重组腺相关病毒介导caveolin-1基因表达抑制肝癌新生血管形成的实验研究

目的 探讨caveolin-1参与肝细胞癌血管生成及影响血管通透性的作用机制.方法 构建肝癌细胞系HepG2裸鼠皮下移植瘤模型,局部注射编码重组可溶性caveolin-1蛋白的重组腺相关病毒载体rAAV-PEG-caveolin-1,观察其对肝癌细胞生长的抑制作用;通过肿瘤微血管密度(microvessel density,MVD)检测肿瘤新生血管的生成;Western blot检测脉管标志蛋白PECAM-1表达改变;FITC标记右旋糖苷测定肿瘤微血管通透性;放射强度测定法检测肝癌组织中eNOS活性,TUNEL法检测caveolin-1对肿瘤细胞的诱导凋亡效应.结果 rAAV-PEG-caveolin-1转染组治疗第14天后,移植瘤的瘤重较对照组和空载体转染组有不同程度的减小(P＜O.05);免疫组化分析及Western blot结果显示rAAV-PEG-caveolin-1转染组较对照组及空载体组MVD及PECAM-1表达显著减少(P＜0.05);FITC-右旋糖苷测定表明rAAV-PEG-caveolin-1可有效降低肿瘤微血管通透性;rAAV-PEG-caveolin-1转染组较对照组及空载体组eNOS活性明显下降(P＜0.05);TUNEL分析显示rAAV-PEG-caveolin-1可诱导肿瘤细胞凋亡.结论 Caveolin-1是血管生成调节的关键分子,能显著抑制肿瘤新生血管的形成,并能有效降低肿瘤微血管的通透性.

Abstract：

Objective To investigate the antitumor effect of the recombined adeno-associated virus encoding caveolin-1 regulated by progression-elevated gene (PEG) promotor on the angiogenesis of implanted human hepatocellular carcinoma(HCC) cell lines in a nude mouse model. Methods HepG2 cells were inoculated subcutaneously into NOD/SCID mice, and animals were treated with rAAV-PEG-caveolin-1 after tumor cell innoculation. The fluorescence ratio of Evans blue to FITC-dextran was used to assess the changes of microvasculature permeability of the tumor. Western blot and immunohistochemical analyses were employed to detect PECAM-1 expression in tumor microvascular endothelium and microvessel density(MVD), respectively; NOS activity was assessed by citrulline generation. Tumor growth was observed and tumor cell apoptosis in tumor tissues were measured by TUNEL. Results Tumor growth was significantly inhibited in mice injected with rAAV-PEG-caveolin-1. The administration of rAAV-PEG-caveolin-1 significantly blocked vascular leakage in the tumor microcirculation. The levels of PECAM-1 protein detected by Western blot were markedly reduced in rAAV-PEG-caveolin-1-treated mice, and there were fewer MVD in tumors from caveolin-1-treated mice, while NOS catalytic activity was much lower in rAAV-PEG-caveolin-1-treated mice compared to the control and empty vector-treated animals. TUNEL demonstrated significant induction of tumor cell specific apoptosis. Conclusions rAAV-PEG-caveolin-1 can reduce tumor progression through blocking microvascular formation by inhibiting eNOS.     

重组腺相关病毒介导caveolin-1基因表达抑制肝癌新生血管形成的实验研究

目的 探讨caveolin-1参与肝细胞癌血管生成及影响血管通透性的作用机制.方法 构建肝癌细胞系HepG2裸鼠皮下移植瘤模型,局部注射编码重组可溶性caveolin-1蛋白的重组腺相关病毒载体rAAV-PEG-caveolin-1,观察其对肝癌细胞生长的抑制作用;通过肿瘤微血管密度(microvessel density,MVD)检测肿瘤新生血管的生成;Western blot检测脉管标志蛋白PECAM-1表达改变;FITC标记右旋糖苷测定肿瘤微血管通透性;放射强度测定法检测肝癌组织中eNOS活性,TUNEL法检测caveolin-1对肿瘤细胞的诱导凋亡效应.结果 rAAV-PEG-caveolin-1转染组治疗第14天后,移植瘤的瘤重较对照组和空载体转染组有不同程度的减小(P＜O.05);免疫组化分析及Western blot结果显示rAAV-PEG-caveolin-1转染组较对照组及空载体组MVD及PECAM-1表达显著减少(P＜0.05);FITC-右旋糖苷测定表明rAAV-PEG-caveolin-1可有效降低肿瘤微血管通透性;rAAV-PEG-caveolin-1转染组较对照组及空载体组eNOS活性明显下降(P＜0.05);TUNEL分析显示rAAV-PEG-caveolin-1可诱导肿瘤细胞凋亡.结论 Caveolin-1是血管生成调节的关键分子,能显著抑制肿瘤新生血管的形成,并能有效降低肿瘤微血管的通透性.     

重组腺相关病毒介导MDA-7基因表达抑制肝癌形成的体内实验研究

目的 探讨含PEG启动子的腺相关病毒介导的黑色素瘤分化相关基因MDA-7(rAAV-PEG-MDA-7)在裸鼠体内的抗肝癌作用及机制.方法 构建肝癌细胞HepG2裸鼠皮下移植瘤模型,尾静脉注射编码重组可溶性MDA-7蛋白的重组腺相关病毒载体rAAV-PEG-MDA-7,观察对肝癌生长的抑制作用.采用RT-PCR、免疫组化、Western blot及ELISA方法分析MDA-7的体内表达情况;Tunnel法和免疫组化检测MDA-7对肿瘤细胞的诱导凋亡和微血管生成抑制效应.结果 荷瘤裸鼠尾静脉注射rAAV-PEG-MDA-7后,裸鼠肝细胞中有MDA-7表达,其他组织中无MDA-7表达;血清中MDA-7蛋白持续表达,注射2 w后蛋白表达达高峰(200 ng/ml);裸鼠皮下瘤生长受抑制,抑瘤率为62%;Tunnel及免疫组化分析显示,rAAV-PEG-MDA-7可诱导肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤微血管形成.结论 含PEG启动子的重组腺相关病毒表达系统rAAV-PEG-MDA-7具有良好的肿瘤靶向性和肝向性,MDA-7在裸鼠肝脏中高效表达,可抑制肝癌生长,其抗肿瘤机制可能为通过诱导肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤血管生成的协同作用.     

肝癌诱导新生血管形成及其干预治疗

目的研究肝癌生长、转移与新生血管形成的关系,以及抗新生血管形成的应用。方法采用免疫组织化学和RT-PCR方法,分析肝癌组织中的血管内皮细胞生长因子（VEGF）表达水平;建立裸鼠角膜微囊移植模型以比较不同转移潜能肝癌诱导血管的能力;采用CD34抗体特异标记肝癌组织中的新生血管数目,探讨其与肝癌病人术后复发的关系;采用ELISA方法检测血清VEGF和Endostatin;建立肝癌裸鼠种植模型,采用血管形成抑制剂进行干预治疗。结果在侵袭性肝癌组织中VEGFmRNA及表达高于非侵袭性肝癌组织;微血管密度（MVD）≥100的肝癌术后复发率为MVD＜100的肝癌病人的3倍。血清VEGF高水平且endostatin低水平的肝癌MVD高于VEGF低水平和(或)endostatin高水平的肝癌（73±33vs.47±21,P<0.05）。结论肝癌诱导血管生长的能力与其转移能力平行。肝癌组织中的微血管密度与肝癌病人术后复发有关。抗血管治疗有可能成为治疗肝癌术后复发的一种有效手段。     

人肝细胞癌血管生成拟态的实验研究

目的 探讨血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)在原发肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达及生物学和临床意义.方法 42例患者共47个原发中心结节HCC的根治性手术切除肿瘤组织标本,42例患者分为2组,VM阳性组(16例)和VM阴性组(31例).应用CD31和PAS双重染色检测VM表达及形态结构.RT-PCR检测VE-cadherin、EPHA2和MMP-2基因的表达情况及相关性.结果 42例HCC患者标本中,有16例(38.1%)存在VM结构.VM结构为由肿瘤细胞围成的无内皮细胞衬附的管道样结构或PAS染色阳性的网络样结构.VM的生成与HCC的Edmondson病理学分级、肝内转移、术后复发时间比较差异有统计学意义(P＜0.05).HCC中VM阳性的VE-cadherin、EPHA2和MMP-2基因表达高于VM阴性(P＜0.05),其基因表达与VM形成具有相关性.结论 HCC中存在VM.HCC恶性程度越高形成VM的能力越强.VM阳性的HCC更容易发生肝内转移,并且有较高的术后复发率,预后较差.     

血管内皮生长因子反义寡核苷酸抑制肝癌的血管形成

目的 研究血管内皮生长因子（VEGF）反义寡核苷酸（ODN）是否可以抑制人肝癌细胞系VEGF的蛋白表达,进而抑制肝癌的血管形成,探讨肝癌基因治疗的新方法。方法 人肝癌细胞系7721能表达VEGF,其培养上清液对牛主动脉内皮细胞（BAEC）的生长有促进作用。采用人工合成反义、正义ODN分别加入7721细胞培养液,比较7721细胞VEGF的表达以及各上清液刺激内皮细胞生长的受抑情况,即可了解ODN通过抑制VEGF的表达抑制肝癌的血管形成情况。结果 VEGF反义ODN明显抑制了人肝癌细胞VEGF的表达（灰度值：反义组122．6,正义组101．3,对照组106．3,P＜0．01）,且抑制率与剂量呈性关系（当剂量为1、2、5、10μmol/L时抑制率分别为：63．2％、82．4％、210．0％、287．5％）。结论 VEGF反义ODN能够抑制肝癌的血管形成,其有望成为抗肝癌的新一代基因治疗手段。     

整合素αv亚基对肝细胞性肝癌血管生成、侵袭转移的影响

目的　研究整合素αv亚基 (αv)在原发性肝细胞癌 (HCC)中的表达情况及意义。方法对 4 3例HCC和 6例正常肝组织标本进行免疫组织化学染色 ,观察αv的表达与HCC的病理学特点、微血管密度 (MVD)之间的关系。结果　αv在肝癌细胞中的表达与肝癌卫星灶的形成密切相关 (H =9 0 0 8,P =0 0 0 3) ;αv在癌组织内皮细胞中阳性与阴性表达组的MVD值分别为 (15 1± 5 4 )和 (115±39) ,两组MVD的差异有显著意义 (t=2 5 0 3,P =0 0 16 )。结论　αv在HCC中的表达对肝癌的血管生成、侵袭转移有重要作用     

鼠源性血管抑素对裸鼠种植性肿瘤的抑制作用

目的　探讨鼠源性血管抑素转染入人肝癌细胞SMMC 772 1后对裸鼠种植性肿瘤的影响。　方法　建立鼠源性血管抑素基因的人肝癌SMMC 772 1细胞株 ,实验动物分 3组 :空白对照组种植SMMC 772 1细胞 ,空载体组种植SMMC 772 1/pcDNA3 1(+)细胞 ,血管抑素组种植SMMC 772 1/pcDNA3 1 mAST细胞。比较各组裸鼠肿瘤体积、重量和肿瘤微血管密度 (MVD)。　结果　在肿瘤细胞种植 35d时裸鼠肿瘤体积 :空白对照组 (35 38 1± 6 43 3)mm3 ,空载体组 (312 8 5± 5 46 6 )mm3 ,血管抑素组 (75 5 8± 198 2 )mm3 ;肿瘤重量 :空白对照组 (6 0± 0 7)g,空载体组 (5 9± 0 5 )g ,血管抑素组(2 1± 0 5 )g;肿瘤MVD :空白对照组 5 2 2± 6 6 ,空载体组 49 4± 7 0 ,血管抑素组 2 5 5± 4 1。血管抑素组裸鼠肿瘤体积、重量和MVD显著小于空白对照组和空载体组 (P均 <0 0 1) ,肿瘤的抑制率达78 6 %。　结论　转染血管抑素基因的人肝癌细胞SMMC 772 1在裸鼠体内的致瘤力明显降低 ,肿瘤的体积、重量和微血管密度显著低于对照组 ,表明血管抑素可通过抑制肿瘤血管生成而显著抑制肿瘤生长     

肾癌与抑制肿瘤血管生成治疗

肾癌是常见的肾脏恶性肿瘤，肾癌的治疗以外科手术切除治疗为主，辅以生物治疗，肾癌对化疗的效果很差，为多重耐药的肿瘤。研究发现肿瘤的生长、转移与血管的生成有密切的关系，抑制肿瘤生血管生成治疗在动物实验中取得良好的疗效。但在临床应用上缺乏经验，如与外科治疗，生物治疗，内分泌治疗等联合应用，对肾癌的治疗多提供了一种方法。     

血管生成素2与腹膜透析时腹膜血管新生的关系

Objective To investigate the association between angiopoietin-2 (Angpt-2) and peritoneal angiogenesis in a uremic peritoneal dialysis (PD) rat model. Methods Uremic (subtotal nephrectomy) rats were established and divided into non-PD, 10 d-PD, 28 d-PD and 56 d-PD groups. Standard PD solution was applied in the study. Rats undergone sham operation without PD were used as control group. Vessel density of the peritoneum was detected and quantified with anti-CD31 immunohistochemical staining. Expressive levels of Angpt-2 and vascular endothelial growth factor (VEGF) were examined in the peritoneum by real-time PCR and Western blotting. Results The non-PD group was characterized by increased vessel density in the peritoneum compared with that of the control group [(5±3)/HP vs (1±1)/HP]. Progressive angiogenesis was found in 10 d-PD, 28 d-PD and 56 d-PD groups [(10±5)/HP, (17±5)/HP, (19±4)/HP]. Furthermore, expressive levels of Angpt-2 and VEGF increased significantly in the non-PD group compared with the control (P<0.01), and such expressions were significantly higher in the PD groups as compared to non-PD group (P<0.01), but no difference was found among the PD groups. Both VEGF and Angpt-2 levels were positively correlated with vessel density(r=0.7756, P<0.01; r=0.5223, P<0.05). Conclusions Uremia and PD promote peritoneal angiogenesis in rats. Increased expression level of Angpt-2 in peritoneum is positively correlated with peritoneal angiogenesis. Angpt-2 may be a new therapeutic target of peritoneal angiogenesis.     

Caveolin-1在肝细胞癌表达及与肿瘤血管生成的关系

目的：探讨caveolin-1与肝细胞癌（HCC）侵袭转移的关系及其可能的机制。方法：应用实时PCR方法检测伴肝内转移的 HCC组织、癌旁组织、肝硬化组织、正常肝组织中 caveolin-1 mRNA的表达;用Western blot方法检测伴肝内转移的 HCC组织、癌旁组织中caveolin-1蛋白的表达;用免疫组化方法检测75例HCC组织中caveolin-1,血管内皮生长因子（VEGF）,CD34,α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达,分析caveolin-1,VEGF的表达以及肿瘤微血管密度（MVD）,非成对动脉（UA）计数与临床病理因素的关系。结果：在伴肝内转移的HCC组织中,caveolin-1 mRNA表达明显高于癌旁组织、肝硬化组织、正常肝组织（均P<0.05）,其蛋白表达明显高于癌旁组织;caveolin-1表达水平的升高与肿瘤转移有关（P<0.05）,且caveolin-1的表达与VEGF表达及MVD和UA计数呈正相关（r=0.293,P=0.011;r=0.361,P=0.001;r=0.388,P=0.001）。结论：caveolin-1表达升高促进HCC的侵袭转移,其机制可能是通过诱导HCC表达VEGF,促进肿瘤新生血管生成而实现的。     

促血管生成素在肝癌组织中的表达与肝癌新生血管形成及转移的关系

目的　观察促血管生成素 (angiopoietin)在肝细胞癌组织中的表达 ,探讨其临床意义。方法　采用原位分子杂交和免疫组织化学染色方法检测两种促血管生成素Angiopoietin 1(Ang 1)、Angiopoietin 2 (Ang 2 )以及血管平滑肌激动蛋白 (α smoothmuscleactin ,α SMA)在正常肝脏组织和肝细胞癌组织中的表达。结果　Ang 1mRNA在正常肝脏和肝癌组织中都有表达 ,肝癌组织和癌旁组织 (5 6± 6 /HP)以及正常肝脏 (6 7± 11/HP)之间差异没有显著意义 (t=3 2 14 ,P =0 12 6 )。Ang 2mRNA在正常肝脏不表达 ,肝癌组织中阳性表达 (阳性细胞数为 32± 8/HP)。Ang 2集中于癌灶边缘、血管周围。肝癌组织中微血管密度 (15± 2 /HP)和新生血管的数量 (9± 3/HP)明显高于正常肝脏(分别为 5± 1/HP和阴性 ) ,Ang 2的表达随肝癌组织的病理学分级、有无转移以及新生血管数和微血管密度而增加 (t=2 714 ,P =0 0 31)。结论　促血管生成素在肝癌的新生血管形成和转移过程中可能起到一定作用。Ang 2可能参与了肝癌的新生血管形成。     

雷帕霉素在人肝癌裸鼠肝移植瘤血管形成和肿瘤进展中的作用

目的 探讨雷帕霉素(RPM)在人肝癌裸鼠肝移植瘤血管形成和肿瘤发展中的作用.方法 建立人肝癌裸鼠肝移植瘤模型,使用RPM、环孢素A(CsA)进行干预治疗,采用实时定量PCR法检测移植瘤血管内皮细胞生长因子(VEGF)mRNA的表达,免疫组织化学方法和图像分析技术检测移植瘤VEGF蛋白、增殖细胞核抗原(PCNA)的表达和微血管密度(MVD),ELISA法检测外周血VEGF蛋白水平的变化.结果 (1)RPM、CsA和对照组移植瘤重量分别为(372±35)mg、(769±39)mg、(751±42)mg;RPM组移植瘤重量较对照组显著减少(P<0.01);CsA组和对照组比较无明显变化(P>0.05).(2)RPM组移植瘤VEGF mRNA、蛋白和PCNA的表达及外周血中VEGF蛋白水平较对照组显著下调(P<0.05),CsA组和对照组比较无明显差异(P>0.05).(3)RPM组移植瘤MVD较对照组显著减少(P<0.01);CsA组和对照组相比无明显变化(P>0.05).结论 RPM通过阻止肿瘤增殖,下调VEGF的表达,抑制肝癌血管形成和肿瘤进展.     

Caveolin-1促肝细胞癌血管生成的鼠在体实验研究

目的：通过在体动物实验,探讨Caveolin-1与肝细胞癌侵袭转移和肿瘤血管生成的关系。方法：分别用pGC—FU-caveolin-1过表达质粒慢病毒（过表达组）和空载体慢病毒（对照组）感染人肝细胞癌株SMMC7721,建立肝细胞癌裸鼠模型,在体观察成瘤、转移瘤的大小和数量,应用免疫组织化学技术检测成瘤组织标本中血管内皮细胞生长因子（VEGF）表达、肿瘤微血管密度（MVD）。结果：过表达组成瘤最大体积和转移瘤数量均大于对照组,[（1018．3±231．6）mm3VS（611．7±149．5）mm3,P〈0．01;（5．8±1．3）VS（1．3±1．6）,P〈0．01];过表达组VEGF和MVD水平均超过对照组,[（5．2±2．5）VS（2．74±8）,P〈0．01;（31．9±21．3）VS（18．2±15．6）,P〈0．01]。结论：Caveolin-1过表达能促进肝细胞癌的侵袭转移和肿瘤血管生成。     

Inhibition of in vivo tumor angiogenesis and growth via systemic delivery of an angiopoietin 2-specific RNA aptamer

BACKGROUND: Cellular events mediated by the Tie2 receptor are important to tumor neovascularization. Despite the complex interplay of the best-characterized Tie2 ligands, angiopoietins 1 and 2, Ang2 is purportedly "proangiogenic" in the presence of vascular endothelial growth factor. We examined whether in vivo administration of an RNA aptamer that specifically blocks Ang 2 would inhibit tumor angiogenesis and growth. METHODS: Ang2-mediated Tie2 receptor phosphorylation was assessed in vitro in the absence and presence of aptamer coupled to polyethylene glycol. IN VIVO ANGIOGENESIS ASSAY: CT26 murine colon carcinoma cells expressing green fluorescent protein were delivered into mouse dorsal skinfold window chambers. Animals received daily intraperitoneal injections of phosphate-buffered saline, low-dose (Ang2 aptamer-LD; 1 mg/kg/d), or high-dose aptamer (Ang2 aptamer-HD; 10 mg/kg/d). Vascular length density was measured under fluorescence microscopy. PRIMARY TUMOR GROWTH: CT26 cells expressing luciferase were injected into flanks of BALB/c mice to allow tumor growth monitoring by bioluminescence imaging. Animals received continuous phosphate-buffered saline or aptamer (1 mg/kg/d) via ALZET pumps. Tumors were assessed for CD31/PECAM-1 immunostaining and Hoechst dye uptake. RESULTS: Pegylated aptamer inhibited Tie2 phosphorylation. Systemic aptamer administration reduced vascular length density (P < or = 0.03) and decreased bioluminescence emission (P < 0.04), corresponding to 50% decrease in tumor volume (P = 0.04). Control tumors displayed abundant vascular marker staining, in contrast to tumors from aptamer-treated animals. CONCLUSIONS: in vivo administration of a clinically relevant, pegylated RNA aptamer specifically designed against Ang2 inhibited tumor angiogenesis and growth. These findings support targeted Ang2 inhibition as a relevant anti-angiogenic, anti-neoplastic strategy.     

新生血管生成与肝细胞癌侵袭、转移和预后的关系

目的　探讨原发性肝细胞癌 (HCC)新生血管生成与临床病理指标的关系及其可否用于预测HCC侵袭、转移和预后。方法　采用免疫组织化学方法 ,检测了 2 0例正常肝组织、2 0例肝硬化组织、85例HCC及癌旁组织中CD34的表达 ,以及HCC的微血管密度 (MVD)。结果　CD34的染色定位在血管内皮细胞上 ,HCC窦样血管CD34表达为强阳性 ;除门管区小血管分支及中央静脉外 ,癌旁肝组织、肝硬化组织、正常肝组织基本不表达CD34 ;HCC的MVD范围 (18～ 36 0 ) / 0 74mm2 、(15 6 5±6 2 4) / 0 74mm2 。HCC的MVD与肿瘤大小、病灶数目、分化程度、门静脉瘤栓形成、包膜状况均有显著关系 (P <0 0 5或 0 0 1) ;与HBsAg是否阳性、术前AFP水平无关 (P >0 0 5 ) ;与预后亦有关 ,少血管组(MVD <15 6 )预后显著优于多血管组 (MVD≥ 15 6 ) ,术后平均无瘤生存期少血管组为 5 3个月 ,多血管组为 14个月 ,(P <0 0 0 1)。结论　CD34的表达反映了HCC的新生血管化 ,与HCC的发展有关。MVD可作为判断HCC侵袭、转移和预后的指标。