5-氮-2'-脱氧胞苷对黑素瘤细胞IGFBP7表达及细胞增殖的影响

目的 探讨去甲基化药物5-氮-2'-脱氧胞苷对体外培养黑素瘤细胞系A375和M14细胞胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)的表达及细胞增殖的影响.方法 体外培养黑素瘤A375和M14细胞,采用RT-PCR和免疫细胞化学法分别检测10μmol/L 5-氮-2'-脱氧胞苷处理前后A375和M14细胞中IGFBP7mRNA和蛋白的表达,噻唑蓝法检测不同浓度5-氮-2'-脱氧胞苷对A375和M14细胞的生长抑制作用.结果 10μmol/L 5-氮-2'-脱氧胞苷处理A375和M14细胞48h后,IGFBP7 mRNA和蛋白水平的表达均得到恢复.不同浓度的5-氮-2'-脱氧胞苷分别作用24、48、72、96和120h后,呈时间(F=141.35,P<0.01;F=549.33,P<0.01)和剂量(F=561.12,P<0.01;F=271.43,P<0.01)依赖性抑制A375和M14细胞增殖.结论 DNA甲基化参与调控IGFBP7基因的表达,5-氮-2'-脱氧胞苷具有抑制黑素瘤细胞增殖的作用.     

IGFBP7在皮肤黑素瘤组织和细胞系中的表达

目的:检测胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)在皮肤黑素瘤组织和细胞系中的表达。方法:免疫组化法检测25例原发性皮肤黑素瘤、5例转移性皮肤黑素瘤、20例良性色素痣、10例正常皮肤组织和4株人黑素瘤细胞系中IGFBP7的表达。结果:IGFBP7在正常皮肤和良性色素痣细胞浆中的阳性表达率为85%,而在皮肤黑素瘤胞浆中的阳性表达率为16%和20%。除人黑素瘤细胞系MV3阳性表达IGFBP7外,其余细胞系均阴性表达。结论:IGFBP7在皮肤黑素瘤组织和细胞系中的低表达或功能缺失可能参与了皮肤黑素瘤的发病。     

胰岛素样生长因子结合蛋白-3在原代培养的阴茎海绵体平滑肌细胞中的表达及定位

目的:观察胰岛素样生长因子结合蛋白-3(insulin-like growth factor binding protein 3,IGFBP-3)在阴茎海绵体平滑肌细胞(corpus cavernosum endothelial cells,CCSMCs)中的表达及定位情况。方法:原代培养大鼠CCSMCs并鉴定,RT-PCR检测IGFBP-3基因mRNA表达,用荧光免疫细胞化学法检测IGFBP-3在CCSMCs中的定位及蛋白表达。结果:RT-PCR能够检测到IGFBP-3 802bp特异性条带的表达,荧光免疫细胞化学法可见IGFBP-3蛋白表达并同时定位于CCSMCs胞质和胞核中。结论:CCSMCs可表达IGFBP-3基因,其蛋白定位于胞质和胞核,可能是ED治疗的新靶点。     

反向寡脱氧核苷酸抑制细胞周期素D1表达及对黑素瘤细胞增殖的影响

目的探讨细胞周期素D1 反向寡脱氧核苷酸对恶性黑素瘤的潜在治疗作用。方法合成针对细胞周期素D1 mRNA翻译起始部位序列的20bp硫代磷酸反向寡脱氧核苷酸(AS ODN)。采用RT PCR检测AS ODN对黑素瘤(B16 细胞)细胞周期素D1 mRNA水平的影响 ;用流式细胞仪检测细胞周期素D1 蛋白表达及细胞周期分布 ;固绿染色计数、集落形成抑制试验体外观察AS ODN对B16 细胞增殖的影响。结果细胞周期素D1 mRNA反向链明显抑制B16 细胞细胞周期素D1 mRNA和细胞周期素D1 蛋白表达 ,降低S期细胞百分比 ,且明显抑制B16 细胞生长和集落形成。结论细胞周期素D1 反向寡脱氧核苷酸能有效抑制黑素瘤细胞增殖。     

6味中药乙醇提取物对B16黑素瘤细胞酪氨酸酶及其相关蛋白-1、-2 mRNA表达的影响

目的 研究墨旱莲(旱莲草)等6味用于治疗白癜风中药的乙醇提取物对小鼠B16黑素瘤细胞酪氨酸酶及酪氨酸酶相关蛋白-1、-2(TRP-1、-2)mRNA表达的影响.方法 半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定酪氨酸酶及TRP-1、-2 mRNA的表达,并与阳性对照甲氧沙林(8-MOP)进行比较.结果 山慈姑(毛慈姑)、苦参、黑芝麻和墨旱莲的乙醇提取物显著上调细胞酪氨酸酶mRNA的表达(P<0.05);除苦参对TRP-2 mRNA有明显上调作用外(P<0.05),其他中药对TRP-1和TRP-2 mRNA的表达无明显作用(P>0.05).结论 山慈姑、苦参、黑芝麻和墨旱莲有上调酪氨酸酶mRNA的作用,苦参还可上调TRP-2 mRNA的表达.     

胰岛素样生长因子ⅡmRNA结合蛋白3在恶性黑素瘤及良性痣中的表达

目的 探讨胰岛素样生长因子Ⅱ mRNA结合蛋白3(IMP3)在良性痣及黑素瘤组织中的表达,及其在恶性黑素瘤进展及诊断中的作用.方法 用IMP3抗体对28例恶性黑素瘤、8例Spitz痣、6例发育不良性痣和25例良性痣患者的标本组织进行免疫组化研究.结果 28例恶性黑素瘤组织标本中23例IMP3阳性,8例Spitz痣中4例阳性,6例发育不良性痣中2例阳性,25例良性痣均不表达.IMP3在黑素瘤中的表达明显高于Spitz痣及发育不良性痣(P<0.05),侵袭性黑素瘤表达明显高于原位黑素瘤(P<0.01).结论 IMP3可能是良性痣发展至恶性黑素瘤的一个生物学标志,在鉴别黑素瘤和良性痣之间存在一定的价值.     

阿维A对HaCaT细胞体外凋亡和胰岛素样生长因子结合蛋白7及血管内皮生长因子表达的影响

目的 探讨阿维A对HaCaT细胞体外凋亡和胰岛素样生长因子结合蛋白7（IGFBP7）及血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。 方法 将10-5、10-6、10-7、10-8 mol/L的阿维A分别作用于HaCaT细胞24、48、72 h后,采用CCK8法检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测阿维A对HaCaT细胞凋亡率的影响;Western印迹和RT-PCR法检测阿维A对HaCaT细胞IGFBP7、VEGF蛋白及其mRNA表达的影响。 结果 10-8 mol/L阿维A处理HaCaT细胞48 h时表现出对细胞增殖的抑制作用,随着时间延长和药物浓度升高,抗增殖作用亦增强,当药物浓度增加到10-5 mol/L时,48 h和72 h的抑制率分别为39.94% ± 2.27%和49.77% ± 1.87%。与对照组相比,10-5 mol/L阿维A作用48 h后,凋亡率由1.803% ± 0.313%（对照组）上升至7.617% ± 0.767%（阿维A组）（P ＜ 0.05）,IGFBP7的表达由0.436 ± 0.013上升至0.939 ± 0.040（P ＜ 0.05）,IGFBP7 mRNA的表达由0.190 ± 0.056上升至0.872 ± 0.079（P ＜ 0.05）,VEGF的表达由0.798 ± 0.036下降至0.213 ± 0.032（P ＜ 0.05）,VEGF mRNA的表达由0.933 ± 0.054下降至0.274 ± 0.041（P ＜ 0.05）。 结论 阿维A可促进HaCaT细胞的体外凋亡,并可在蛋白及mRNA水平上调IGFBP7及下调VEGF的表达。     

5-氮杂-2-脱氧胞苷对系统性硬皮病皮损成纤维细胞胶原蛋白及相关抑制因子表达的影响

目的：探讨5-氮杂-2-脱氧胞苷对系统性硬皮病皮损成纤维细胞胶原蛋白及相关抑制因子表达的影响。方法：首先，体外培养建立疾病组和对照组皮肤成纤维细胞系。然后，采用实时定量RT—PCR技术，分别测定两组成纤维细胞Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、MBDI、MBD2、MeCP2、Kaiso等基因的表达水平。最后，观测5-氮杂-2-脱氧胞苷处理前后Col1α2、Smad7、MMP1等基因的表达水平。结果：与健康对照组比较，系统性硬皮病组皮损成纤维细胞Dnmt1、Col1α2表达增高，Smad7、MMP1表达减少（P〈0．05）。经5-氮杂-2-脱氧胞苷处理后，系统性硬皮病组皮损成纤维细胞异常表达的Col1α2降至正常水平，而Smad7、MMP1表达也恢复至正常范围。结论：Dnmt1等表观遗传机制可能参与了系统性硬皮病发病过程。5-氮杂-2-脱氧胞苷可能成为系统性硬皮病治疗的新选择。     

Celecoxib抑制人黑素瘤A375细胞增殖及对Cox-2/MMP-1蛋白表达的影响

目的研究Celecoxib(塞来考昔)对人黑素瘤A375细胞增殖抑制、凋亡诱导和周期阻滞作用及对A375细胞表达Cox-2和分泌型MMP-1蛋白的影响。方法MTT法测定Celecoxib对A375细胞的增殖抑制作用,流式细胞术检测药物诱导细胞凋亡及周期阻滞作用;细胞爬片SABC免疫细胞化学检测Celecoxib对A375细胞Cox-2蛋白表达的影响,ELISA法分析Celecoxib对A375细胞分泌型MMP-1蛋白表达的影响。结果80μmol/L的Celecoxib明显抑制人黑素瘤A375细胞增殖,并诱导凋亡(凋亡率35.91%)和G2/M期阻滞,减少A375细胞表达Cox-2蛋白和分泌型MMP-1蛋白。结论人黑素瘤A375细胞表达Cox-2蛋白和MMP-1蛋白,Celecoxib是一种有潜力的抑制黑素瘤增殖的药物。     

人黑素瘤细胞株IGFBP7基因启动子区CpG岛异常甲基化的研究

目的 探讨人黑素瘤细胞株和原代黑素细胞IGFBP7启动子区CpG岛甲基化状态与IGFBP7表达的关系。 方法 亚硫酸氢钠修饰后测序法检测4株人黑素瘤细胞和原代黑素细胞中IGFBP7基因启动子区CpG岛DNA甲基化状态。 结果 IGFBP7表达阴性的3个细胞株（A375、M14、SK-MEL-1）和表达阳性的2个细胞株（MV3及原代黑素细胞）的甲基化模式存在差异,聚类分析各自聚为一类。结论 IGFBP7基因启动子区CpG岛甲基化状态和基因表达有一定相关性。     

过表达表皮生长因子受体对人类黑素瘤脑转移瘤细胞系H1生长和转移的影响

目的 探索表皮生长因子受体（EGFR）在黑素瘤生长和转移过程中的作用。 方法 选用本实验室已建立的人黑素瘤脑转移瘤细胞系（H1）,通过慢病毒载体稳定转染野生型EGFR（H1EGFRwt）,使其呈EGFR过表达状态,对照组转染绿色荧光蛋白（H1GFP）后分选纯化。采用细胞划痕实验对实验组H1EGFRwt细胞和对照组H1GFP细胞的迁移能力进行分析,结果以划痕面积愈合率表示。采用集落形成实验观察EGFR对两组细胞独立生存能力和集落形成能力的影响,通过刃天青还原试验评估集落形成结果,结果以两组细胞活细胞数及其代谢活性评分表示。Western印迹分析EGFR激活的信号通路。采用SPSS 20.0软件进行重复测量的方差分析比较两组细胞划痕面积愈合率的差异,采用配对样本t检验比较两组细胞不同预处理的代谢评分差异。 结果 流式细胞仪检测显示,H1细胞EGFR和GFP转染成功,分选后得到了纯化H1EGFRwt和H1GFP细胞。细胞划痕实验显示,实验组H1EGFRwt在给予表皮生长因子（EGF）刺激的不同时间点（6、18、24、48 h）,划痕面积愈合率分别为0.145 ± 0.066、0.479 ± 0.096、0.571 ± 0.198、0.672 ± 0.199,对照组H1GFP在相同条件下分别为0.051 ± 0.036、0.254 ± 0.038、0.303 ± 0.077和0.498 ± 0.111, H1EGFRwt细胞的愈合程度均高于H1GFP细胞,两组比较,F = 68.49,df = 5,P < 0.05。集落形成实验证实,H1EGFRwt细胞的代谢评分（92 225.2 ± 6 632.1）高于H1GFP细胞（62 935.7 ± 8 159.2）,两组比较,t = 2.26,df = 9,P < 0.01。Western印迹结果显示,H1EGFRwt细胞可在EGF的刺激下激活下游信号磷酸化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C-γ（pPLCγ）、磷酸化信号转导和转录活化因子5（pSTAT 5）、磷酸化信号转导和转录活化因子3（pSTAT3）,而对照组未能激活。此外,H1EGFRwt细胞可在EGF刺激下使磷酸化丝/苏氨酸蛋白激酶（pAKT）和磷酸化有丝裂原活化蛋白激酶（pMAPK）表达明显高于对照组。 结论 EGFR在黑素瘤H1细胞的转移机制中发挥重要作用,并有可能成为黑素瘤转移治疗中的靶向目标。     

Regulation of vascular endothelial growth factor expression by insulin-like growth factor-II in human keratinocytes, differential involvement of mitogen-activated protein kinases and feedback inhibition of protein kinase C

BACKGROUND: Vascular endothelial growth factor (VEGF) is overexpressed in hyperproliferative diseases such as psoriasis and cancer, which are characterized by an increased angiogenesis. It was reported that insulin-like growth factor (IGF)-II is highly expressed during hepatocarcinogenesis and is increased in psoriatic lesions. The increase in IGF-II is believed to be associated with the pathogenesis of these diseases by increasing angiogenesis. OBJECTIVES: In order to investigate the relationship between IGF-II and angiogenesis-related VEGF, VEGF expression in the IGF-II-treated human keratinocytes was monitored and the IGF-II signalling pathways were examined with respect to VEGF expression. METHODS: Northern blot analysis for the VEGF mRNA levels and an enzyme-linked immunosorbent assay for the VEGF protein were performed to determine if IGF-II (100 ng mL(-1)) can increase the VEGF expression levels with or without a pretreatment with protein inhibitors in primary normal human keratinocytes and HaCaT cells. RESULTS: The mRNA and protein levels of VEGF by IGF-II were increased in a time-dependent manner and reached the maximum level 2 h and 8 h after the IGF-II treatment, respectively. However, this increase was abrogated by pretreatment with an extracellular signal-regulated kinase (ERK) inhibitor but not by a p38 inhibitor. The IGF-II-mediated VEGF induction was also effectively inhibited by a pretreatment with the tyrosine kinase inhibitor and Src inhibitor. The PI3-kinase inhibitor also inhibited the expression of VEGF by IGF-II. However, the phospholipase C (PLC) and protein kinase C (PKC) inhibitors did not block the increases of VEGF mRNA level and its protein level by IGF-II, and the PKC inhibitor instead increased VEGF expression by IGF-II. CONCLUSIONS: These results suggest that the tyrosine kinase-Src-ERK1/2 pathway and the PI3-kinase pathway are involved in IGF-II-mediated VEGF expression, but PKC is negatively associated in the IGF-II-mediated VEGF expression.     

STAT3和VEGF在皮肤黑素瘤中的作用及研究进展

信号转导和转录活化因子3是信号转导和转录活化因子家族的重要成员,参与调控相关靶基因表达,是多种致癌途径的焦点,其持续性激活能导致肿瘤的发生.信号转导和转录活化因子通过调节细胞凋亡抑制因子(Bc1-xL、Bc1-2、生存素)、细胞周期调节因子(细胞周期调节因子D1、细胞周期调节因子D2、原癌基因)以及血管生成诱导因子(血管内皮生长因子、环氧化酶-2、基质金属蛋白-9)等相关调控因子,在细胞增殖、存活、凋亡、分化及转移等过程中起作用.血管内皮生长因子是目前已知最重要的促血管生成因子之一,对肿瘤血管基质形成及肿瘤生物学行为均有重要影响,可作为肿瘤代谢及转移的标志.主要就信号转导和转录活化因子3、血管内皮生长因子及其相关调控基因在皮肤黑素瘤中发生、发展中所起的作用及其可能的机制做进一步阐述,以信号转导和转录活化因子3、血管内皮生长因子为靶点的联合治疗有望为皮肤黑素瘤的治疗提供新的思路.     

血管内皮细胞生长因子家族及其受体与表皮黑素瘤的关系

血管内皮细胞生长因子家族及其受体对表皮黑素瘤的主要作用有促黑素瘤细胞增殖,促内皮细胞增殖及新生血管形成,增加血管通透性,以及促黑素瘤相关淋巴管新生等.组织及血清血管内皮细胞生长因子水平对病情进展程度及疗效的判断及预后具有一定意义.近年来,以血管内皮细胞生长因子家族为靶点,采用各种方法抑制血管内皮细胞生长因子表达,阻断血管内皮细胞生长因子及其受体相互作用,抑制血管内皮细胞生长因子受体酪氨酸激酶活性,阻断信号转导,已显示出治疗表皮黑素瘤的巨大潜在价值.     

槲皮素对人黑素瘤A375细胞增生和凋亡的影响

目的探讨槲皮素对体外培养人黑素瘤A375细胞增生和凋亡的影响。方法 CCK8法检测0、20、40、80、160μmol/L浓度槲皮素作用于A375细胞24、48和72 h后细胞增生水平。用0、20、40、80、160μmol/L浓度槲皮素作用24 h后,以Annexin-V/PI法观察A375细胞凋亡,分别测定Caspase 3、Caspase 8和Caspase 9的活性,并以蛋白印迹法(Western blot)检测p53,Bax及Bcl-2的基因蛋白水平。结果与空白对照组比较,20、40、80、160μmol/L槲皮素作用24、48和72 h后均对A375细胞的增生有抑制作用,且有时间、浓度依赖性。0、20、40、80、160μmol/L槲皮素在作用24 h时,A375细胞早期凋亡率由(3.02±0.49)%分别上升至(11.20±1.68)%、(12.44±1.68)%、(24.55±0.58)%和(47.68±0.79)%,各组与对照组相比差异均有统计学意义(P0.05或0.01),80、160μmol/L作用组的Caspase 3,Caspase8,Caspase 9活性升高,且与对照组比较,差异均有统计学意义(P0.05或0.01)。p53及Bax的蛋白水平随药物浓度的增加而升高,Bcl-2的蛋白水平随药物浓度增加而降低。结论槲皮素对黑素瘤A375细胞具有抑制增生和诱导凋亡的作用,其作用机制可能与调节p53及Bcl-2/Bax基因有关。     

Influence of cultured dermal fibroblasts on human melanoma cell proliferation,matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) expression and invasion in vitro

The dermis is the main site of melanoma invasion. Matrix metalloproteinases (MMPs), especially MMP-2, produced by melanoma or surrounding stromal cells, are essential for the destruction of dermal extracellular matrix. Here, we examined how dermal fibroblasts influenced proliferation, MMP-2 secretion and invasion of human melanoma cell lines in vitro. Human melanoma cell lines M3 Da and M1Dor were cocultured with dermal fibroblasts under non-contact and contact conditions in order to assess both soluble and insoluble factors, respectively. Zymographic analysis showed that the levels of MMP-2 and TIMP-2 in melanoma cells were not altered in non-contact cocultures when compared with those in individual cultures. However, in contact cocultures, the expression of MMP-2 in membrane extracts was enhanced. Under our coculture conditions, dermal fibroblasts failed to upregulate melanoma cell invasion through a three-dimensional type I collagen matrix. Since stromal and cancer cell contacts have been shown to occur after disruption of the extracellular matrix, we hypothesized that fibroblasts may influence melanoma cell invasion after the beginning of tumor progression through the dermis.