脂多糖应激新分子融合蛋白的高表达及纯化

目的在原核表达系统中表达脂多糖应激新分子编码的蛋白质。方法PCR扩增HlrgcDNA编码区,克隆入表达载体pcTAT中,构建成融合6His的表达载体pcTAT-lrg,转化E.coli BL21(DE3),以IPTG诱导。表达产物用SDS-PAGE及凝胶光密度扫描分析,用Ni-NTA亲和层析柱纯化。结果经过IPTG诱导4 h,表达出相对分子质量(Mr)约25 000的蛋白,占菌体总蛋白的51%。表达产物为可溶性的,用Ni-NTA亲和层析柱纯化的表达蛋白达到电泳纯。加入培养液中的纯化蛋白,可在30 min内进入HEK293细胞。结论在E.coli中成功地高表达人Lrg融合蛋白,并对其进行初步纯化,为人Lrg功能的研究打下基础。     

HCBP12融合蛋白的表达、纯化及多抗制备

目的：构建丙型肝炎病毒核心抗原结合蛋白12（HCVCore binding protein,HCBP12）原核表达载体,在大肠埃希菌中进行表达、纯化HCBP12融合蛋白并制备兔抗HCBP12多克隆抗体。方法：应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）,以提取的HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得HCBP12基因片段,插入至原核表达载体pET-32a（＋）中,构建原核表达载体pET-32a（＋）-HCBP12,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导,获得HCBP12融合蛋白的可诱导性表达,并通过SDS-PAGE电泳、Western Blot免疫印迹分析和证实融合蛋白表达的特异性。利用Ni＋亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。纯化蛋白免疫新西兰兔,获得抗HCBP12多克隆抗体。以纯化HCBP12为抗原,利用Western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。结果：HCBP12融合蛋白表达成功。SDS-PAGE分析表明其为包涵体表达。成功获得了融合蛋白纯品及兔抗HCBP12多克隆抗体。ELISA法表明多克隆抗体效价〉1512000,Western blot检测证明多克隆抗体的特异性良好。结论：成功表达、纯化HCBP12融合蛋白,并获得高特异性、高效价兔抗HCBP12多克隆抗体,为研究HCBP12蛋白的生物学功能及丙肝的临床治疗提供了重要的实验工具。     

葡激酶在毕赤酵母中的表达及纯化

目的探索葡激酶基因在毕赤酵母中的表达和纯化方法。方法根据毕赤酵母的偏性合成了葡激酶基因,克隆到分泌型酵母表达载体pPIC9K中,重组载体线性化后,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。应用DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和Sephacry1 S-200凝胶过滤层析法纯化表达产物,采用溶圈法对纯化产物进行生物学活性测定。结果葡激酶在毕赤酵母中GS115的表达量约站总蛋白的45%;表达产物经DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和SephacrylS-200纯化后纯度达到95%;测得其比活为5.2×10^4AU/mg。结论利用毕赤酵母成功进行了重组葡激酶基因的表达及其表达产物的纯化。     

重组人PD-L1在大肠杆菌BL-21中的表达、纯化和鉴定

目的 分离纯化人程序死亡蛋白-1(PD-LI)基因,制备重组人PD-L1蛋白,为进一步研究PD-L1在肿瘤免疫逃逸中的作用和机制建立基础.方法 通过RT-PCR分离纯化人PD-L1基因,并将其克隆到原核表达质粒pGEX-4T一1中,经酶切,测序鉴定分析后,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达.产物经GST蛋白纯化系统进行纯化后,用10%SDS-PAGE及Western Blot分析鉴定.结果 经RT-PCR分离纯化的PD-L1 cDNA分子由645 bp构成,编码相对分子量约25 KD的蛋白,并与GST形成融合蛋白.GST-PD-L1融合蛋白相对分子量约46 KD.Western Blot结果显示,该蛋白能被兔抗GST和抗PD-L1抗体识别.结论 成功构建了PD-L1原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中获得高效表达.     

CREKA/tTF融合蛋白表达及活性鉴定

目的制备用于靶向肿瘤血管中的凝血血浆蛋白的CREKA/tTF融合蛋白,并鉴定其生物学活性。方法利用PCR技术构建CREKA与tTF的融合基因,克隆至表达载体pET22b(+),在E.coli BL21中表达,镍亲和色谱柱纯化,梯度透析复性。利用凝血时间,结合荧光定量测定等实验在体外鉴定该融合蛋白的活性。结果获得序列正确的CREKA/tTF/pET22b(+)重组子,融合蛋白在E.coli BL21中高效表达。纯化后的融合蛋白具有引起血液凝固的功能,且能与凝血血浆蛋白结合。结论成功构建CREKA/tTF/pET22b(+)重组子,CREKA/tTF融合蛋白具有TF凝血活性及CREKA的结合活性。     

原癌基因Pokemon的克隆原核表达及纯化

目的克隆小鼠Pokemon(POKeryhroidmyeloidontogenicfactor)基因并进行原核表达及重组蛋白的纯化。方法应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,克隆人pGEM-T-easy载体,经鉴定后,以限制性核酸内切酶分别消化重组质粒及原核表达载体pET-30a(+),体外定向连接,进行PCR、内切酶酶切及DNA序列分析,阳性重组表达质粒进一步转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中诱导表达,经Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白,Westernblotting检测其特异性。结果限制性核酸酶切及序列分析表明重组表达质粒包含Pokemon基因编码区,阅读框架无移位;十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示有预期相对分子质量为36000的重组蛋白表达,经亲和层析纯化后,融合蛋白的纯度达到90%以上;Westernblotting印迹表明纯化的融合蛋白具有特异的免疫反应特性。结论采用基因克隆技术成功构建了Pokemon原核表达载体,并获得了高纯度的重组蛋白,为后期抗体的制备及进一步研究该基因与肿瘤发生的关系奠定了基础。     

人源抗HBsAg单链抗体与白细胞介素2融合蛋白在巴氏毕赤酵母中的表达

目的：探讨抗HBsAg单链抗体与白细胞介素2融合蛋白在巴氏毕赤酵母(P．Pastoris)中的表达以及初步的纯化、活性鉴定方法。方法：用PCR将目的蛋白基因从质粒PGEM7Zf( )-HBScFv-IL-2上扩增出来，再亚克隆到酵母表达载体pPICZaA中，转化P．Pastoris宿主菌GS 115，菌落：PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定转化子，重组酵母经甲醇诱导后，通过SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定表达产物；再通过亲和层析法纯化目的蛋白；用间接ELISA实验鉴定其活性。结果：表达的重组蛋白分子质量约为44ku，表达量可达12％；纯化后凝胶成像分析目的蛋白的纯度达到95％；重组融合蛋白能与HBsAg、鼠抗IL-2单克隆抗体特异性结合。结论：成功构建了抗HBsAg单链抗体与IL-2融合蛋白酵母表达工程菌，并初步建立了对目的蛋白的纯化及活性鉴定方法。     

晚期糖基化终产物受体胞外段的原核表达及其相互作用蛋白的筛选

目的构建晚期糖基化终产物受体(receptor for ad-vanced glycation end-product,RAGE)胞外段基因的原核表达载体并诱导表达,应用噬菌体展示技术筛选其相互作用蛋白。方法用RT-PCR方法扩增人RAGE胞外段cDNA,构建于原核表达载体pET14b,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导RAGE胞外段融合蛋白表达,用Ni2+-NTA亲和层析柱进行纯化并行Western blot鉴定。以重组RAGE胞外段蛋白为靶分子,进行3轮噬菌体展示环七肽库的筛选,从第3轮洗脱物中随机挑选分隔良好的噬菌体克隆扩增后进行ELISA鉴定。对获得的阳性噬菌体克隆分别进行扩增、纯化,提取DNA测序后翻译为氨基酸序列,用BLAST软件搜索Gen-Bank中的同源序列。结果成功构建并表达、纯化了RAGE胞外段融合蛋白。经过3轮筛选后,随机挑取的24个噬菌体克隆中11个可与RAGE胞外段结合。对11个噬菌体测序后用BLAST软件搜索同源序列,得到14个编码蛋白。结论应用噬菌体展示技术筛选到与RAGE胞外段相互作用的蛋白,为进一步研究其功能和作用机制提供新线索。     

谷胱甘肽-S转移酶-中期因子融合蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

目的 构建谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和中期因子(MK)融合蛋白的原核表达质粒,并表达和纯化蛋白,制备多克隆抗体.方法 通过RT-PCR技术从人胃癌组织中扩增入MK编码序列,克隆入表达载体pGEX-1λT中,获得表达质粒pGEX-MK,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中经IPTG诱导表达,通过亲和层析纯化表达的GST-MK融合蛋白,并以重组蛋白免疫兔子.结果 成功构建了GST-MK融合蛋白的原核表达载体,经诱导表达纯化得到GST-MK融合蛋白.免疫兔子后取多抗血清以间接ELISA检测效价达1∶64 000,Western blotting分析显示多克隆抗血清对MK蛋白特异结合.结论 MK在大肠杆菌中成功表达及其多克隆抗体的获得,为研究MK生物功能奠定了基础.     

sCR1在原核中表达、纯化、复性及活性鉴定

目的采用原核表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中获得高表达、高活性的重组人sCR1融合蛋白。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入原核表达载体pET28a中,构建含人sCR1的重组质粒(pET28a-sCR1),经测序鉴定正确,转化入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行复性及生物学活性鉴定。结果获得原核表达载体pET28a-sCR1,经PCR鉴定及测序鉴定,得到重组E.coli BL21(DE3)克隆菌株,经IPTG诱导含有pET28a-sCR1的E.coli BL21(DE3)克隆菌,表达出重组人sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr大于29000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化、复性后得到高纯度的sCR1融合蛋白表达及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。