鼠脊髓组织中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性应用Activity Assay试剂盒检测。 结果：所有大鼠全部进入结果分析，无脱失。①脊髓细胞凋亡情况的原位缺口末端标记及流式细胞仪Annexin V／PI双标检测结果：正常成年及老年大鼠未见明显标记的阳性细胞，正常幼年大鼠可见个别阳性标记细胞，坐骨神经损伤诱导脊髓神经细胞凋亡的高发时间为伤后2-4周，老年大鼠细胞凋亡持续时间较长。各手术组正常侧与对照组相比差异无显著性意义（P〉0．05）。不同年龄大鼠Annexin V阳性细胞出现时间均早于原位缺口末端标记阳性细胞。②天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性及表达情况比较：幼年正常组天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达及天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性均高于成年及老年大鼠（P〈0．01），损伤后各年龄组均有明显变化，幼年正常组损伤后1d天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3开始升高，升高时间早于成年及老年组。各手术组正常侧与对照组相比差异无显著性意义（P〉0．05）。 结论：脊髓细胞凋亡情况与天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3活性测定结果有较好的相同改变趋势，提示天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3的活化是细胞凋亡的早期生物化学指标。不同年龄大鼠正常时脊髓组织中天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶3表达以其在坐骨神经损伤后的表达变化存在差异，说明针对不同年龄段发生的周围神经损伤，其促进神经再生调控时期不同。     

大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达及意义 继发性脊髓损伤适宜干预时间窗的选择

背景：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族被认为是细胞凋亡的执行因子，脊髓损伤后可发生神经细胞凋亡。目的：观察大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达变化，探讨其与神经细胞凋亡发生的关系，为判定减轻继发性脊髓损伤的适宜干预时间窗提供依据。设计：自身对照、相互对照动物实验。单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院创伤外科、骨科。材料：实验于2001-09／12在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室完成。54只SD大鼠，雌雄不限，体质量220～250g，由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供。方法：①动物模型建立及分组：将大鼠分为对照组和损伤组，对照组仅做T8，T9椎板切除术，损伤组于4、8h和1，2，3，7，14和21d取材共9组，每组6只。以30g／L戊巴比妥钠腹腔麻醉后，按Nystrom法暴露T8，T9节段胸髓，将50g重物通过2．2mm&;#215;5．0mm弧型光滑金属垫片压迫该段脊髓后正中部5min，损伤后每天10：00，16：00和22：003次人工膀胱排尿，直至建立反射性膀胱排空。②取材及切片准备：在脊髓损伤后各时间点完整取出脊髓全长，将每组4只损伤段脊髓组织块，长约8mm，石蜡包埋，连续切片，分别行苏木素伊红染色、免疫组化及原位末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法（TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling，TUNEL）标记；每组2只在冰上处死，将损伤脊髓中心组织置入液氮罐中保存备用。③检测指标：以免疫组化法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达，以逆转录-聚合酶链反应半定量测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3mRNA的表达变化，以TUNEL法检测神经细胞的凋亡水平，并以直线相关分析半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达和神经细胞凋亡的相关性。主要观察指标：①光镜下各组大鼠脊髓损伤观察。②免疫组化结果。③各组大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达变化。④各组大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡情况及与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达的相关性。结果：纳人结果分析的各组动物数均为6只。①光镜下各组大鼠脊髓损伤观察结果：损伤段1h有广泛出血；4～8h脊髓结构开始破坏，大量的神经元死亡；24h脊髓破坏严重；7-21d损伤范围确定，脊髓内有空洞形成。②免疫组化检测的各组大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的结果：正常大鼠脊髓神经细胞中很少有半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达（2．1&;#177;0．5）；脊髓损伤后8h，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达阳性的神经细胞明显增加（89．2&;#177;10．5），3d达到高峰（189．6&;#177;12．7）；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的阳性细胞与凋亡细胞出现的时限相似，呈正相关（r=0．941）。⑧逆转录-聚合酶链反应检测的各组大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的结果：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3mRNA4h开始增高（0．442&;#177;0．024），48h达到高峰（0．634&;#177;0．028），7d后恢复正常（0．351&;#177;0．013），早于凋亡出现的时期，与神经细胞凋亡水平呈正相关（r=0．622）。④TUNEL标记及计数的各组大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的结果：对照组及4h组仅见偶染细胞，8h后开始出现阳性细胞，主要位于灰质中；此后阳性细胞逐渐增多，3d达到高峰，7d灰质中凋亡染色的阳性细胞逐渐减少，主要在周围白质中，14和21d可见少量的阳性细胞。结论：在正常的脊髓组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3是以活性很低的酶原形式存在；大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达增强，8h开始大量表达，24-48h达到高峰，与TUNEL所检测的阳性凋亡细胞在时间上相重叠，从半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞先后出现的区域上看，与脊髓损伤阳性凋亡细胞一致，可见半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3参与了脊髓损伤细胞凋亡的调节。从本实验可以看出，从脊髓损伤后到半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活化这段时间是脊髓损伤干预细胞凋亡、减轻继发性脊髓损伤治疗时间窗，应用基因干预或特异性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂宜在48h内应用。     

大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达及意义继发性脊髓损伤适宜干预时间窗的选择

背景半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族被认为是细胞凋亡的执行因子,脊髓损伤后可发生神经细胞凋亡.目的观察大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达变化,探讨其与神经细胞凋亡发生的关系,为判定减轻继发性脊髓损伤的适宜干预时间窗提供依据.设计自身对照、相互对照动物实验.单位华中科技大学同济医学院附属同济医院创伤外科、骨科.材料实验于2001-09/12在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室完成.54只SD大鼠,雌雄不限,体质量220～250g,由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供.方法①动物模型建立及分组将大鼠分为对照组和损伤组,对照组仅做Ts,T9椎板切除术,损伤组于4、8 h和1,2,3,7,14和21 d取材共9组,每组6只.以30 g/L戊巴比妥钠腹腔麻醉后,按Nystrom法暴露T8,T9节段胸髓,将50 g重物通过2.2 mm×5.0 mm弧型光滑金属垫片压迫该段脊髓后正中部5 min,损伤后每天1000,1600和2200 3次人工膀胱排尿,直至建立反射性膀胱排空.②取材及切片准备在脊髓损伤后各时间点完整取出脊髓全长,将每组4只损伤段脊髓组织块,长约8 mm,石蜡包埋,连续切片,分别行苏木素伊红染色、免疫组化及原位末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP-biotin nick endlabeling,TUNEL)标记;每组2只在冰上处死,将损伤脊髓中心组织置入液氮罐中保存备用.③检测指标以免疫组化法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达,以逆转录-聚合酶链反应半定量测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 mRNA的表达变化,以TUNEL法检测神经细胞的凋亡水平,并以直线相关分析半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达和神经细胞凋亡的相关性.主要观察指标①光镜下各组大鼠脊髓损伤观察.②免疫组化结果.③各组大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达变化.④各组大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡情况及与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达的相关性.结果纳入结果分析的各组动物数均为6只.①光镜下各组大鼠脊髓损伤观察结果损伤段1 h有广泛出血;4～8 h脊髓结构开始破坏,大量的神经元死亡;24 h脊髓破坏严重;7～21 d损伤范围确定,脊髓内有空洞形成.②免疫组化检测的各组大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的结果正常大鼠脊髓神经细胞中很少有半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达(2.1±0.5);脊髓损伤后8 h,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达阳性的神经细胞明显增加(89.2±10.5),3 d达到高峰(189.6±12.7);半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的阳性细胞与凋亡细胞出现的时限相似,呈正相关(r=0.941).③逆转录-聚合酶链反应检测的各组大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的结果半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 mRNA 4 h开始增高(0.442±0.024),48 h达到高峰(0.634±0.028),7 d后恢复正常(0.351±0.013),早于凋亡出现的时期,与神经细胞凋亡水平呈正相关(~0.622).4④rUNEL标记及计数的各组大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的结果对照组及4 h组仅见偶染细胞,8 h后开始出现阳性细胞,主要位于灰质中;此后阳性细胞逐渐增多,3 d达到高峰,7 d灰质中凋亡染色的阳性细胞逐渐减少,主要在周围白质中,14和21 d可见少量的阳性细胞.结论在正常的脊髓组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3是以活性很低的酶原形式存在;大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达增强,8 h开始大量表达,24～48 h达到高峰,与TUNEL所检测的阳性凋亡细胞在时间上相重叠,从半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞先后出现的区域上看,与脊髓损伤阳性凋亡细胞一致,可见半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3参与了脊髓损伤细胞凋亡的调节.从本实验可以看出,从脊髓损伤后到半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活化这段时间是脊髓损伤干预细胞凋亡、减轻继发性脊髓损伤治疗时间窗,应用基因干预或特异性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂宜在48 h内应用.     

不同剂量睫状神经营养因子对大鼠坐骨神经损伤后再生的影响

目的：探讨不同剂量睫状神经营养因子(ciliary neumtmphic factor，CNTF)对大鼠坐骨神经损伤后桥接再生影响。方法：选用30只大鼠分5组，每组6只，切除左侧坐骨神经6mm，用硅胶管10mm桥接坐骨神经的两个断端。其中治疗组CNTF一次给药量分别为500，300，100，50ng，对照组给生理盐水5μL。术后1个月活杀动物，观察坐骨神经近、远心端，新生神经纤维，脊髓，运动终板的变化。结果：电镜结果显示300和500ng治疗组，新生雪旺细胞及神经纤维较多。单个雪旺细胞内夹有神经纤维，髓鞘厚度均匀。其他各组有少许髓鞘样结构。新生神经纤维细小。光镜观察发现：300，500ng治疗组新生神经纤维较成熟，排列整齐。对照组新生的坐骨神经细小，远端有变性改变。结论：CNTF对坐骨神经损伤有促进再生作用，用量最好是300～500ng。     

三七总皂苷干预脊髓损伤大鼠诱导型一氧化氮合酶及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的变化

目的：观察三七总皂苷注射液对大鼠脊髓损伤后诱导型一氧化氮合酶及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的作用机制。方法：实验于2005—06／1l在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成。将64只SD大鼠数字表法随机分为损伤组和三七总皂苷组（n=32），2组按存活时间分为1，3，7，14d4个时间点，每个时问点8只。所有大鼠采用Allen’s法制备脊髓中度损伤模型（致伤能量为40g&;#183;cm），三七总皂苷组伤后30min腹腔注射50mg／L三七总皂苷100mg／kg，伤后2h及4h再次给予50mg／kg，以后1次／d，剂量200mg／kg，连用12d。损伤组相同时间点腹腔注射等体积生理盐水。2组均于预定对间点处死大鼠，取出伤段脊髓（以损伤处为中心，长约10mm），用苏术精-伊红染色观察损伤脊髓组织病理变化，免疫组化染色检测诱导型一氧化氮合酶及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞率。结果：64只大鼠全部进入结果分析。①苏木精-伊红染色光镜下发现脊髓组织病理学改变三七总皂苷组明显轻于损伤组。②诱导型一氧化氮合酶阳性细胞率：三七总皂苷组在伤后1，3，7，14d均低于损伤组[（21．38&;#177;3．69）％。（36．24&;#177;3．27）％，（30．56&;#177;2．89）％．（21．64&;#177;5.31）％；（39．48&;#177;3．78）％。（58，69&;#177;5．67）％。（68．97&;#177;5．34）％，（40．35&;#177;4．36）％。t=9．692，9．701，17．893，3．171，P〈0．05]。⑧半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞率：三七总皂苷组在伤后1，3，7，14d均低于损伤组[（26．29&;#177;3．21）％，（35，42&;#177;2．25）％，（48．58&;#177;2．64）％。（23．72&;#177;3．26）％：（32．43&;#177;2，69）％，（46、18&;#177;3．07）％，（60．31&;#177;5．35）％，（31，98&;#177;4、80）％，t=4．147。7．996，5．561，11．231，P〈0．05]。结论：三七总皂苷注射液能抑制脊髓损伤后诱导型一氧化氮合酶及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达，从而减轻细胞损伤和凋亡。     

电针对大鼠坐骨神经损伤后脊髓运动神经元睫状神经营养因子水平的影响

目的探讨电针对大鼠坐骨神经损伤后脊髓运动神经元睫状神经营养因子 (ciliary neurotrophic factor,CNTF)的影响.方法取 Wistar 大鼠 56只 ,行左侧坐骨神经切断外膜缝合.电针组每天穴位电针 20 min,模型组不作任何处理.分别于术后 7,14,21和 28 d测定脊髓前角 CNTF阳性神经元计数、神经元平均积分光密度及 4周时损伤神经电生理.结果坐骨神经损伤后损伤脊髓前角 CNTF阳性神经元数量明显少于正常对照组,电针组损伤侧脊髓前角内 CNTF阳性神经元数量在各时间点明显高于模型组(P< 0.05),14 d时电针组伤侧脊髓前角内 CNTF阳性神经元数量为 (53± 11)个,模型组为 (29± 9)个.同时模型组神经元内 CNTF阳性神经元平均积分光密度在各时间点与正常组比较明显降低,在 14 d最低为 273.2± 33.7.而电针组 CNTF在各个时间点明显高于模型组(P< 0.05); 28 d康复组神经肌肉动作电位、运动神经传导速度均优于模型组 (P< 0.01).结论电针可提高损伤神经神经元内源性 CNTF水平,减少神经元变性、死亡,促进神经电生理的恢复.     

电针对坐骨神经损伤大鼠背根节胶质源性神经营养因子表达的影响

目的:探讨电针对大鼠坐骨神经损伤后相应背根节神经胶质细胞源性神经营养因子(glialcelllinederivedneurotrophicfactor,GDNF)表达的影响,以探讨电针对周围神经损伤的保护作用。方法:Wistar大鼠45只,5只为正常组,余40只行左侧坐骨神经切断外膜缝合。电针组每天穴位电针20min,模型组不作任何处理。再分4个亚组,每组5例。分别于术后1,2,4和8周处死,取材L5节段损伤侧背根节,免疫组化染色观测GDNF表达,并观察4周时感觉神经电生理。结果:电针组同侧背根节神经元GDNF表达伤后2周达到高峰,积分光密度值为0.699±0.053,与模型组0.419±0.093比较有显著意义(P<0.05)。伤后8周恢复正常对照水平;模型组背根节细胞GDNF表达伤后2周达到高峰保持至8周。相应的感觉神经潜伏期检查8周时电针组(0.56±0.89)ms,明显短于模型组(0.78±0.12)ms,且传导速度明显增加,波幅增大。结论:电针促进神经功能的恢复可能是通过增强脊神经节GDNF的表达而实现。     

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 mRNA在淋巴滞留性脑病大鼠脑皮质及海马的表达

目的：探讨半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3mRNA在淋巴滞留性脑病大鼠脑皮质及海马中的表达情况及其与神经元凋亡之间的关系。方法：选取成年雄性Wistar大鼠88只，随机分为脑淋巴引流阻断组40只、假手术组40只及正常对照组8只。脑淋巴引流阻断组和假手术组分为术后1，3，5，7，14d5个时间点，每个时间点8只。脑淋巴引流阻断组建立淋巴滞留性脑病动物模型，在损伤后各时间点取颞顶皮质、海马区脑组织。假手术组只分离和暴露淋巴结，但不结扎淋巴管，亦不摘除淋巴结。用半定量反转录-聚合酶链反应方法观察淋巴滞留性脑病大鼠损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3mRNA的表达情况。结果 88只大鼠均进入结果分析。①在颞顶皮质，Caspase3mRNA在淋巴阻塞后3d内表达上调，以第1天表达最高，淋巴阻塞后3d内Caspase 3mRNA表达比假手术组及对照组高，且有统计学意义（F=29．892，P=0．001〈0．01）。淋巴阻塞3d后表达接近正常对照及假手术组。对照组与假手术组之间差异无统计学意义。②在海马，Caspase 3mRNA较颞顶皮质表达上调更明显，以第1天表达最高，淋巴阻塞后5d内Caspase-3mRNA表达比假手术组及对照组高，差异有统计学意义（P〈0．05），5d后表达接近正常对照及假手术组。结论：在淋巴滞留性脑病大鼠模型中神经元凋亡的发生可能与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3mRNA的激活有关。     

大鼠坐骨神经损伤后脊髓运动神经元捷状神经营养因子的表达及针刺干预后的变化

目的:观察了坐骨神经损伤后脊髓运动神经元睫状神经营养因子(ciliarynewrotrophicfactors,CNTF)表达水平及针刺、神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)干预后的相关变化,旨在探讨针刺促进周围神经损伤修复的机制。方法:选用160只Wister大鼠,分电针组、药物组(NGF)、手针及模型、假手术组5组。钳夹坐骨神经制造周围神经损伤模型,采用免疫组织化学染色同光、电镜相结合方法,利用图像分析系统检测不同干预手段、对不同时间点脊髓CNTF阳性运动神经元的计数和吸光度水平。结果:坐骨神经损伤后腰段脊髓CNTF阳性运动神经元数量和吸光度水平7d犤模型组CNTF阳性神经元数为(61.42±0.42)%犦开始下降,14d犤50.94±2.96)%犦明显下降,21d犤42.72±4.51)%犦达最低水平,28d犤49.37±2.70犦开始恢复,伤侧比对侧更为明显(P<0.05);针刺及NGF治疗,能降低神经元死亡数量、减少其吸光度下降程度(P<0.05),并能减轻神经元肿胀变性的形态学变化。结论:针刺及NGF能促进脊髓运动神经元存活、加快内源性CNTF水平的恢复;能减轻神经元的变性坏死程度,减少神经元的死亡。     

兔坐骨神经细胞微囊化处理移植至大鼠损伤脊髓对神经生长因子表达变化的影响

目的：观察并比较兔坐骨神经组织细胞微囊化处理与单纯兔坐骨神经组织细胞移植至大鼠损伤脊髓及大鼠单纯脊髓损伤3组神经生长因子表达的变化。方法：实验于2003-05／2005-05在九江学院医学科研中心完成。①制备不同移植材料：取10只成年家兔双侧完整坐骨神经制备细胞悬液；兔坐骨神经组织细胞悬液微囊化处理，将细胞浓度调整为（2．0-2．5）&;#215;10^6L^-1后与15g/L海藻酸钠生理盐水溶液混合，经双腔喷头将海藻酸钠-坐骨神经组织细胞悬液混合液喷入20mmol/L的氯化钡生理盐水溶液中，加入生理盐水洗涤2次。②脊髓损伤大鼠模型制作：取健康SD大鼠90只，随机分为3组，微囊化兔坐骨神经组织细胞悬液组（微囊化组）；单纯兔坐骨神经组织细胞悬液组（单纯悬液组）和单纯损伤组，每组30只。健康SD大鼠腹腔麻醉（30mg／kg）成功后，以T10为中心，暴露T10棘突及椎板，作脊髓右半侧横向切开，并去除约2min脊髓组织。立即在损伤腔内植入约2mm&;#215;2mm&;#215;2mm的明胶海绵作为填充支架，微囊化组在明胶海绵上吸附10μL微囊化兔坐骨神经组织细胞悬液；单纯悬液组在明胶海绵上吸附10μL单纯兔坐骨神经组织细胞悬液；单纯损伤组不做任何移植。③神经生长因子检测：于移植后1，3，7，14，28d，取出大鼠脊髓损伤平面为中心的2cm脊髓标本，每组6个标本共18张切片，进行免疫组织化学染色（SABC法），神经生长因子染色以细胞浆呈明显的棕黄色为阳性染色。分别计算每平方毫米阳性神经细胞数。 结果：90只大鼠全部进入结果分析。①各组神经生长因子阳性神经元测定结果：微囊组在1，3，7，14，28d均高于单纯损伤组和单纯悬液组；在第7，14，28天明显高于单纯损伤组和单纯悬液组[7d：（28．55&;#177;2．26），（7．65&;#177;3．35），（19．35&;#177;．2．39）个／mm^2；14d：（30．52&;#177;3．51），（8．10&;#177;2．45）（20．45&;#177;3．45）个／mm^2；28d：（27．50&;#177;4．50）。（6．59&;#177;3．85）．（17．50&;#177;4．65）个／mm^2，P〈0．01或0．05]；第14天达到顶峰（P〈0．01）。②神经生长因子免疫组织化学染色结果：微囊组可见大量棕黄色颗粒，主要分布在脊髓前角神经元和胶质细胞，白质和灰质也可见阳性颗粒。 结论：兔坐骨神经组织细胞悬液移植对大鼠脊髓损伤修复有明显的促进作用，微囊化处理后大鼠损伤脊髓神经生长因子表达高于单纯细胞悬液移植和单纯损伤组，更有利于损伤脊髓的再生和修复。     

兔坐骨神经细胞微囊化处理移植至大鼠损伤脊髓对神经生长因子表达变化的影响

目的:观察并比较兔坐骨神经组织细胞微囊化处理与单纯兔坐骨神经组织细胞移植至大鼠损伤脊髓及大鼠单纯脊髓损伤3组神经生长因子表达的变化。方法:实验于2003-05/2005-05在九江学院医学科研中心完成。①制备不同移植材料:取10只成年家兔双侧完整坐骨神经制备细胞悬液;兔坐骨神经组织细胞悬液微囊化处理,将细胞浓度调整为(2.0～2.5)×106L-1后与15g/L海藻酸钠生理盐水溶液混合,经双腔喷头将海藻酸钠-坐骨神经组织细胞悬液混合液喷入20mmol/L的氯化钡生理盐水溶液中,加入生理盐水洗涤2次。②脊髓损伤大鼠模型制作:取健康SD大鼠90只,随机分为3组,微囊化兔坐骨神经组织细胞悬液组(微囊化组);单纯兔坐骨神经组织细胞悬液组(单纯悬液组)和单纯损伤组,每组30只。健康SD大鼠腹腔麻醉(30mg/kg)成功后,以T10为中心,暴露T10棘突及椎板,作脊髓右半侧横向切开,并去除约2mm脊髓组织。立即在损伤腔内植入约2mm×2mm×2mm的明胶海绵作为填充支架,微囊化组在明胶海绵上吸附10μL微囊化兔坐骨神经组织细胞悬液;单纯悬液组在明胶海绵上吸附10μL单纯兔坐骨神经组织细胞悬液;单纯损伤组不做任何移植。③神经生长因子检测:于移植后1,3,7,14,28d,取出大鼠脊髓损伤平面为中心的2cm脊髓标本,每组6个标本共18张切片,进行免疫组织化学染色(SABC法),神经生长因子染色以细胞浆呈明显的棕黄色为阳性染色,分别计算每平方毫米阳性神经细胞数。结果:90只大鼠全部进入结果分析。①各组神经生长因子阳性神经元测定结果:微囊组在1,3,7,14,28d均高于单纯损伤组和单纯悬液组;在第7,14,28天明显高于单纯损伤组和单纯悬液组犤7d:(28.55±2.26),(7.65±3.35),(19.35±2.39)个/mm2;14d:(30.52±3.51),(8.10±2.45)(20.45±3.45)个/mm2;28d:(27.50±4.50),(6.59±3.85),(17.50±4.65)个/mm2,P<0.01或0.05犦;第14天达到顶峰(P<0.01)。②神经生长因子免疫组织化学染色结果:微囊组可见大量棕黄色颗粒,主要分布在脊髓前角神经元和胶质细胞,白质和灰质也可见阳性颗粒。结论:兔坐骨神经组织细胞悬液移植对大鼠脊髓损伤修复有明显的促进作用,微囊化处理后大鼠损伤脊髓神经生长因子表达高于单纯细胞悬液移植和单纯损伤组,更有利于损伤脊髓的再生和修复。     

大鼠脊髓半横断损伤后神经生长因子、脑源性神经营养因子及神经营养因子3的表达变化

目的：观察脊髓半横断损伤后早期不同时间神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3的表达变化。方法：实验于2005-07／12在解放军总医院神经外科实验室完成。取成年清洁级雄性SD大鼠，体质量（250&;#177;20）g。将24只SD大鼠按双盲法随机分为2组，对照组6只，仅进行至椎板切除，即行切口关闭，不损伤脊髓。损伤组18只，3％戊巴比妥钠腹腔麻醉后，T10处椎板切开后，在T9～T10间用虹膜刀片横断半侧脊髓。同侧后肢呈现软瘫，刺激无反应后，关闭切口。分别于伤后3，7，21d不同时间点取材，每个时间点6只。取损伤位点尾侧段T10节段制作冰冻切片，运用神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3兔抗血清以免疫组化ABC法染色。观察并计数脊髓半横断损伤后尾侧端腹角神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3的阳性神经元数。组间比较均采用q检验。结果：①神经生长因子、脑源性神经营养因子主要分布于正常大鼠脊髓腹角神经元细胞浆，神经营养因子3分布于脊髓腹角神经元细胞核、胞浆。②损伤后3，7，21d腹角脑源性神经营养因子和神经营养因子3阳性神经元数均较对照组明显增加[（15．48&;#177;3．20）。（12．59&;#177;2．03），（11．33&;#177;1．92），（7．31&;#177;1．54）；（16．73&;#177;3．30），（11．15&;#177;2．85）。（13．20&;#177;3．39）。（6．00&;#177;1．50），（P〈0．01）1，术后3d时达高峰，随伤后时间的延长进行性减少。⑧损伤后3，7，21d神经生长因子阳性神经元数较对照组明显增加[（10．63&;#177;2．90），（14．07&;#177;2．37），（9．35&;#177;3．50），（4．00&;#177;0．63）。（P〈0．01）]，术后7d时达高峰，3d与21d比较差异无显著性意义。结论：脊髓半横断损伤后神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3表达明显增加，提示它们可能在脊髓半横断损伤早期修复中发挥作用。     

大鼠脊髓半横断损伤后神经生长因子、脑源性神经营养因子及神经营养因子3的表达变化

目的:观察脊髓半横断损伤后早期不同时间神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3的表达变化。方法:实验于2005-07/12在解放军总医院神经外科实验室完成。取成年清洁级雄性SD大鼠,体质量(250±20)g。将24只SD大鼠按双盲法随机分为2组,对照组6只,仅进行至椎板切除,即行切口关闭,不损伤脊髓。损伤组18只,3%戊巴比妥钠腹腔麻醉后,T10处椎板切开后,在T9～T10间用虹膜刀片横断半侧脊髓。同侧后肢呈现软瘫,刺激无反应后,关闭切口。分别于伤后3,7,21d不同时间点取材,每个时间点6只。取损伤位点尾侧段T10节段制作冰冻切片,运用神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3兔抗血清以免疫组化ABC法染色。观察并计数脊髓半横断损伤后尾侧端腹角神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3的阳性神经元数。组间比较均采用q检验。结果:①神经生长因子、脑源性神经营养因子主要分布于正常大鼠脊髓腹角神经元细胞浆,神经营养因子3分布于脊髓腹角神经元细胞核、胞浆。②损伤后3,7,21d腹角脑源性神经营养因子和神经营养因子3阳性神经元数均较对照组明显增加[(15.48±3.20),(12.59±2.03),(11.33±1.92),(7.31±1.54);(16.73±3.30),(11.15±2.85),(13.20±3.39),(6.00±1.50),(P<0.01)],术后3d时达高峰,随伤后时间的延长进行性减少。③损伤后3,7,21d神经生长因子阳性神经元数较对照组明显增加[(10.63±2.90),(14.07±2.37),(9.35±3.50),(4.00±0.63),(P<0.01)],术后7d时达高峰,3d与21d比较差异无显著性意义。结论:脊髓半横断损伤后神经生长因子、脑源性神经营养因子和神经营养因子3表达明显增加,提示它们可能在脊髓半横断损伤早期修复中发挥作用。     

睫状神经营养因子在神经损伤及修复中的地位

背景:睫状神经营养因子广泛分布于神经系统,具有广谱营养作用.目的:综述国内外关于睫状神经营养因子在神经损伤及修复中的地位与应用前景.方法:计算机检索中国期刊全文数据(网址http://dlib.cnki.net/kns50/index.aspx)及PubMed数据库(网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)1990-01/2009-06期间相关文章,检索词为"睫状神经营养因子,神经损伤,Ciliary neurotrophic factor,Nerve injure".纳入与神经损伤与睫状神经营养因子研究现状与发展密切相关的研究,包括神经元损伤后的变化;睫状神经营养因子对神经元的修复机制及保护作用,对修复过程的调控,对神经元轴浆运输功能的恢复,对损伤神经的再生作用.排除重复性研究或Meta分析.结果与结论:睫状神经营养因子广泛分布于神经系统,具有广谱营养作用.神经元内源性睫状神经营养因子主要来源于周围神经许旺细胞、中枢神经胶质细胞以及神经元的自分泌.在神经损伤的修复过程中,睫状神经营养因子通过不同的方式对损伤神经元进行保护和修复.睫状神经营养因子可以通过对几种相关酶的调节而促进神经损伤的恢复,能提高细胞内JAK-STAT途径促进相关蛋白和重要分子的产生,可以促进轴浆运输,使修复加快,睫状神经营养因子还可以通过加强许旺细胞的增殖和变化促进神经的修复.睫状神经营养因子在受损神经元的修复中起着很重要的作用.通过研究探索睫状神经营养因子对神经损伤治疗的作用,有利于开发应用睫状神经营养因子来治疗神经损伤.     

不同剂量睫状神经营养因子对大鼠坐骨神经损伤后再生的影响

目的:探讨不同剂量睫状神经营养因子(ciliaryneurotrophicfactor,CNTF)对大鼠坐骨神经损伤后桥接再生影响。方法:选用30只大鼠分5组,每组6只,切除左侧坐骨神经6mm,用硅胶管10mm桥接坐骨神经的两个断端。其中治疗组CNTF一次给药量分别为500,300,100,50ng,对照组给生理盐水5μL。术后1个月活杀动物,观察坐骨神经近、远心端,新生神经纤维,脊髓,运动终板的变化。结果:电镜结果显示300和500ng治疗组,新生雪旺细胞及神经纤维较多。单个雪旺细胞内夹有神经纤维,髓鞘厚度均匀。其他各组有少许髓鞘样结构。新生神经纤维细小。光镜观察发现:300,500ng治疗组新生神经纤维较成熟,排列整齐。对照组新生的坐骨神经细小,远端有变性改变。结论:CNTF对坐骨神经损伤有促进再生作用,用量最好是300～500ng。